미생물(배지 및 배양)

[김희중]

식품미생물 기초실습 1(배지조제 및 배양)

• 배지(culture medium)는 미생물이 필요로 하는 각종 영양소를 골고루 함유하는 물질이다.
• 미생물의 영양소에는 탄소원, 질소원, 비타민류, 무기염 등이 있다.
• 미생물의 종류와 성질에 따라 사용하는 배지의 조성은 각각 다르다.
• 곰팡이와 효모용 배지는 pH 5.0∼6.0, 세균용 배지는 pH 7.0∼8.0으로 조절하는 것이 좋다.
• 배지의 pH가 최적 pH에서 지나치게 벗어나면 미생물의 생육은 거의 중지된다.
• 조제된 배지는 건조나 변질을 막기 위하여 항상 빛이 들지 않는 찬 곳에 보존한다.
• 미생물은 생리적 성질과 이용 목적에 알맞는 조건에서 배양하여야 한다.
• 미생물은 순수하게 배양되어야 올바른 실험결과를 얻을 수 있다.

  1. 배지의 종류

(1) 배지 조성에 따라

• 천연배지(natural medium)
  • 배지 중의 영양분이 모두 천연물인 동식물체에서 얻어진 것으로 만든 배지
  • 화학조성이 복잡하고 명확하지 않음
• 합성배지(synthetic medium)
  • 모든 영양분의 화학조성이 명확한 것으로 만든 배지
  • 미생물 영양요구성 검토, 미생물정량법(bioassay) 등에 사용
• 반합성배지
  • 위의 두 가지 배지의 중간적인 것
  (2) 배지 상태에 따라
  
• 액체배지(liquid medium)
  • 미생물 생리실험, 대사산물 생산, 균체세포 생산 등의 목적에 사용
• 고체배지(solid medium)
  • 액체배지에 한천(agar), gelatine 등의 고화제를 첨가하여 응고시킨 것
  • 멸균 후 냉각, 고화시킬 때 목적에 따라 사면배지, 고층배지, 평판배지 등으로 만든다.
    • 사면배지(slant) : 호기성세균의 배양 및 보존에 사용
    • 고층배지(stab) : 젖산균 등의 미호기성균의 천자배양(stab culture)에 사용
    • 평판배지(plate) : colony를 형성시켜 미생물을 순수분리할 때 사용

  2. 사용기구 및 재료

• 기구 및 기기
  • pH meter, water bath, autoclave, 비이커, 삼각플라스크, 시험관, 페트리접시, 메스플라스크, 분주대
• 시약 및 재료
  • meat extract, peptone, NaCl, agar, 1N HCl, 1N NaOH, pH 시험지, 알미늄 호일, 황산지

  3. 실습내용 및 방법

• 육즙(bouillon) 배지 조제

  Meat extract 10g, peptone 10g, NaCl 5g을 칭량하여 비이커에 넣고 물 1ℓ를 가하여 잘 녹인다.
  pH 미터 또는 pH 시험지로 pH 7.0∼7.2로 조절한다.
  멸균한 500ml 솜마개 삼각플라스크에 100ml씩 분주한다.
  솜마개 부위에 알미늄 호일을 씌우고 autoclave에서 120℃, 15분간 고압증기멸균한다.

• 육즙한천(bouillon agar) 배지 조제

  미리 만들어 둔 육즙배지 100ml에 한천 1.5∼2.0g을 넣는다. 끓는 water bath 내에서 가열하여 한천을 녹인다.
  멸균 솜마개 시험관에 신속하게 분주한다. 배지가 솜마개에 묻으면 잡균 오염의 위험이 있으므로 주의한다.
  솜마개 부위에 알미늄 호일을 씌우고 autoclave에서 120℃, 15분간 고압증기멸균한다.
  사면배양에 사용할 것은 적당한 굵기의 유리봉에 눕여 응고시킨다. 평판 또는 천자배양에 사용할 것은 그대로 세워 응고시킨다.

• 육즙한천(bouillon agar) 평판배지 조제

  클린벤치 내에서 녹여 둔 육즙한천배지를 멸균 페트리접시에 주입한다.
  응고시킨 다음 항온기 내에서 전체를 뒤집어서 무균적으로 응축수를 건조시킨다.(15∼20분) 뚜껑을 다시 닫고 꺼내어 꺼꾸로 뒤집은 채로 보관한다.

  4. 배양 장치

1. 항온기(incubator, thermostat)
   • 미생물을 일정한 온도로 유지하여 배양하는 상자
   • 전기에 의해서 가열되고 thermostat에 의해 실온부터 60℃ 사이의 일정한 온도를 조절 유지
   • 실온보다 저온으로 온도를 조절하려면 냉각장치가 있는 저온항온기를 사용
2. 진탕배양기(shaking incubator)
   • 호기적인 배양에 이용
   • 회전식 진탕배양기(rotary shaker, 150∼300rpm), 왕복식 진탕배양기(reciprocating shaker, 120∼140rpm)
   • 배양용기를 진탕대 위에 고정시켜 진탕하면 배양액은 교반되면서 공기가 잘 섞이게 된다.
   • 진탕에 의해서 솜마개가 배양액에 젖어서 공기 등의 기체가 잘 통과할 수 없게 되고 잡균이 오염되기 쉬우므로 주의하여야 한다.
   • 회전식에는 삼각플라스크, 왕복식에는 Sakaguchi 플라스크 사용
3. Jar fermentor
   • 소형 발효조, 통기교반하면서 미생물을 배양하는 장치
   • 진탕배양기보다 대량으로 배양할 때 사용
   • 발효조(jar)는 내부를 쉽게 볼 수 있도록 원통 유리로 된 것이 많다.
   • 내부에는 교반기, foam breaker, 공기취입장치, baffle plate가 있다.
   • 바닥쪽에는 냉각수에 의한 냉각 jacket과 전열에 의한 가열장치가 있다.
   • 본체에는 미생물 접종구, 온도감응장치, pH 전극, 자동소포전극, 용존산소농도측정용 전극, 온도계, 산 및 알칼리 주입구, 소포제 주입구, 시료채취구, 배지 주입구, 배출구 등이 있다.
   • 배지내로 공기여과기를 통해서 얻는 무균공기가 sparker를 통해서 주입된다.
   • 발효조내의 온도, pH, 용존산소가 기록되는 기록계가 부착되고 온도 및 pH의 조절, 소포제의 주입 등이 자동적으로 이루어지는 제어장치가 있는 발효조는 조작 중 계속해서 감시할 필요가 없고 배양조건이 일정하게 유지되므로 관리하기 편리하다.

항온기(incubator)

진탕배양기(shaking incubator)

Jar fermentor

  5. 미생물 배양

1. 고체배양
       종균의 보존, 형태 및 생리의 관찰에 이용
   1) 사면배양(slant culture, streak culture)
   • 호기성균의 배양에 이용
   • 백금선으로 종균을 따서 사면 위에 아래쪽에서 위로 가볍게 직선 또는 지그재그로 선을 긋는다.
   • 세균, 효모는 백금이, 곰팡이, 버섯은 백금구를 사용하는 것이 편리

       사면배양
   

       반사면배양
   

   
   2) 천자배양(stab culture)
   • 혐기성균의 배양에 이용
   • 백금선 끝에 종균을 묻혀 한천고층배지의 시험관 주둥이를 아래로 하여 배지의 표면 중앙에서 내부로 향하여 찌른다.

       천자(고층)배양
   

   
   
2. 액체배양
       미생물의 생태 및 생리의 관찰, 발효 생산물의 시험, 균체를 대량으로 얻고자 하는 경우, 배양액 중에
       통기할 필요가 있을 경우 등에 이용
   1) 정치배양(stationary culture)
   • 호기성균은 배양용기의 크기에 비하여 내부의 배지량은 적게 하고 액층을 얕게 하여 산소공급이 잘 되도록 한다.
   • Fernbach flask나 Loo flask와 같이 액면이 넓게 되는 용기들이 편리하며 시험관을 사용할 때는 한천사면배지처럼 눕혀서 표면적을 넓게 만드는 것이 효과적이다.
   • 젖산균이나 낙산균 등의 혐기성균은 액층을 깊게 하고 일단 끓여서 사용하면 특별히 혐기적 상태로 하지 않아도 왕성하게 증식한다. 이 때 종균은 많은 양을 접종하는 것이 좋다.
   2) 진탕배양(shaking culture)
   • 호기성균을 보다 활발하게 증식시키기 위하여 액내에 많은 공기가 용해되도록 하는 배양법
   • 배지에의 산소용존속도는 진탕기의 회전속도, 진탕방법, 플라스크의 용적에 대한 배지량의 비율, 플라스크의 형태에 따라 달라진다.
   3) Jar fermentor에 의한 통기교반배양
   • 실험실에서 대량의 배지에 배양하려면 jar fermentor를 이용하여 통기교반배양을 한다.
   • Jar fermentor는 미생물의 배양조건을 연구 검토하는데 적합한 장치
   • 공업용 발효조와 구조, 통기 및 교반방법이 거의 같으므로 산업적인 생산을 위한 기술적인 자료를 얻는데 이용

  6. 미생물 분리 배양법

   1) 집식배양법

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   2) 획선배양법

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   3) 도말배양법

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   4) 혼화희석배양법