형광 NTA 분석을 이용한 EVs 내 핵산 카고의 검출

[With위드인스트루먼트]

형광 NTA 분석을 이용한 EVs 내 핵산 카고의 검출

Detection of nucleic acid cargo in EVs by using Fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis

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과거에는 세포외소포(EV)의 특성화가 주로 단백질과 지질에

초점을 맞췄지만[1-2], 현재는 EV 핵산 카고(Nucleic acid cargo) 연구에

대한 관심이 증가하고 있습니다.

형광 나노입자추적분석(F-NTA)을 사용하면 세포밖소포(EVs)로부터

세포막에 연결된 핵산(Membrane-associated nucleic acids)을

검출할 수 있습니다.

Figure 1. EV-Membrane-associated nucleic acids labeled with SYBR™ Gold. // SYBR™ Gold로 표지된 세포외소포 막 연결 핵산

이 실험에서는 변성 요소(Denaturing urea), 글리옥살(Glyoxal) 및

포름알데히드 겔(Formaledhyde gel)에서 DNA 및 RNA를 검출하기 위해

에디튬 브로마이드(Ethidum bromide)보다 >10배 이상 더 높은 감도를

보이는 핵산 염료(Dye)인 SYBR™ Gold(#S11494, Thermo

Fisher Scientific)를 사용했습니다[3].

실험의 특이성은 EV 관련 핵산(EV-associated nucleic acids)을

표지(Labeling) 한 후 특이적으로 분해하는 것을 목표로 하는

뉴클레아제(Nuclease) 제어에 의해 달성되었습니다.

그러나 본 실험에서는 Benzonase(#70746-3, Novagen)를

사용하여 DNA 분해와 RNA 분해를 구별할 수 없었습니다.

Figure 2. Particle size distribution of SYBR™ Gold labelled EVs incubated with and without a nuclease prior NTA measurement.

NTA 측정 전 뉴클레아제 유무에 관계없이 배양되고

SYBR™ Gold로 표지 된 세포외소포의 입자 크기 분포

Table 1: Summary of parameters and results of SYBR™ Gold labeled EVs incubated with and without nuclease.

뉴클레아제 유무에 관계없이 배양된 SYBR™ Gold 라벨 EV의 매개 변수 및

결과 요약 (신규 소프트웨어 사용, ZetaNavigator Software)

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결론

Benzonase와 함께 배양한 후 형광 신호가 감소한 것으로 보아

SYBR™ Gold가 F-NTA에 의한 핵산 검출을 위한

특이적인 염료로 사용될 수 있음을 보여줍니다.

뉴클레어제(Nuclease) 처리 후 남아있는 SYBR™ Gold 신호는

분해될 수 없는 EV 내강(Lumen)의 핵산 때문인 것으로 추정할 수 있습니다.

따라서, SYBR™-Gold 활성화 핵산 검출은 뉴클레아제 처리로 인한

막 결합 핵산의 선택적 측정에 사용될 수 있습니다.

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​References (참고 자료)

1. Lötvall et al.:

Minimal experimental requirements for definition of

extracellular vesicles and their functions: a position statement

from the International Society for Extracellular Vesicles

J Extracell Vesicles 2014; Dec 22:3:26913

2. Théry et al.:

Minimal information for studies of extracellular vesicles

2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for

Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines

J Extracell Vesicles 2018; Nov 23;7(1):1535750

3. Truma et al.:

Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain:

a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators

Anal Biochem 1999; Mar 15;268(2):278-88