침 치료 연구의 혁명.. 오믹스, 대사체학 .. 2016 nature!!

[문형철]

https://www.nature.com/articles/srep19942

침치료 탐구에 혁명이 시작되고 있었구나!!

이렇게 간단하게 침 치료 효과를 검증할 수 있다니!!

족삼리에 침을 놓고

대사체학 탐구.. 어떤 대사가 바뀌었는지? 그 경로는 무엇인지? 

한약탐구

발효한약, 발효물질 탐구에도

혁명이 일어날거 같다!!

건생병사후 대사체학 연구로 어떤 대사가, 어떤 경로에 의해 변화하는지 탐구할 수 있다!!

의학 혁명이 일어나고 있다. 

현대의학의 아성은 서서히 균열이 일고 있는듯하다!!

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Deciphering the biological effects of acupuncture treatment modulating multiple metabolism pathways

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• Published: 16 February 2016

Deciphering the biological effects of acupuncture treatment modulating multiple metabolism pathways

• Aihua Zhang, 
• Guangli Yan, 
• Hui Sun, 
• Weiping Cheng, 
• Xiangcai Meng, 
• Li Liu, 
• Ning Xie & 
• Xijun Wang 

Scientific Reports volume 6, Article number: 19942 (2016) Cite this article

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Abstract

Acupuncture is an alternative therapy that is widely used to treat various diseases. However, detailed biological interpretation of the acupuncture stimulations is limited. We here used metabolomics and proteomics technology, thereby identifying the serum small molecular metabolites into the effect and mechanism pathways of standardized acupuncture treatments at ‘Zusanli’ acupoint which was the most often used acupoint in previous reports. Comprehensive overview of serum metabolic profiles during acupuncture stimulation was investigated. Thirty-four differential metabolites were identified in serum metabolome and associated with ten metabolism pathways. Importantly, we have found that high impact glycerophospholipid metabolism, fatty acid metabolism, ether lipid metabolism were acutely perturbed by acupuncture stimulation. As such, these alterations may be useful to clarify the biological mechanism of acupuncture stimulation. A series of differentially expressed proteins were identified and such effects of acupuncture stimulation were found to play a role in transport, enzymatic activity, signaling pathway or receptor interaction. Pathway analysis further revealed that most of these proteins were found to play a pivotal role in the regulation of multiple metabolism pathways. It demonstrated that the metabolomics coupled with proteomics as a powerful approach for potential applications in understanding the biological effects of acupuncture stimulation.

침술은 다양한 질환의 치료에 널리 사용되는 대체 치료법입니다.

그러나 침술 자극의 생물학적 메커니즘에 대한 상세한 해석은 제한적입니다.

본 연구에서는 대사체학 및 단백체학 기술을 활용하여

표준화된 침술 치료 시 ‘Zusanli’ 경혈(이전 연구에서 가장 자주 사용된 경혈)에 대한

혈청 소분자 대사체 프로파일을 분석하고,

그 효과 및 메커니즘 경로와의 연관성을 규명했습니다.

침술 자극 중 혈청 대사 프로파일의 종합적인 분석을

수행했습니다.

혈청 대사체에서 34개의 차등 대사체가 식별되었으며,

이는 10개의 대사 경로와 연관되었습니다.

특히,

고영향 글리세로포스파티드 대사, 지방산 대사, 에테르 지질 대사가

침술 자극에 의해 급격히 변화되었습니다.

이러한 변화는

침술 자극의 생물학적 메커니즘을 규명하는 데 유용할 수 있습니다.

차이 표현 단백질의 일련이 식별되었으며,

이러한 침술 자극의 효과는

운반, 효소 활성, 신호 전달 경로 또는 수용체 상호작용에 역할을 하는 것으로 나타났습니다.

경로 분석은

이러한 단백질의 대부분이 다중 대사 경로의 조절에

핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다.

이는 대사체학과 단백체학을 결합한 접근법이

침술 자극의 생물학적 효과를 이해하는 데 잠재적 응용 가능성을 보여줍니다.

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Introduction

Acupuncture, which utilizes fine needles to pierce through specific anatomical points (called ‘acupoints’), is an ancient traditional Chinese medicine (TCM) therapy1. Therapeutic effects of acupoint stimulation primarily work through 14 principal meridians2. Nowadays, this traditional technique has become very popular worldwide as a complementary medicine3,4. It has been widely used to reduce some symptoms or to treat diseases in clinical practice5,6,7. Human studies have found a physiological basis for acupuncture needling that involves both central and peripheral networks8. However, it remains insufficient, we still lack a clear picture of ‘how acupuncture works’ and the challenge is therefore to clarify the true meaning. We have to understand the acupuncture and present it in the light of the 21st century scientific thoughts and experimental evidence.

Omics technologies, including proteomics and metabolomics, have been successfully applied to screen for biomarkers in biological fluids for diseases. They are key technology that serves as the major driving force for translation of acupuncture medicine revolution into practice9. Recent advances in systems biology technology has enabled the discovery of biomarkers and potentially offered ‘the right therapy for the right patient’10. Specifically, high-throughput proteomics and metabolomics have been able to identify potential candidates for the effects of acupuncture11,12. A large number of differentially expressed proteins have been identified and reported as potential biomarkers for the diagnosis and prognosis of several different diseases. The isobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ) technique is one of the most widely used approaches in proteomics13. Proteomics may help us better understand the changes of multiple proteins involved in the molecular mechanism of acupuncture. Metabolomics aims to reveal various metabolic characteristics of external or internal perturbations to biological systems by profiling low-molecular-weight metabolites in biological samples14. Metabonomics and acupuncturology are of some similar characteristics such as entirety, comprehensiveness and dynamic changes and might be a promising method to investigate the molecular mechanism of acupuncture15,16. Thus, integrative multi-omics analysis will enable a revolution in our in-depth understanding of acupuncture treatment for a variety of diseases.

Acupuncture is a non-pharmacological therapy in which needles are inserted at specific acupoints of the body17. In the context of previous literature, Zhang and co-workers used metabolomics analysis to investigate the saliva metabolite biomarkers for acupuncture treatment at ‘Zusanli’ acupoint as a case study18. They have identified 26 differential metabolites and found that the phenylalanine metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism, d-glutamine and d-glutamate metabolism and steroid hormone biosynthesis pathways were acutely perturbed. The network construction has led to the integration of metabolites associated with the multiple perturbation pathways. Yan et al. used high-throughput urine metabolic profiling dissects the biological property of acupuncture point Zusanli based on long-term treatment. The top canonical pathways include alpha-linolenic acid metabolism, d-glutamine and d-glutamate metabolism, citrate cycle, alanine, aspartate and glutamate metabolism and vitamin B6 metabolism pathways19. However, acupuncture stimulation modulates metabolism pathways in human serum has yet to be investigated. More work needs to be performed to explore the molecular mechanisms underlying acupuncture and this could lead to novel treatments to maximize the therapeutic benefits of acupuncture. Several studies have reported the Zusanli (also known as ST-36) point is commonly used in human to treat a wide range of diseases including gastrointestinal disorders and others20,21,22. However, its underlying biological mechanism remains poorly understood. We here present a large-scale study in which we combine a quantitative proteomic discovery strategy using iTRAQ and an ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadruple time-of-flight mass spectrometry (UPLC/ESI-Q-TOF/MS)-based metabolomics approach to examine whether acupuncture stimulation at the Zusanli acupoint modulates metabolism pathways in human.

침술은 미세한 바늘을 사용하여 특정 해부학적 지점(‘경혈’)을 찌르는 고대 중국 전통 의학(TCM) 치료법입니다1. 경혈 자극의 치료 효과는 주로 14개의 주요 경락2를 통해 작용합니다. 오늘날 이 전통적인 기술은 보완 의학으로 전 세계적으로 큰 인기를 끌고 있습니다3,4. 임상 실무에서 일부 증상 완화나 질병 치료에 널리 사용되어 왔습니다5,6,7. 인간 연구는 침술 침술의 생리학적 근거를 중추 및 말초 신경망 모두에 걸쳐 발견했습니다8. 그러나 여전히 불충분하며, '침술이 어떻게 작용하는지'에 대한 명확한 그림이 부족합니다. 따라서 진정한 의미를 명확히 하는 것이 과제입니다. 우리는 침술을 이해하고 21세기 과학적 사고와 실험적 증거를 바탕으로 제시해야 합니다.

프로테오믹스와 메타볼로믹스를 포함한 오믹스 기술은

질병의 생물학적 체액에서 바이오마커를 선별하는 데 성공적으로 적용되었습니다.

이들은

침술 의학 혁명을 임상 현장으로 전환하는

주요 동력으로 작용하는 핵심 기술입니다9.

시스템 생물학 기술의 최근 발전은

바이오마커의 발견을 가능하게 했으며,

'적절한 환자에게 적절한 치료법'을 제공할 잠재력을 제시했습니다10.

특히,

고효율 프로테오믹스와 대사체학은

침술의 효과를 평가하기 위한 잠재적 후보 물질을 식별하는 데 성공했습니다11,12.

다양한 질병의 진단과 예후를 위한

잠재적 바이오마커로 식별되고 보고된 차등 발현 단백질들이

다수 존재합니다.

이소바릭 태그를 이용한 상대적 및 절대적 정량화(iTRAQ) 기술은

프로테오믹스 분야에서 가장 널리 사용되는 접근법 중 하나입니다13.

프로테오믹스는

침술의 분자 메커니즘에 관여하는

다중 단백질의 변화를 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

대사체학은

생물학적 시료에서 저분자량 대사물을 프로파일링하여

생물학적 시스템에 대한 외부 또는 내부 교란의 다양한 대사적 특성을 밝히는 것을 목표로 합니다14.

메타보노믹스와 침술학은

전체성, 포괄성, 동적 변화 등 일부 유사한 특성을 공유하며,

침술의 분자적 메커니즘을 조사하는 유망한 방법일 수 있습니다15,16.

따라서

통합적 다중 오믹스 분석은

다양한 질환에 대한 침술 치료의 심층적 이해에 혁명을 가져올 것입니다.

침술은

신체 특정 경혈점에 침을 삽입하는 비약물적 치료법입니다17.

기존 문헌에서

Zhang과 동료들은 ‘Zusanli’ 경혈점에서의 침술 치료를 사례 연구로 삼아

침술 치료의 타액 대사체 바이오마커를 대사체학 분석을 통해 조사했습니다18.

그들은 26개의 차등 대사물을 식별했으며,

페닐알라닌 대사, 알라닌, 아스파르트산 및 글루타메이트 대사,

D-글루타민 및 D-글루타메이트 대사, 스테로이드 호르몬 생합성 경로가

급격히 교란되었음을 발견했습니다.

The top canonical pathways include

alpha-linolenic acid metabolism,

d-glutamine and d-glutamate metabolism,

citrate cycle,

alanine, aspartate and glutamate metabolism and

vitamin B6 metabolism pathways

알파-리놀렌산(ALA, 18:3n-3)은 18개의 탄소 원자와 3개의 시스 이중 결합으로 구성된 카르복시산으로, 인체에 필수적인 필수 지방산입니다. 본 연구는 ALA의 식이 원천, 대사 과정, 약리학적 효과에 관한 관련 연구를 체계적으로 검토하는 것을 목적으로 합니다. ALA에 대한 정보는 PubMed, Elsevier, ResearchGate, Web of Science, Wiley Online Library, Europe PMC 등 인터넷 데이터베이스에서 “약리학”, ‘대사’, “원천” 등 키워드를 조합하여 수집되었습니다. 주요 내용은 다음과 같습니다. (a) ALA는 식품을 통해 섭취될 수 있으며, 체내에서 이코사펜타엔산과 도코사헥사엔산으로 전환됩니다. (b) 이 전환 과정은 상대적으로 제한적이며 용량, 성별, 질병 등 다양한 요인의 영향을 받습니다. (c) 약리학 연구 결과, ALA는 대사증후군 억제, 항암, 항염증, 항산화, 항비만, 신경 보호, 장내 미생물 조절 등 다양한 약리학적 특성을 가지고 있습니다. (d) ALA의 대사증후군 억제 효과를 입증한 연구가 가장 많으며, 실험 연구와 임상 시험을 포함합니다. (e) ALA의 치료 효과는 용량에 따라 달라집니다. 요약하자면, ALA는 다양한 질환의 치료에 기대를 모으고 있지만, ALA의 임상적 효능을 확고히 입증하기 위해서는 추가적인 고품질 연구가 필요합니다.

네트워크 구축을 통해

다중 교란 경로와 관련된 대사물들이 통합되었습니다.

Yan et al.은

장기 치료를 기반으로 침술 점 Zusanli의 생물학적 특성을 분석하기 위해

고효율 소변 대사 프로파일링을 사용했습니다.

주요 캐노니컬 경로는

알파-리놀렌산 대사,

D-글루타민 및 D-글루타메이트 대사,

시트르산 회로, 알라닌, 아스파르트산 및 글루타메이트 대사,

비타민 B6 대사 경로입니다19.

그러나 침술 자극이 인간 혈청의 대사 경로를 조절하는 메커니즘은 아직 연구되지 않았습니다. 추가 연구가 필요하며, 이는 침술의 치료 효과를 극대화하기 위한 새로운 치료법을 개발하는 데 기여할 수 있습니다. 여러 연구에서 Zusanli(ST-36) 점이 위장 장애를 포함한 다양한 질환 치료에 널리 사용된다는 보고가 있습니다20,21,22. 그러나 그 생물학적 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.

본 연구에서는

iTRAQ를 활용한 정량적 프로테오믹스 탐색 전략과

초고성능 액체 크로마토그래피/전기분사 이온화 쿼드러플 타임-오브-플라이트 질량 분석법(UPLC/ESI-Q-TOF/MS) 기반

대사체학 접근법을 결합한 대규모 연구를 통해,

Zusanli 경혈에 대한 침술 자극이 인간에서 대사 경로를 조절하는지 조사했습니다.

Results

Trajectory and metabolic profling analysis

Typically, the trajectory analysis of principal components analysis (PCA) score plots for the acupuncture treatment can really reflect the differences between the 0 day and the 14th day and showed metabolic profiles in the different days were separated clearly (Fig. 1). PCA plot of the various group show similar behavior during the early stage of the experiment, but then gradually deviated from one another, on day 14 reached the maximum trend. The tracks of the metabolic profiles also clearly demonstrate the time dependent changes in the urine metabolites. For UPLC/ESI-Q-TOF/MS analysis, aliquots were separated using a Waters Acquity UPLC (Waters, Millford, MA) and analyzed using a quadruple time-of-flight mass spectrometry, which consisted of an electrospray ionization source and linear ion-trap mass analyzer. UPLC-MS BPI serum chromatograms of acupuncture-treated human in positive mode and negative mode showed stable retention time with no drift in all of the peaks, demonstrating the robustness of our analytical method (Fig. 2A). Low molecular mass metabolites could be separated well in the short time of 11 min due to the minor particles (sub-1.7 um). According to the optimized conditions of urine analysis, principal component analysis of quality control samples from liver injury rats was shown in Fig. S1, quality control samples were gathered together to determine during the data collection, demonstrating that the system had excellent stability during the analysis procedure.

경로 및 대사 프로파일링 분석

일반적으로 침 치료의 주성분 분석(PCA) 점수 플롯에 대한 궤적 분석은 0일과 14일 사이의 차이를 명확히 반영하며, 다양한 날짜의 대사 프로파일은 명확히 구분되었습니다(그림 1). 다양한 그룹의 PCA 플롯은 실험 초기 단계에서 유사한 행동을 보이지만, 점차 서로 다른 방향으로 벗어나며 14일에 최대 추세를 달성했습니다. 대사 프로파일의 궤적은 소변 대사물의 시간 의존적 변화를 명확히 보여줍니다. UPLC/ESI-Q-TOF/MS 분석을 위해 시료는 Waters Acquity UPLC(Waters, Millford, MA)를 사용하여 분리되었으며, 전기분사 이온화 소스와 선형 이온 트랩 질량 분석기로 구성된 쿼드러플 시간 비행 질량 분광계로 분석되었습니다. UPLC-MS BPI 혈청 크로마토그램은 양극성 모드와 음극성 모드에서 침술 치료를 받은 인간의 모든 피크에서 안정적인 유지 시간을 보여주며, 분석 방법의 신뢰성을 입증했습니다 (Fig. 2A). 저분자량 대사산물은 11분이라는 짧은 시간 내에 잘 분리되었으며, 이는 1.7μm 미만의 미세 입자 때문이었습니다. 소변 분석의 최적화된 조건에 따라 간 손상 쥐의 품질 관리 샘플에 대한 주성분 분석은 Fig. S1에 표시되었으며, 데이터 수집 과정에서 품질 관리 샘플을 함께 수집하여 분석 절차 동안 시스템이 우수한 안정성을 보였음을 보여주었습니다.

Figure 1

Trajectory analysis of PCA Score plots for the acupuncture treatment.

(△: the 1st day; □: the 3rd day; *: the 5th day; ●: the 7th day; +: the 9th day; ○: the 11th day; ▽: the 13th day; ▲: the 14th day).

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Figure 2

Metabolic profling characterization and pattern recognition analysis.

(A) UPLC-MS BPI serum chromatograms of acupuncture-treated human in positive mode (a, 0 day; b, 14 day) and negative mode (c, 0 day; d, 14 day); (B) PCA score plot for control and acupuncture-treated group in positive mode; (C) Trajectory analysis of PCA score plots (3-D) for the serum samples in negative mode.

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Pattern recognition analysis and screening of the metabolite markers

Both multivariate projection approaches often can be taken, because of their ability to cope with highly multivariate, noisy, collinear and possibly incomplete data. A PLS-DA model was established to eval‎uate the systemic changes in the metabolome of acupuncture group. The PCA score plots showed that the metabolic profiles of the 0 and 14 day significantly changed as a result of acupuncture-treated (Figs 1C and 2B), indicating that serum biochemical perturbation significantly happened in the acupuncture group. From the corresponding loading plot (Figs 2B and 3A), the variables (ions) far away from the origin contribute significantly to this model. The ions that showed significant difference in abundance between the 0 day and 14 day treated human were contributed to the observed separation and selected from the respective S-plots as potential markers in positive and negative mode (Figs. 2C and 3C). Overall 6197 retention time-exact mass pairs were determined in metabolomic profile of serum samples. To screen the statistically important variables (ions) related to acupuncture, a strategy combining VIP and two-tailed Student’s t-test was used. 34 variables with the VIP-value larger than 1.0 and p-value less than 0.05 were selected and considered as potential markers representing the metabolic characteristics of acupuncture. Finally, the markers of significant contribution were identified 34 ions (20 in the positive mode, 14 in the negative mode) as differentiating metabolites. From the above plots, various metabolites could be identified as being responsible for the separation between 0 day and 14 day groups and were therefore viewed as potential biomarkers.

대사체 마커의 패턴 인식 분석 및 선별

다변량 투영 접근법은 고차원적, 잡음이 많고, 다중공선성이 있으며, 불완전한 데이터에 대응할 수 있는 능력 때문에 두 가지 모두 자주 사용됩니다. 침술 그룹의 대사체 변화 평가를 위해 PLS-DA 모델이 구축되었습니다. PCA 점수 플롯은 침술 치료 후 0일과 14일 간의 대사 프로파일 차이가 유의미하게 변화했음을 보여주었습니다(그림 1C 및 2B), 이는 침술 그룹에서 혈청 생화학적 교란이 유의미하게 발생했음을 나타냅니다. 해당 로딩 플롯(그림 2B 및 3A)에서 원점으로부터 멀리 떨어진 변수(이온)가 이 모델에 크게 기여했습니다. 0일과 14일 치료된 인간에서 농도 차이가 유의미한 이온은 관찰된 분리 현상에 기여했으며, 각각의 S-플롯에서 양의 모드와 음의 모드에서 잠재적 마커로 선정되었습니다(그림 2C 및 3C). 혈청 샘플의 대사체 프로파일에서 총 6,197개의 유지 시간-정확한 질량 쌍이 결정되었습니다. 침술과 관련된 통계적으로 중요한 변수(이온)를 선별하기 위해 VIP와 양측 Student's t-검정을 결합한 전략이 사용되었습니다. VIP 값이 1.0보다 크고 p-값이 0.05보다 작은 34개의 변수가 선택되어 침술의 대사적 특성을 대표하는 잠재적 마커로 고려되었습니다. 최종적으로, 0일과 14일 그룹 간의 차이를 구분하는 차별화 대사체로 34개 이온(양성 모드 20개, 음성 모드 14개)이 식별되었습니다. 위의 그래프에서 다양한 대사체가 0일과 14일 그룹 간의 분리를 담당하는 것으로 확인되었으며, 따라서 잠재적 바이오마커로 간주되었습니다.

Figure 3

The screening of the metabolite markers.

(A) PLS loading plot results for 0 day and 14 day in positive mode; (B) VIP-plot of OPLS-DA of samples in positive mode; (C) PLS loading plot results for 0 day and 14 day in negative mode; (D) VIP-plot of OPLS-DA of samples in negative mode.

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Identification of important differential metabolites

Robust UPLC/ESI-Q-TOF/MS provides the retention time, precise molecular mass and MS/MS data for the structural identification of metabolites. Structure identification of the significant metabolites was performed according to their molecular ion masses and MS/MS product ion analysis comparing with authentic standards or database resources. The potential elemental composition, degree of unsaturation and fractional isotope abundance of compounds were also obtained. Here we take LysoPE(P-16:0/0:0) in negative mode (with the M-H− molecular ion peak at m/z 436.222) as an example to illustrate our metabolite identification strategy. According to its accurate mass, C21H44NO6P was calculated as the most possible molecular formula by EZinfo 2.0 software. Then, from its tandem MS/MS spectra, the major fragment ions were illustrated in Fig. 4A. Then, the above information was searched and matched in databases of HMDB (http://www.hmdb.ca), METLIN (http://metlin.scripps.edu) and KEGG (http://www.kegg.jp). Finally, this ion of m/z 436.222 was validated by a standard compound and identified as LysoPE(P-16:0/0:0). According to the protocol detailed above, a total of 34 endogenous metabolites were finally identified as markers and listed in Supplementary Table 2.

중요한 차등 대사체 식별

강력한 UPLC/ESI-Q-TOF/MS는 대사체의 구조적 식별을 위해 유지 시간, 정확한 분자량 및 MS/MS 데이터를 제공합니다. 중요한 대사체의 구조 식별은 분자 이온 질량과 MS/MS 제품 이온 분석을 통해 표준 물질 또는 데이터베이스 자원과 비교하여 수행되었습니다. 화합물의 잠재적 원소 구성, 불포화도 및 분수 동위 원소 풍부도도 얻어졌습니다. 여기서는 음이온 모드에서 M-H− 분자 이온 피크가 m/z 436.222에 위치한 LysoPE(P-16:0/0:0)를 예시로 삼아 대사체 식별 전략을 설명합니다. 정확한 질량에 따라 EZinfo 2.0 소프트웨어를 사용하여 C21H44NO6P가 가장 가능성이 높은 분자식으로 계산되었습니다. 그 다음, tandem MS/MS 스펙트럼에서 주요 분해 이온은 Fig. 4A에 표시되었습니다. 이후, 위 정보는 HMDB (http://www.hmdb.ca), METLIN (http://metlin.scripps.edu) 및 KEGG (http://www.kegg.jp) 데이터베이스에서 검색 및 일치되었습니다.

최종적으로,

m/z 436.222의 이 이온은 표준 화합물로 검증되어 LysoPE(P-16:0/0:0)로 확인되었습니다.

위에서 설명된 프로토콜에 따라,

총 34개의 내인성 대사물이 마커로 최종 확인되어 

보충 표 2에 목록으로 정리되었습니다.

Figure 4

Identification of the important differential metabolites.

(A) Mass fragment information of LysoPE(P-16:0/0:0) in negative mode. (B) Construction of the metabolism pathways in acupuncture-treated human. The map was generated using the reference map by KEGG (http://www.genome.jp/kegg/). The green boxes: enzymatic activities with putative cases of analogy in acupuncture-treated human. 1, glycerophospholipid metabolism; 2, ether lipid metabolism; 3, fatty acid metabolism; 4, glycerolipid metabolism; 5, porphyrin metabolism; 6, sphingolipid metabolism; 7, primary bile acid biosynthesis; 8, fatty acid elongation in mitochondria; 9, fatty acid biosynthesis; 10, tryptophan metabolism.

중요한 차등 대사체 식별.

(A) LysoPE(P-16:0/0:0)의 음이온 모드에서 얻어진 질량 분해 정보. 

(B) 침 치료를 받은 인간에서의 대사 경로 구축. 

이 지도는 KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)의 참조 지도를 기반으로 생성되었습니다. 

녹색 상자: 침 치료를 받은 인간에서 유사 사례가 추정되는 효소 활성. 

1, 글리세로포스파티드 대사; 

2, 에테르 지질 대사; 

3, 지방산 대사; 

4, 글리세로지질 대사; 

5, 포르피린 대사; 

6, 스핑고지질 대사; 

7, 주요 담즙산 생합성; 

8, 미토콘드리아 내 지방산 연장; 

9, 지방산 생합성; 

10, 트립토판 대사.

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Pathway enrichment analysis

Based on the identified metabolite markers, a metabolic pathway analysis facilitating further biological interpretation was performed using MetPA (Metabolomics Pathway Analysis) to reveal the most relevant pathways involved in acupuncture on ST-36. It was shown that metabolite markers were mainly involved in the following pathways: 1, glycerophospholipid metabolism; 2, ether lipid metabolism; 3, fatty acid metabolism; 4, glycerolipid metabolism; 5, porphyrin metabolism; 6, sphingolipid metabolism; 7, primary bile acid biosynthesis metabolism (Fig. 4B and Supplementary Table 3). Acupuncture triggers dynamic changes in metabolic biomarkers were shown in Fig. 4C. The significantly changed metabolites have been found and used to explain the metabolic pathway. Results suggested that these pathways showed the marked perturbations over the entire time-course of acupuncture-treated and we found that glycerophospholipid metabolism, ether lipid metabolism, fatty acid metabolism (Impact >0.02) were acutely perturbed by acupuncture stimulation.

대사 경로 풍부도 분석

식별된 대사체 마커를 기반으로,

침술이 ST-36(족삼리)에 미치는 영향을 이해하기 위해 추가적인 생물학적 해석을 용이하게 하는

대사 경로 분석을 MetPA (Metabolomics Pathway Analysis)를 사용하여 수행했습니다.

이 분석을 통해 침술이

ST-36에 미치는 영향과 관련된 가장 관련성이 높은 대사 경로가 밝혀졌습니다.

대사체 마커는 주로 다음과 같은 경로에 관여하는 것으로 나타났습니다:

1, 글리세로포스파티드 대사;

2, 에테르 지질 대사;

3, 지방산 대사;

4, 글리세로지질 대사;

5, 포르피린 대사;

6, 스핑고지질 대사;

7, 주요 담즙산 생합성 대사 (그림 4B 및 보충 표 3).

침술이 대사 생물표지자의 동적 변화를 유발한다는 것은 그림 4C에 보여졌습니다.

유의미하게 변화한 대사체들이 발견되었으며, 이를 통해 대사 경로를 설명하는 데 사용되었습니다. 결과는 이러한 경로들이 침술 치료 전체 기간 동안 명확한 교란을 보였으며, 특히 글리세로포스파티드 대사, 에테르 지질 대사, 지방산 대사(영향도 >0.02)가 침술 자극에 의해 급성적으로 교란되었음을 확인했습니다.

Identification of proteome by iTRAQ analysis

To further investigate the effects of acupuncture treatment at ST-36, we used iTRAQ to generate the protein expression‎ profiles. Protein changes of magnitude 1.2-fold or more were considered for further investigation. Using a cutoff of 1.2-fold change and a p-value less than 0.01, total 199 proteins were shown to have significantly different abundance between 0 and 14 days. We found 93 and 106 target proteins were up-regulated and down-regulated, respectively and that were highly specific to the acupuncture treatment (Supplementary Table 4). It showed the proteins identified, including the name, accession number, score, coverage, molecular weight, PI and protein expression‎ ratio. Among them, the significance of the 22 proteins with score >1000 would be interesting topic for our future studies.

Functional analysis of differentially expressed proteins

It is better and easier to understand the function and regulation of the differentially expressed proteins by bioinformatics analysis. The final selected differentially expressed proteins were analyzed using the GO database to determine their molecular function and participation in biological processes. In the molecular function analysis, most of these proteins were found to play a role in transport, enzymatic activity, signaling pathway or receptor interaction, suggested that the proteins in these functional categories were highly expressed and may be active during the acupuncture treatment condition. These differentially expressed proteins may be related to several metabolic pathways, including carbohydrate digestion and absorption, protein digestion and absorption, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, fructose and mannose metabolism, complement and coagulation cascades etc. Based on the number of unique proteins identified, the most interesting functional categories were “gastric acid secretion” and “pancreatic secretion”, representing 2.53% and 6.33% of all the protein identified, respectively. The result would facilitate the understanding that ST-36 point is commonly used in human acupuncture to treat gastrointestinal disorders.

Gastric acid is a key factor in normal upper gastrointestinal functions, including protein digestion and calcium and iron absorption, as well as providing some protection against bacterial infections21. Stimulation of acid secretion typically involves an initial elevation of intracellular calcium and cAMP, followed by activation of protein kinase cascades, which trigger the translocation of the proton pump, H+ -K+ -ATPase, from cytoplasmic tubulovesicles to the apical serum membrane and thereby H+ secretion into the stomach lumen. The pancreas performs both exocrine and endocrine functions22. The exocrine pancreas consists of two parts, the acinar and duct cells. The primary functions of pancreatic acinar cells are to synthesize and secrete digestive enzymes. The major task of pancreatic duct cells is the secretion of fluid and bicarbonate ions (HCO3−), which neutralize the acidity of gastric contents that enter the duodenum. An increase in intracellular cAMP by secretin is one of the major signals of pancreatic HCO3− secretion.

To better understand at the proteomic level, the molecular mechanisms and relevant pathways that underlie acupuncture point function, we employed a proteomics strategy to perform functional enrichment analysis, with a special focus on the changes in the biological process after acupuncture treatment. We found 22 target proteins that were highly specific to the acupuncture. The detection of these proteins with distinct regulatory patterns provides evidence that novel biomarkers are actively involved in multifunctional pathways that are likely essential for acupuncture. The biological functions of these critical proteins can be sorted into five groups: (A) generation and degradation of the extracellular matrix, including fibronectin 1, fibrinogen gamma chain isoform CRA_o and fibrinogen gamma chain isoform CRA_a; (B) the regulation of transcription and translation, as provided by phospholipid transfer protein; (C) acute phase reaction and immunity protection, as provided by immunoglobulin heavy chain constant region mu, immunoglobulin kappa light chain VLJ region, immunoglobulin kappa light chain variable region, Ig gamma3 heavy chain; (D) oxygenation and cell apoptosis, to which anti-pneumococcal antibody 57E2 light chain contributes; and (E) transport and metabolism, as provided by apolipoprotein A-II, apolipoprotein C-II, apolipoprotein B-100 precursor, apolipoprotein B variant, tubulin alpha-4A chain. The characteristic functions of these differentially expressed proteins were enriched within clusters that were based on biological processes such as “immunity”, “cellular apoptosis”, “transport”, “signal transduction” and “metabolism”. These proteins may therefore be considered candidates for the further investigation of biological mechanism of acupuncture point function. To reveal the associated with signal transduction pathways and/or signaling networks, the differentially expressed proteins were imported into the integrated molecular pathway level analysis (IMPaLA, http://impala.molgen.mpg.de/) tool. It revealed that proteins which were identified together are important for the host response to acupuncture point function.

iTRAQ 분석을 통한 프로테옴 식별

ST-36에서의 침 치료 효과를 추가로 조사하기 위해 iTRAQ를 사용하여 단백질 발현 프로파일을 생성했습니다. 1.2배 이상의 변화 폭을 보이는 단백질 변화를 추가 분석 대상으로 선정했습니다. 1.2배 변화와 p-값 0.01 미만의 기준을 적용해 0일과 14일 사이에서 유의미하게 다른 풍부도를 보이는 총 199개의 단백질이 확인되었습니다. 93개의 표적 단백질이 상향 조절되었고, 106개의 표적 단백질이 하향 조절되었으며, 이는 침 치료에 특이적으로 나타났습니다 (보충 표 4). 식별된 단백질은 이름, 액세스 번호, 점수, 커버리지, 분자량, PI 및 단백질 발현 비율을 포함하여 표시되었습니다. 이 중 점수 >1000인 22개의 단백질의 중요성은 향후 연구의 흥미로운 주제로 될 것입니다.

차이 있게 발현된 단백질의 기능 분석

생물정보학 분석을 통해 차이 있게 발현된 단백질의 기능과 조절 메커니즘을 이해하는 것이 더 쉽고 명확합니다. 최종 선정된 차이 있게 발현된 단백질은 GO 데이터베이스를 활용해 분자 기능과 생물학적 과정 참여를 분석했습니다. 분자 기능 분석 결과, 대부분의 단백질은 운반, 효소 활성, 신호 전달 경로 또는 수용체 상호작용과 관련된 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 이는 이러한 기능 카테고리에 속한 단백질이 침술 치료 조건 하에서 고도로 발현되고 활성 상태일 수 있음을 시사합니다. 이러한 차등 발현 단백질은 탄수화물 소화 및 흡수, 단백질 소화 및 흡수, 아미노당 및 뉴클레오티드당 대사, 프럭토스 및 만노스 대사, 보체 및 응고 캐스케이드 등 여러 대사 경로와 관련될 수 있습니다. 식별된 고유 단백질의 수에 따라 가장 흥미로운 기능적 카테고리는 “위산 분비”와 “췌장 분비”로, 각각 전체 단백질의 2.53%와 6.33%를 차지했습니다. 이 결과는 ST-36 점이 인간 침술에서 위장 장애 치료에 널리 사용된다는 점을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

위산은

단백질 소화, 칼슘 및 철분 흡수, 세균 감염으로부터의 일부 보호 등

정상적인 상부 위장관 기능에 핵심적인 역할을 합니다21.

산 분비 자극은

일반적으로 세포 내 칼슘과 cAMP의 초기 증가를 거쳐

단백질 키나제 캐스케이드의 활성화로 이어지며,

이는 프로톤 펌프인 H+ -K+ -ATPase가

세포질 관상 소체에서 아피칼 세럼 막으로 이동하여 위강으로 H+를 분비하도록 촉발합니다.

췌장은 외분비 기능과 내분비 기능을 모두 수행합니다22. 외분비 췌장은 아세리나 세포와 관 세포로 구성된 두 부분으로 나뉩니다. 췌장 아세리나 세포의 주요 기능은 소화 효소의 합성과 분비입니다. 췌장 관 세포의 주요 역할은 위 내용물의 산도를 중화시키는 액체와 탄산수소 이온(HCO3−)을 분비하는 것입니다. 시크틴에 의한 세포 내 cAMP 증가가 췌장 HCO3− 분비의 주요 신호 중 하나입니다.

침술 점의 기능을 분자 수준에서 이해하기 위해,

우리는 기능적 풍부도 분석을 수행하기 위해 프로테오믹스 전략을 적용했으며,

특히 침술 치료 후 생물학적 과정의 변화에 초점을 맞췄습니다.

우리는

침술에 특이적인 22개의 표적 단백질을 발견했습니다.

이러한 단백질의 독특한 조절 패턴은

새로운 생물표지자가 침술에 필수적인 다기능 경로에 적극적으로 관여하고 있음을 입증합니다.

이 핵심 단백질의 생물학적 기능은

다섯 가지 그룹으로 분류될 수 있습니다:

(A) 세포외 기질의 생성 및 분해, 포함하여 피브로네ктиן 1, 피브린원 감마 사슬 이소형 CRA_o 및 피브린원 감마 사슬 이소형 CRA_a;

(B) 전사 및 번역 조절, 인산지질 전이 단백질에 의해 제공됨;

(C) 급성기 반응 및 면역 보호, 면역글로불린 중쇄 상수 영역 뮤, 면역글로불린 카파 경쇄 VLJ 영역, 면역글로불린 카파 경쇄 변이 영역, Ig 감마3 중쇄;

(D) 산소화 및 세포 사멸, 이는 항폐렴구균 항체 57E2 경쇄에 의해 기여되며;

(E) 운반 및 대사, 아포리포프로틴 A-II, 아포리포프로틴 C-II, 아포리포프로틴 B-100 전구체, 아포리포프로틴 B 변이체, 투불린 알파-4A 사슬에 의해 제공됩니다.

이들 차등 발현 단백질의 특이적 기능은 “

면역”, “세포 사멸”, ‘운반’, “신호 전달”, “대사”와 같은

생물학적 과정에 기반한 클러스터 내에서 풍부하게 나타났습니다.

따라서 이 단백질들은

침술 점 기능의 생물학적 메커니즘을 추가로 연구하기 위한 후보로 고려될 수 있습니다.

신호 전달 경로 및/또는 신호 네트워크와의 연관성을 밝히기 위해

차등 발현 단백질은 통합 분자 경로 수준 분석 도구(IMPaLA, http://impala.molgen.mpg.de/)에 입력되었습니다.

이 분석 결과,

함께 식별된 단백질들은

침술 점 기능에 대한 호스트 반응에 중요하다는 것이 밝혀졌습니다.

Discussion

In this study we present protein and metabolite profiles response to acupuncture treatment in human serum. To identify potential biomarker candidates for acupuncture effects at ST-36, we performed several data analysis, including multivariate pattern recognition analysis, univariate statistical analysis, pathway analysis and network analysis. We used iTRAQ and UPLC/ESI-Q-TOF/MS approach to identify, quantify and validate changes in protein and metabolite abundance, also to determine the metabolic disturbances pathways perturbation of ST-36 as a case study. Metabolomic analysis of key regulatory metabolites in acupuncture-treated man was successfully investigated by UPLC/ESI-Q-TOF/MS combined with multivariate statistical analysis. Interestingly, we have identified 34 metabolites relevant for ST-36 between blood samples at 0 day (control) and 14 day (treatment). Of note, we found that acupuncture activated an array of factors. Proteomics holds great promise in contributing to the prevention and cure of disease because it provides unique tools for high-throughput screening of biomarkers and therapeutic targets23,24,25,26,27. During the acupuncture treatment, molecular function analysis showed that the acupuncture was found to play a role on ST-36 in transport, signaling pathway and receptor interaction etc. Integrated network analysis of the differentially expressed proteins in acupuncture-perturbed yields highly related signaling networks, suggests strongly that the involvement of these signaling networks could be essential for the biological basis of ST-36.

In summary, we have firstly constructed the metabolomic feature profiling and protein networks of ST-36 by using systems biology approach and bioinformatic functional analysis, to realize the full potential of acupuncture. It is likely that acupuncture alleviates ST-36 through regulating the disturbed glycerophospholipid metabolism, ether lipid metabolism, fatty acid metabolism, glycerolipid metabolism, porphyrin metabolism, sphingolipid metabolism and primary bile acid biosynthesis metabolism. Proteomics findings further extended our understanding on the protein changes related to transport, enzymatic activity, signaling pathway or receptor interaction etc and may provide new clues for exploring the mechanisms of acupuncture on ST-36. The systems biology approach suggested that the acupuncture treatment involved in transport, signaling pathway and receptor interaction. Our study also highlights the importance of systems biology as a potential tool to assess acupuncture treatment, eventually lead to the integration acupuncture with contemporary medicine. Although the study does examine an interesting application in alternative medicine, in any case, it would require a larger cohort design in order to derived greater statistical power. Next research on ST-36 includes the following three aspects: (1) to integrate the metabolomic and proteomic data sets as a way to further validate the biological significance of our preliminary findings; (2) the data needs to be re-eval‎uated when using other corrections to determine which metabolites remain significantly perturbed from baseline; (3) to certain enzymes associated with putative metabolite markers of treatment response differentially expressed within defined pathways.

Acupuncture is a traditional medical therapy that uses hair-thin metal needles to puncture the skin at specific points on the body to relieve pain and promote wellbeing that is used widely around the world. For World Health Organization proposed ‘Health for All’, we should be to promote the use of acupuncture medicine. It is an urgent need to develop new and innovative technologies to explore the underlying biological mechanisms of acupuncture. However, the exact mechanisms of acupuncture are currently unknown and it is likely that the body’s nervous system, neurotransmitters and endogenous substances are involved in needle stimulation. Integrative multi-omics analysis in the post-genomic Era has been able to identify potential candidates for the effects of acupuncture and provides valuable information toward understanding mechanisms of therapy. In its grandest vision, the application of multi-omic systems approaches to the study of disease-perturbed networks will, through analyzing numerous metabolites and could provides platform for research of the essence of acupuncture. It will pave the way for a better understanding of the mechanisms of acupuncture, ultimately advance the acupuncture medicine in the 21st century. We expect that in future, a multi-omic systems-based approach would serve as “Trojan horses” in the field of acupuncture field. With this development, it appears all the ancient concepts can be re-interpreted and harmonized with the integrative multi-omics analysis.

논의

본 연구에서는 인간 혈청에서

침술 치료에 대한 단백질 및 대사체 프로파일 반응을 제시합니다.

ST-36에서의 침술 효과에 대한 잠재적 바이오마커 후보를 식별하기 위해

다변량 패턴 인식 분석, 단변량 통계 분석, 경로 분석 및 네트워크 분석을 포함한 여러 데이터 분석을 수행했습니다.

iTRAQ 및 UPLC/ESI-Q-TOF/MS 접근법을 사용하여

단백질 및 대사체 농도의 변화를 식별, 정량화 및 검증했으며,

ST-36을 사례 연구로 삼아 대사 장애 경로 교란을 결정했습니다.

침술 치료를 받은 남성의 주요 조절 대사체에 대한 대사체 분석은

UPLC/ESI-Q-TOF/MS와 다변량 통계 분석을 결합하여 성

공적으로 수행되었습니다.

흥미롭게도, 0일(대조군)과 14일(치료군) 혈액 샘플 간 ST-36과 관련된 34개의 대사체를 식별했습니다.

특히, 침술이 다양한 인자의 활성화를 유발했다는 점을 발견했습니다.

프로테오믹스는 고효율 바이오마커 및 치료 표적 스크리닝을 위한 독특한 도구를 제공하기 때문에 질병의 예방과 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다23,24,25,26,27. 침술 치료 중 분자 기능 분석 결과, 침술이 ST-36에서 운반, 신호 전달 경로 및 수용체 상호작용 등에 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 침술로 인해 변화된 단백질의 차등 발현에 대한 통합 네트워크 분석은 밀접하게 관련된 신호전달 네트워크를 제시하며, 이러한 신호전달 네트워크의 관여가 ST-36의 생물학적 기반에 필수적일 수 있음을 강력히 시사합니다.

요약하면,

우리는 시스템 생물학 접근법과 생물정보학 기능 분석을 활용해

ST-36의 대사체 특징 프로파일링과 단백질 네트워크를 최초로 구축함으로써

침술의 잠재력을 완전히 실현하기 위해 노력했습니다.

침술은

교란된 글리세로포스파티드 대사, 에테르 지질 대사,

지방산 대사, 글리세로지질 대사, 포르피린 대사, 스핑고지질 대사 및 주요 담즙산 생합성 대사를 조절함으로써

ST-36을 완화할 가능성이 있습니다.

프로테오믹스 연구 결과는

수송, 효소 활성, 신호전달 경로 또는 수용체 상호작용 등과 관련된 단백질 변화에 대한 이해를 확장했으며,

침술의 ST-36에 대한 메커니즘을 탐구하는 데 새로운 단서를 제공할 수 있습니다.

시스템 생물학 접근법은

침술 치료가 운반, 신호 전달 경로 및 수용체 상호작용에 관여함을 제시했습니다.

본 연구는

시스템 생물학이 침술 치료를 평가하는 잠재적 도구로서의 중요성을 강조하며,

궁극적으로 침술과 현대 의학의 통합으로 이어질 수 있음을 보여줍니다.

그러나 이 연구는 대체 의학 분야의 흥미로운 응용 사례를 탐구했지만, 통계적 유의성을 높이기 위해 더 큰 코호트 설계가 필요합니다. ST-36에 대한 향후 연구는 다음과 같은 세 가지 측면을 포함합니다:

(1) 대사체학 및 단백체학 데이터 세트를 통합하여 초기 발견의 생물학적 의미를 추가로 검증하는 것;

(2) 다른 교정 방법을 적용할 때 기저치로부터 유의미하게 변화한 대사체를 확인하기 위해 데이터를 재평가하는 것;

(3) 치료 반응의 잠재적 대사체 지표와 연관된 특정 효소가 정의된 경로 내에서 차등 발현되는지 확인하는 것.

침술은 머리카락보다 얇은 금속 바늘을 사용하여 신체 특정 부위의 피부를 찔러 통증을 완화하고 건강을 증진하는 전통적인 의료 치료법으로 전 세계에서 널리 사용됩니다. 세계보건기구(WHO)가 제안한 '모두를 위한 건강'을 위해 침술의 활용을 촉진해야 합니다. 침술의 근본적인 생물학적 메커니즘을 탐구하기 위해 새로운 혁신적인 기술 개발이 시급합니다. 그러나 침술의 정확한 메커니즘은 현재 알려지지 않았으며, 바늘 자극에 신경계, 신경전달물질 및 내인성 물질이 관여할 가능성이 높습니다.

포스트 게놈 시대의 통합 다중 오믹스 분석은

침술의 효과에 대한 잠재적 후보 물질을 식별하고

치료 메커니즘 이해에 귀중한 정보를 제공합니다.

가장 큰 비전으로,

질병으로 인해 교란된 네트워크 연구에 다중 오믹스 시스템 접근법을 적용하면

수많은 대사물을 분석함으로써 침술의 본질을 연구하는 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

이는 침술의 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 기여할 것이며,

궁극적으로 21세기 침술 의학을 발전시킬 것입니다.

미래에는

다중 오믹스 시스템 기반 접근법이 침술 분야에서

‘트로이 목마’ 역할을 할 것으로 기대됩니다.

이 발전으로 인해

모든 전통적 개념이

통합적 다중 오믹스 분석과 재해석되고 조화될 수 있을 것으로 보입니다.

Materials and Methods

Clinical Study

The study was approved by the Ethics Committee at Heilongjiang University of Chinese Medicine (approval number: HUCM-CTRP-2012-108, date of registration is 09-10, 2012). Our study was designed in accordance with the ethical standards formulated in the Helsinki Declaration. The informed consent was obtained from all subjects. Additional experimental procedures are described in the Supporting Materials.

In-Laboratory Session

Acupuncture stimulation was performed on bilateral ST-36 for 30 min, once a day for two weeks. Blood samples were collected from venous at 0 day (untreatment) and 14 day (treatment). Each blood sample (5 mL) was collected into the tube for 30 min and then centrifuged at 4 000 rpm for 10 min, then the serum sample was separated and stored at −80 °C until further analysis (SI Appendix, Materials and Methods).

Metabolomic Analysis

Details of the untargeted and targeted metabolomics analysis are given in SI Appendix, Materials and Methods.

iTRAQ proteome analysis

Details of the proteomics analysis as well as all statistical analyses, are given in SI Appendix, Materials and Methods.

Additional Information

How to cite this article: Zhang, A. et al. Deciphering the biological effects of acupuncture treatment modulating multiple metabolism pathways. Sci. Rep. 6, 19942; doi: 10.1038/srep19942 (2016).

References

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