DART VADAR는 더 나은 RNA 약물을 위해 효소의 힘을 활용합니다.

[아름이]

DART VADAR는 더 나은 RNA 약물을 위해 효소의 힘을 활용합니다.
새롭고 설계하기 쉬운 RNA 기반 센서는 세포 내 분자 트리거를 감지하고 자동으로 대응할 수 있습니다.
날짜:
2023년 3월 20일
원천:
하버드의 생물학적 영감 공학을 위한 Wyss 연구소
요약:
유전자 치료는 의학의 새로운 영역으로 알려졌지만 현재 기술에는 여전히 많은 한계가 있습니다. 그 중 치료용 유전자를 특정 세포에 전달하고 올바른 상황에서만 활성화하는 방법입니다. 한 팀이 유전자 편집을 이러한 문제의 '어두운 면'에서 빛으로 가져오기 위해 DART VADAR라는 새로운 RNA 기반 도구를 만들었습니다. 자연적으로 발생하는 효소의 조작된 형태를 사용하여 그들의 센서는 트리거 분자의 존재를 자동으로 감지하고 세포 내에서 페이로드 유전자의 번역을 시작할 수 있습니다. 이러한 진보는 RNA 기반 치료법으로 치료할 수 있는 상태의 범위를 넓히고 다양한 질병에 대한 고도로 특정한 치료법을 개발할 수 있게 합니다.

전체 이야기
COVID 전염병이 시작된 이래 전 세계적으로 120억 회 이상의 mRNA 백신이 투여되어 수백만 명의 생명을 구했습니다. 그러나 다른 질병에 대한 RNA 기반 치료법은 지금까지 개발하기가 더 어려운 것으로 입증되었습니다. mRNA 백신으로 인한 전신 면역 반응은 침입하는 병원균과 싸우는 데 환상적이지만 다른 많은 조건은 단일 기관이나 세포 유형에만 영향을 미칩니다. 올바른 조건에 있을 때만 치료 페이로드를 활성화하도록 RNA 분자를 엔지니어링하는 것이 차세대 "스마트" RNA 기반 치료법의 핵심입니다.

Nature Communications 에 보고된 바와 같이 Harvard University와 MIT의 Wyss Institute 연구원들이 만든 새로운 시스템은 그 잠재력을 여는 데 도움이 될 수 있습니다 . Wyss Core Faculty 멤버 Jim Collins, Ph.D.의 연구실에서 작업하는 팀은 그들이 ADAR 또는 DART VADAR를 통한 RNA 트리거의 감지 및 증폭이라고 부르는 새로운 RNA 감지 및 응답 회로를 개발했습니다. DART VADAR는 인체에서 RNA를 편집하는 효소를 활용하여 연구원들이 질병 및/또는 세포 유형의 특정 분자 마커의 존재에 반응하여 전달된 유전자 페이로드의 번역을 트리거하는 회로를 쉽게 설계할 수 있도록 합니다. 이 능력은 RNA 기반 치료법으로 해결할 수 있는 조건의 범위를 넓히고 다양한 질병에 대한 매우 특정한 치료법을 개발할 수 있게 합니다.

"저는 우리의 DART VADAR 시스템이 특정 세포 유형 및 특정 상태의 세포에 고도로 프로그래밍 가능한 방식으로 치료법을 지시하여 오프 타겟 효과를 최소화할 수 있게 해주는 임상적으로 관련된 소형 RNA 기반 회로라는 사실에 특히 흥분됩니다. "라고 MIT의 의료 공학 및 과학 학기 교수이기도 한 Collins는 말했습니다.

방아쇠에서 번역, 치료까지

Collins Lab은 오랫동안 세포에서 RNA의 번역을 제어하는 ​​방법을 찾는 데 관심을 가져 왔으며 특정 "트리거" 분자가 있는 경우에만 번역을 시작할 수 있는 eToeholds를 포함한 여러 방법을 개발했습니다. 그러나 모든 새로운 유발 요인에 대해 새로운 분자 구조를 설계하는 과정은 번거롭고 복잡했습니다. "우리의 기술은 반응성 RNA 센서의 요소(감지, 작동 등)를 분리할 수 있다는 생각에서 성장했습니다. 따라서 새로운 대상에 대한 회로를 훨씬 쉽게 설계할 수 있습니다. 이상적으로는 페이로드를 Wyss Institute의 연구 과학자인 공동 제1저자인 Raphaël Gayet 박사는 이렇게 말했습니다.

DART VADAR가 구성되는 물질은 RNA 또는 ADAR에 작용하는 아데노신 데아미나제라고 합니다. ADAR은 dsRNA(double-stranded RNA) 분자에 결합하고 특정 염기 편집을 만들어 일치하지 않는 아데노신(A) 분자를 이노신(I)으로 변환하는 효소입니다. 이 변화는 dsRNA 구조를 불안정하게 만들고, 다른 바이러스에 대한 세포의 반응에 관여하는 것으로 생각되며, 그 중 다수는 유전 물질을 RNA로 가지고 있습니다.

연구원들은 새로운 종류의 반응성 RNA 센서를 만들기 위해 ADAR의 자연적인 dsRNA 편집 능력을 사용할 수 있다고 추론했습니다. 그래서 그들은 여러 모듈 요소를 포함하는 단일 가닥 RNA 회로를 설계했습니다.

세포 내 관심 RNA에 상보적인 서열
RNA 가닥 중간에 있는 우라실-아데노신-구아닌(UAG)의 "정지" 코돈 서열
관찰 가능한 신호 분자로서 형광 녹색 단백질을 코딩하는 서열
UAG 코돈 서열은 녹색 형광 단백질과 같이 그 뒤에 인코딩된 모든 유전자가 번역되는 것을 방지합니다. UAG는 번역 과정을 중지하고 RNA 가닥에서 떨어져야 한다는 리보솜에 대한 자연 신호이기 때문입니다. 그러나 회로가 세포의 상보적인 표적 RNA 가닥에 결합하면 이중 가닥 RNA 분자가 됩니다. 팀은 UAG 시퀀스의 A가 U의 정당한 파트너가 아니라 표적 가닥의 시토신(C)과 "불일치"하도록 회로를 설계했습니다. 이 불일치는 본질적으로 A를 발견하고 I로 변환할 수 있도록 합니다. ADAR에 의해 생성되며 결과 UIG 시퀀스는 더 이상 "정지" 코돈이 아니므로 번역이 발생할 수 있습니다. 따라서 녹색 형광 단백질이 생성되어 센서 회로가 표적을 발견하고 결합했다는 신호를 보냅니다.

ADAR은 자연적으로 뉴런에서 높은 농도로 발견되지만 다른 세포에서는 적은 양으로 발견되며 팀은 ADAR 기반 센서가 작동하는 동안 활동이 낮다는 것을 발견했습니다. 센서가 다른 세포 유형에서 작동할 수 있도록 하기 위해 그들은 ADAR 유전자의 시퀀스를 센서에 추가했습니다. 이제 세포에 자연적으로 존재하는 ADAR에 의한 센서의 활성화는 더 많은 ADAR의 생산을 자극하여 센서의 활동을 증폭시키는 양성 피드백 루프를 생성할 수 있습니다. 그들은 ADAR이 포함된 DART VADAR 센서를 받은 세포가 형광 녹색 단백질 수준의 현저한 증가를 나타내는 것을 관찰하면서 이것이 시험관 내 실험에서 발생했음을 확인했습니다 .

"이 센서에서 정말 흥미로운 점은 녹색 단백질 신호 서열이 세포 내 트리거 RNA의 존재에 반응하여 발현하고자 하는 치료 유전자의 서열로 쉽게 교체될 수 있다는 것입니다. MIT의 박사 후 연구원인 공동 제1저자인 Shiva Razavi 박사는 "사용자 입력 없이 자동으로 반응하여 세포 수준에서 치료 페이로드 전달을 자동화할 수 있다"고 말했다.

고감도 센서

팀은 DART VADAR의 첫 번째 버전이 효과가 있다는 사실에 감격했지만 치료적 접근 방식으로 유용하려면 약간의 수정이 필요하다는 사실을 깨달았습니다.

"당사의 센서를 통해 자연적으로 발생하는 ADAR를 표현하는 동안 A-to-I 편집 비율이 약 3%에서 약 30%로 증가했지만 실제 상황에서는 여전히 유용하지 않습니다. 내인성 ADAR은 일관된 결과를 생성하기에는 불충분하며 AAV[아데노 관련 바이러스]와 같이 임상적으로 승인된 전달 수단에 맞추기에는 너무 큽니다. 번역 가능성 측면에서 실험실에서 수행하는 모든 작업이 언젠가는 현실적으로 제품으로 만들어질 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다."라고 말했습니다. 공동 제1저자 Katherine Ilia, Ph.D., MIT 박사후 연구원.

이러한 한계를 해결하기 위해 팀은 활성 RNA 편집 영역만 포함하도록 잘린 조작된 ADAR 변이체를 활용하고 MS2로 알려진 "헤어핀" RNA 구조에 결합할 수 있는 두 개의 짧은 영역을 추가하여 센서에 삽입했습니다. UAG 코돈 옆에 있는 서열. 그들이 MCP-ADAR로 명명한 이 키메라 단백질은 자연적으로 발생하는 ADAR보다 훨씬 작고 비표적 분자에 결합할 가능성이 적습니다. 또한 RNA 센서의 ADAR 유전자를 수정하여 수정된 MCP-ADAR 버전으로 번역되도록 했습니다. 이제 세포에서 자연적으로 발생하는 ADAR에 의해 센서가 활성화되면 생성된 MCP-ADAR이 MS2 헤어핀을 통해 다른 센서에 결합하여 더 많은 MCP-ADAR 생성을 유도하고 센서의 활동을 증폭할 수 있습니다.

최적화된 DART VADAR 시스템의 성능을 조작된 효소로 테스트하기 위해 팀은 인간 p53 종양에서 단일 염기 돌연변이를 감지할 수 있는지 확인하기로 결정했습니다.

여러 종류의 암을 유발하는 것으로 알려진 억제 유전자. 그들은 p53 돌연변이를 감지하기 위해 DART VADAR 센서를 설계하고 정상 또는 돌연변이 버전의 유전자를 발현하는 플라스미드와 함께 인간 세포 라인에 도입했습니다. 그들은 유전자의 돌연변이 버전을 포함하는 세포가 센서에서 리포터 유전자의 5배 활성화를 보여 센서가 실제로 높은 특이성으로 비정상적인 유전자 서열의 존재를 등록했음을 보여줌을 발견했습니다.

다음으로 그들은 세포 상태의 특정 분자 마커의 존재를 기반으로 DART VADAR가 서로 다른 발달 단계에 있는 건강한 세포를 구별할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 그들은 myotubes(근육이 됨) 및 osteoblasts(뼈를 생성함)를 포함하여 여러 세포 유형으로 분화할 수 있는 전구 세포인 myoblasts라고 불리는 마우스 세포를 사용했습니다. 그들은 DART VADAR 센서를 설계하여 두 세포 운명의 RNA 마커를 감지하고 근모세포가 분화되도록 자극한 다음 센서를 세포에 추가했습니다. 그들은 두 센서가 해당 세포에서 각각의 페이로드 신호 분자를 강력하게 생성하여 센서가 세포 상태와 세포 유형 모두에서 분자 차이를 감지할 수 있음을 입증했습니다.

연구팀은 DART VADAR를 다양한 임상 응용 분야에 적용하기 위해서는 센서 개발 과정에서 면역 반응을 유발할 가능성과 같은 표적 부위의 추가적인 측면을 고려해야 할 것이라고 지적했다. 그들은 안전하고 효과적인 DART VADAR 센서의 설계를 안내하기 위해 최적의 표적 부위 선택을 더욱 세분화하는 데 단백질 구조 예측의 최근 계산 발전을 사용할 수 있을 것으로 예상합니다. 그들은 DART VADAR를 사용하여 줄기 세포를 다른 세포 유형으로 단계적으로 분화하는 것을 탐구하기 위한 보조금을 신청했으며, 이는 향후 환자의 질병 세포를 건강한 세포로 대체하는 데 사용될 수 있습니다.

"기존의 생물학적 구성 요소를 광범위한 질병의 치료를 더 빠르고 쉽게 만들 수 있는 완전히 새로운 공학적 기술로 결합하는 이 팀의 능력은 합성 생물학이 어떻게 세상을 더 나은 방향으로 변화시킬 수 있는지를 보여주는 좋은 예입니다."라고 말했습니다. Wyss 창립 이사 Don Ingber, MD, Ph.D. Ingber는 또한 Harvard Medical School 및 Boston Children's Hospital의 혈관 생물학과의 Judah Folkman 교수 이자 Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences의 Hansjörg Wyss Bioinspired Engineering 교수 이기도 합니다.

Nathaniel Tippens는 이 논문의 또 다른 공동 제1저자입니다. 추가 저자로는 Wyss Institute 및 MIT의 Makoto Lalwani, Kehan ​​Zhang, Jack Chen, MIT 및 Broad Institute의 Jonathan Chen, MIT Picower Institute의 Jose Vargas-Asencio가 있습니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01EB024591 및 5RC2DK120535-03과 Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering의 지원을 받았습니다.


출처 : https://www.sciencedaily.com/