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작업 중으로 초벌 번역이고, 오타도 있고, 꿀벌 종 분류에 조금 미비점이 있어 수정할 부분이 있습
니다. 입력할 더 많은 자료가 있어 아직 미완성입니다. 나중에 보세요.
Part 2: Artificial Infection
인공적인 감염
This section deals with the deliberate, experimental infection of bees with controlled amounts of virus,
using a variety of inoculation techniques, trying to mimic a natural transmission route. This requires a
source of relatively pure virus and, ideally, uninfected experimental bees.
이 섹션에서는 자연적인 전파 경로를 모방하기 위해 다양한 접종 기술을 사용하여 제어된 양의 바이러스로
꿀벌을 의도적인, 실험적인 감염을 다룬다.
이를 위해서는 비교적 순수한 바이러스의 공급원과 이상적으로는 감염되지 않은 실험 벌이 필요로 한다.
The success of the infection procedure is tested either through molecular evidence of replication of the
inoculated virus, or more commonly a significant quantitative increase in post-inoculation virus titer that
can only be attributed to the inoculum.
감염 절차의 성공 여부는 접종한 바이러스의 복제에 대한 분자의 증거를 통해서 테스트하거나, 접종물로만
생각되어지는 과거 접종 바이러스의 역가(규정농도)에 더 일반적으로 바이러스 현저한 양적 증가를 통해
검사한다.
A number of negative control inoculations are therefore also required, to rule out alternative sources of
infection or virus titer increase.
따라서 대체 감염원 또는 바이러스 역가(규정농도) 증가를 배제하기 위해 다수의 음성 대조 접종도 필요하다.
Sources of Virus Inoculum
바이러스 접종원
The primary requirement for controlled inoculation is a source of relatively pure virus.
통제된 접종을 위한 기본적인 조건은 비교적 순수한 바이러스의 재원이다.
There are two main approaches to achieving this: through the in vivo (bees) or in vitro (cell cultures)
propagation of natural virus isolates (de Miranda et al., 2013; Genersch et al., 2013), or through reverse
genetics, where the entire virus genome is transcribed synthetically from plasmid clones or PCR products
and introduced into bees as full-length infectious RNA (Benjeddou et al., 2002; de Miranda et al., 2013;
Lamp et al., 2016; Ryabov et al., 2019).
이를 달성하기 위한 두가지 주요한 접근법이 있다 :
자연적인 바이러스 분리물의 생체내 (벌) 또는 시험관내 (세포 배양) 증식을 통해서, 또는 역유전학을 통해서,
전체 바이러스 유전체는 플라즈미드(자기 복제로 증식할 수 있는 유전인자) 복제 또는 PCR(중합효소연쇄반응)
제품에서 합성하여 전사(轉寫)되어 무삭제 감염성 RNA로 벌에게로 전해진다.
註)전사(傳寫 또는 轉寫, 영어: transcription)는 DNA에 적혀 있는 유전정보를 mRNA로 옮기는 과정이다. RNA
중합효소가 이 과정을 맡는다. 기본적으로는 DNA 복제과정 중 한쪽 부분과 유사하나, 전사 과정에서는 한쪽
가닥만을 정보로 삼아 옮겨적고 RNA가 합성된 이후 DNA는 원상복구된다.
원핵세포의 경우 전사된 mRNA는 그대로 다음 과정인 번역과정으로 넘어가게 되나, 진핵세포의 경우 중간에
끼어 있는 인트론을 제거하고 엑손만을 남겨야 하므로 만들어진 mRNA를 가공하는 과정을 거친다.
DNA의 한 가닥을 주형으로 하여 RNA를 만들어 내는 것을 DNA-의존적 RNA 중합효소라고 하며, 전사는 이
효소가 담당한다.
Most studies on artificial inoculation of bee viruses thus far have been conducted with virus material
propagated in vivo, in honey bee pupae, and enriched and purified through differential centrifugation
(de Miranda et al., 2013).
지금까지는 벌 바이러스의 인공 접종에 대한 대부분의 연구는 꿀벌 번데기의 생체내에서 증식 된 바이러스
물질을 사용하여 수행되었으며, 분별 원심분리법을 통해 농축 및 정제되었다.
Because multiple virus infections are common in the bee colonies and most bee viruses have similar
physico-chemical properties, making it impossible to separate them by differential centrifugation, these
studies normally involved semi-pure virus inocula containing varying amounts of contaminating viruses
(Bailey and Ball, 1991; Carrillo-Tripp et al., 2015; Remnant et al., 2019; Thaduri et al., 2019).
봉군에서 다양한 바이러스 감염이 흔하고 대부분의 벌 바이러스는 유사한 이화학적 특성을 가지고 있어, 분별
원심분리법으로 분리하는 것이 불가능하기 때문에, 이 연구는 일반적으로 다양한 양의 오염 바이러스가 들어
있는 준순수한 바이러스 접종을 포함한다.
Covert virus infections (virus present at very low levels) in either the propagating pupae, for preparing
inoculum, or in the experimental bees can easily be co-amplified and interfere with the virus under study
(Carrillo-Tripp et al., 2015; Remnant et al., 2019).
접종물 준비를 위한, 번식시키는 번데기, 또는 실험 벌에서 은밀한 바이러스 감염 (매우 낮은 수준의 바이러스)
은 쉽게 공동 증폭되어 연구중인 바이러스를 방해 할 수 있다.
Moreover, crude bee preparations also contain host cellular material that can independently or in synergy
with either the inoculated or resident background viruses to influence the virus infection dynamics.
더욱이, 미숙한 벌 표본은 또한 바이러스 감염 역학에 영향을 주기 위해 접종된 바이러스이던지 상주 배경
바이러스이던지 간에 독립적으로 또는 동반상승 효과를 낼 숙주 세포 물질을 포함한다. (조금 이해가 덜 가네 그냥 통과)
An alternative approach would be to synthesize the virus of interest in vitro (Lamp et al., 2016; Ryabov et
al., 2019; Seitz et al., 2019; Jin et al., 2020; Yang et al., 2020) thereby ensuring the highest level of purity.
Both cell cultures and reverse genetics also allow virus to be produced that is free of contaminants, while
reverse genetics also has the option of introducing specific genetic changes to the virus genome (Lamp et
al., 2016; Ryabov et al., 2019; Jin et al., 2020).
대안적인 접근법은 시험관 내에서 관심 있는 바이러스를 합성하여 최고 수준의 순도를 보장하는 것이다.
세포 배양과 逆유전학 모두 오염균이 없는 바이러스를 생산할 수 있게 해주는 반면, 逆유전학은 바이러스 게놈
(유전체)에 특정 유전적 변화를 도입하는 옵션을 가진다.
The combination of reverse genetics and cell culture propagation is particularly powerful for obtaining large
amounts of pure infectious virus particles.
However, despite persistent attempts during the last several decades, it was not until recently that cell
culture systems and infection methods were optimized for honey bee virus infection and propagation
(Genersch et al., 2013; Carrillo-Tripp et al., 2015) and full-length infectious plasmid clones of several honey
bee viruses were developed (Yang et al., 2013; Lamp et al., 2016; Ryabov et al., 2019; Seitz et al., 2019).
역 유전학과 세포 배양 증식의 조합은 많은 양의 순수한 감염성 바이러스 입자를 얻는데 특히 매우 효과적
이다. 그러나, 지난 수십 년 동안의 끊임없는 시도에도 불구하고, 최근에 이르러서 꿀벌 바이러스 감염 및
증식을 위해 세포 배양 시스템 및 접종방법이 최적화되었고, 여러 꿀벌 바이러스의 무삭제 감염 플라즈미드
복제가 개발되었다.
Recently, a molecular clone of CBPV was shown to cause typical clinical symptoms mimicking naturally
CBPV-infected honey bees (Seitz et al., 2019). Similarly, SBV and DWV clones have been synthetized to
express the enhanced green fluorescent protein (EGFP; Jin et al., 2020; Ryabov et al., 2020).
최근, CBPV의 분자 복제가 자연적으로 CBPV에 감염된 꿀벌을 모방한 전형적인 임상 증상을 일으키는 것으로
나타났다 비슷하게, SBV 및 DWV 복제는 강화된 녹색 형광 단백질을 발현하기 위해 합성되었다
Besides creating a clone that produces typical symptoms, it adds the advantage of a reporter gene for
protein expression studies (Jin et al., 2020).
One valid criticism of the reverse genetics approach is that it usually involves a single pure genetic clone,
while viruses exist naturally as quasispecies – a collection of interrelated major variants, point mutants,
recombinants and defective genomes (Dolan et al., 2018).
전형적인 증상을 일으키는 복제품를 생성하는 것 외에도, 단백질 발현 연구를 위한 정보제공 유전자의 장점을
추가합니다. 역 유전학 접근법에 대한 한가지 타당한 비평은 일반적으로 단일 순수 유전자 복제품을 보통
포함하는 것이고, 반면에 바이러스들은 의사종(擬似種)으로 자연적으로 존재한다. - 상호 관련된 주요한
유전적 변이, 점 돌연변이, 재조합 및 결함 게놈의 수집
註) 의사종(擬似種 :quasispecies) : 유사한 게놈을 가진 바이러스 그룹
Experiments with pure single genome viruses therefore lack the functional and genetic complexity of
natural virus isolates. The obvious solution to this is to create a diverse set of infectious cDNA clones
representing the genetic diversity of the original population (e.g., Ryabov et al., 2019).
따라서 순수 단일 게놈 바이러스를 사용한 실험은 자연 바이러스 분리물의 기능 및 유전적 복잡성은 부족하다.
이에 대한 분명한 해결책은 원래 개체의 유전적 다양성을 나타내는 감염성 cDNA 복제물의 다양한 세트를
만드는 것입니다.
Multiple positive and negative controls for all the steps of the inoculation process, from the manipulation
of the individuals, incubation conditions, mode of inoculation, etc., are required to ensure that the infection
is due to the target virus in the inoculum, and not due to contaminants in either the inoculum or the
recipient host.
개체들의 조작, 배양 조건, 접종 방식 등에서 접종 과정의 모든 단계에 대한 다양한 양성 및 음성 대조군은
접종물인지 수용성의 숙주인지 간에 감염이 접종물에 있는 표적 바이러스 때문이지, 아니면 오염물질 때문
인지 확인하는 것은 필요하다.
The quality and quantity of the virus in the original inoculum as well as in the inoculated bees can be
evaluated by qualitative and quantitative real-time PCR and by sequencing. The methods for virus
propagation and virus infectivity assays have been described in detail in the Beebook (de Miranda et al.,
2013). Here, we focus on summarizing the results of virus infectivity assays conducted during the last
years.
접종된 꿀벌에 뿐만 아니라 원래 접종물에 있는 바이러스의 품질과 양은 질적이고 양적인 실시간 중합효소
연쇄반응 및 염기서열 분석을 통해 평가될 수 있다. 바이러스 증식 및 바이러스 감염성 분석 방법은
Beebook에 자세히 설명되어 있다.
여기에서 우리는 지난 몇 년 동안 수행된 바이러스 감염성 분석의 결과를 요약하는데 중점을 둔다.
Artificial infection experiments in honey bees primarily involve two forms of inoculation: by direct injection
of micro volumes of virus into the honey bee using a fine needle, mimicking the vectored transmission by
varroa, or by feeding, mimicking the oral-fecal transmission route.
꿀벌의 인공 감염 실험은 주로 두 가지 형태의 접종을 포함한다 : 미세 바늘을 사용하여 꿀벌에게 극소량의
바이러스를 직접 주입하거나, 바로아 응애를 통한, 또는 구강-배변 전염 경로를 모방하여 먹이를 주는 매개
전염.
Very occasionally topical application is used, mimicking transmission by contact. Inoculation by injection
allows absolute control over the amount of virus each bee receives, but not necessarily of the subsequent
progression of the infection.
접촉에 의한 전염을 모방하는 국소 적용방법은 매우 가끔 사용된다. 주사에 의한 접종은 각 꿀벌이 받는 바이
러스의 양을 완전한 제어를 할 수 있지만, 반드시 후속 감염 진행을 제어할 필요는 없다.
This is because injection directly by-passes the main physical and physiological antiviral defenses, leaving
the infection subject to only molecular controls.
이것은 주사가 주요 물리적 및 생리학적 항 바이러스 방어를 직접 우회하여 전염 대상을 분자 제어에만 적용
하기 때문입니다.
This is in contrast to oral inoculation, which often requires much higher amounts of virus (between 106
and 1011 particles, depending on the virus; Bailey and Gibbs, 1964; Bailey and Ball, 1991; de Miranda et al.,
2013) to initiate infection, due to these natural physical and physiological barriers, but whose subsequent
progression is much more measured and predictable.
이것은 이러한 자연적인 물리적 및 생리적 장벽 때문에, 감염을 시작하기 위해 종종 훨씬 더 많은 양의 바이러
스가 필요하지만, 후속 진행이 훨씬 더 측정되고 예측 가능한 경구 접종과는 대조적이다.
The precise conditions for artificial inoculation vary greatly among viruses. Some of them have been
studied widely while for others this information is largely unknown.
인공 접종을 위한 정확한 조건은 바이러스에 따라 크게 달라진다. 그들 중 일부는 광범위하게 연구되었지만
다른 사람들에게는 이 정보가 거의 알려지지 않았다
Oral Inoculation and Injections
경구 접종 및 주사
DWV
기형 날개 바이러스
Oral inoculation of adult bees with DWV does not induce overt DWV infections, even when using large
titers of the virus (108 genome equivalents), and the virus was restricted to the abdominal organs (Möckel
et al., 2011).
성봉에 DWV를 경구 접종하면 큰 역가(규정농도)의 바이러스를 사용해도 (108 개의 게놈 상당물), 명백한
DWV 감염을 유발시키지 않으며, 바이러스는 복부 기관에만 국한되었다.
Artificial oral inoculation of DWV seems to be rather ineffective (Iqbal and Mueller, 2007), much of which
can be attributed to the extreme instability of DWV in isolation (de Miranda et al., 2013).
DWV의 인공 경구 접종은 다소 비효과적인 것으로 보이며, 그 중 많은 부분이 격리된 DWV의 극단적인 불안정
성 때문일 수 있다.
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However, when feeding 2 days-old larvae with 2 μl of serial dilutions of DWV, Khongphinitbunjong et al.
(2015) observed significant higher viral titers in the resulting adults than in sucrose-fed controls,
suggesting that both the developmental stage used for oral infection and the virus quantity were
significant for establishing infection.
그러나 2 일령 유충에게 DWV의 연속 희석액 2μl를 먹일 때 Khongphinitbunjong 외. (2015)는 자당을
먹인 대조군 보다 성봉에서 상당한 더 높은 바이러스 역가를 관찰했으며, 이는 발달 단계에서는 구강 감염을
사용하였고 바이러스 양이 감염을 확립하는데 중요했음을 시사한다.
Similar results were obtained by Thaduri et al. (2019) for oral inoculation of larvae with a single dose of
freshly prepared crude DWV extracts containing 108–109 DWV genome equivalents, although the majority
of this would have been unpackaged cytoplasmic RNA and only a from virus particles.
108 ~ 109 개의 DWV 게놈 등가물을 포함하고 있는 신선하게 준비된 천연 그대로의 DWV 추출물의 1회
복용량으로 유충의 경구 접종한 경우에도 타두리 외. (2019)는 비슷한 결과를 얻었지만, 이것의 대부분은
포장되지 않은 세포질 RNA였으며 바이러스 입자의 일부일 뿐이었다
The results for adult bees were equivocal due to the high background levels of DWV in newly emerged
adult bees (Thaduri et al., 2019). Artificially reared newly hatched larvae orally inoculated with high doses
of DWV (about 1010 virus genome equivalents) established high levels of DWV infection (Ryabov et al.,
2016).
성봉에 대한 결과는 새로 출방한 성봉의 DWV 배경 수준이 높기 때문에 모호하였다. 인공적으로 사육하여
새로 부화한 유충은 높은 수준의 DWV 감염이 확립된 고용량의 DWV (약 1010개 바이러스 게놈 등가물)를
구강으로 접종하였다.
Sequential experimental oral infections with DWV and Nosema ceranae in 2 days old workers resulted in
lower DWV loads when N. ceranae was inoculated before DWV, suggesting competitive interference
between pathogens (Doublet et al., 2015).
2일령의 일벌 유충에 DWV 와 노제마 세라나에로 연속적인 실험 구강 감염은 노제마 세라나에를 DWV
이전에 접종했을 때 DWV 부하를 낮아졌는데, 이는 병원균 간의 경쟁적 간섭을 시사한다.
Overt DWV infections could only be obtained through injecting the virus into young pupae (Möckel et al.,
2011; Natsopoulou et al., 2017; Dubois et al., 2020; Yañez et al., 2020), even with as little as 80 virus
particles, but never through feeding (Möckel et al., 2011).
명백한 DWV 감염은 어린 번데기에 바이러스를 주사를 해야만 얻을 수 있다. 최소한 80개 정도의 바이러스
입자로도, 그러나 먹이를 통해서는 결코 안된다.
Injection has been used frequently to mimic natural inoculation by varroa while feeding on nymphs or
adult bees. Worker pupae at the white eye stage (12–13 days old) micro-injected with106 copies of DWV
exhibited virus replication and significant immune-gene expression modulations 5 days post injection
(Ryabov et al., 2016), and injection of 107 copies of either clone-derived DWV isolates or wild DWV isolates
reached about 1010 to 1011 genome copies per bee after only 24 h post-injection (Ryabov et al., 2019).
주사는 유충 또는 성봉에게 먹이를 주는 동안 바로아 응애에 의한 자연 접종을 모방하기 위해 자주 사용되었
다. DWV 106개 사본을 미세 주사한 백안 단계 (12-13일령)의 일벌 번데기는 주사 후 5일 바이러스 복제 및
상당한 면역 유전자 발현 조절을 보였으며, DWV 분리물에 파생된 복제생물이던지, 자생의 분리물이던지 107
개 사본을 주사했다. DWV 분리는 주입 후 단 24 시간 만에 꿀벌 당 약 1010 ~ 1011 개의 게놈 복제에 도달
했다.
Similar results were obtained by Yañez et al. (2020) when serially injecting DWV into pink-eye pupae. When
young adults were injected with 104 to 106 copies of DWV into the thorax or abdomen no acute mortality
was observed but the bees’ lifespan decreased and flight behavior was affected (Mazzei et al., 2016; Bigot
et al., 2017; Coulon et al., 2020).
핑크아이 번데기에 DWV를 연속적으로 주입 할 때 Yañez 외 (2020) 의해서 비슷한 결과가 얻었다.
유봉에게 104 ~ 106 개의 DWV를 흉부나 복부에 주사했을 때, 급성 사망은 관찰되지 않았지만 꿀벌의 수명이
줄어들고 비행 행동에 영향을 받았다.
Both Natsopoulou et al. (2017) and Dubois et al. (2020) showed that DWV-A and DWV-B were equally
capable of causing DWV symptoms, after injecting white-eye pupae and letting the pupae complete
development in vitro. Mortality was significantly higher for adult honey bees injected with 107 copies of
DWV-B compared to bees injected with the same amount of DWV-A (McMahon et al., 2016).
Natsopoulou 외. (2017) 및 Dubois 외. (2020)는 DWV-A와 DWV-B가 화이트 아이 번데기에게 주입하고
번데기가 시험관 내에서 완전히 발달하도록 한 후 DWV 증상을 똑같이 유발할 수 있음을 보여주었다.
동일한 양의 DWV-A를 주입한 꿀벌에 비해 DWV-B 107 개를 주입한 성봉의 사망률이 훨씬 높았다.
Gisder et al. (2018) showed that a DWV-B dominant isolate from mites changed genetic character to a
DWV-A dominant derived isolate after a single passage in bee pupae, most likely through a simple
quantitative shift in the relative levels of DWV-A and DWV-B genomes after passaging.
The original DWV-B dominant isolate was more virulent than the evolved DWV-A dominant isolate when
considering pupal mortality and adult bee cognitive behavior, but not for adult bee mortality.
기스더 외. (2018)는 응애에서 나온 DWV-B 우성의 파생된 분리물이 꿀벌 번데기에 단일 계대 접종 후
유전적 특성을 DWV-A 우성 파생 분리체로 변경된 것을 보여 주었고, DWV-A 및 DWV-의 상대적 수준의
단순한 정량적 이동을 통한 가장 가능성이 높다. 원래의 DWV-B 우성 분리물은 번데기 사망률과 성봉의 인지
행동을 고려할 때, 진화된 DWV-A 우성 분리물 보다 더 발병력이 높지만 성봉 사망률에 대해서는 그렇지
않았다.
The elevated virulence of the DWV-B dominant isolate could be attributed to more efficient replication in
pupae and wider dissemination in adult bee neurological tissues.
DWV-B 우성 분리물의 증가된 발병력은 번데기에서 더 효율적인 복제와 성봉 신경 조직에서 더 넓은 전파
때문이라고 생각된다.
The consensus sequences of matching source and passaged isolates with different virulence properties
clustered differently with either DWV-A or DWV-B, depending on which region of the genome was
analyzed, which allowed the elevated virulence to be mapped to the DWV-B RNA-dependent RNA
polymerase (RdRp) region of the DWV genome (Gisder et al., 2018).
게놈의 어느 영역이 분석되었는지에 따라 DWV-A 또는 DWV-B가 다르게 군집된 서로 다른 발병력 특성을
가진 일치하는 재료 및 계대 접종 분리물의 공동 서열은 상승된 발병력이 DWV 게놈의 RNA 중합 효소
(RdRp) 영역에 종속하는 DWV-B RNA-에 염색체 위에 배치하도록 하였다.
Such differential phylogenetic affiliation across the DWV genome is most easily explained by a significant
presence of recombinant viruses in the quasispecies, enough to change the genetic character of the
consensus sequence of the whole isolate (Dolan et al., 2018).
DWV 게놈(유전체)를 통한 이러한 차별적인 계통 발생의 인정은 의사종에서 유전자 재조합 바이러스의 상당한
존재에 의해 가장 쉽게 설명되며, 전체 분리체의 공통 서열의 유전적 특성을 변경하기에 충분하다.
Such DWV-A/DWV-B recombinants are readily generated naturally in mixed infections (Moore et al., 2011;
Zioni et al., 2011; Ryabov et al., 2014, 2019; Cornman, 2017; Dalmon et al., 2017) and have been used to
map other differential traits of DWV-A and DWV-B as well (Moore et al., 2011; Ryabov et al., 2014, 2019).
이러한 DWV-A / DWV-B 유전자 재조합 바이러스는 혼합 감염에서 쉽게 자연적으로 생성되며 또한 DWV-A
및 DWV-B의 다른 차별적 특징도 위치하는데 사용되었다.