Re:MTT assay법에 대해 아시남요??---식품개발연구원에서 했었던 내용입니다. 참고하세요.

[이현승]

"옻추출물 및 옻닭제품이 인체유래 암세포의 성장에 미치는 영향"(실험보고서1)

예부터 옻나무 껍질과 주로 닭을 이용한 옻닭이 건강식품으로 이용되어 왔다. 본초강목에 의하면 참옻은 암세포를 사멸시키고 항균작용, 혈압강하, 혈액순환 등에 효과가 있으며 간장 및 위장을 보호한다고 알려져 있으나 이에 대한 체계적이고 과학적인 연구는 거의 없는 실정이다. 최근 임목 육종연구소의 나등은 옻나무를 열처리 해 얻은 화칠의 주요 성분인 urushiol로부터 흰쥐유래 혈액 암 세포, 인체유래 폐암 세포 및 위암세포의 성장을 억제하는 효과가 뛰어난 MU2라는 성분을 분리하였다고 보고하였다. 또한 이 성분은 알러지 반응을 일으키지 않을 뿐 아니라 항암효과 이외에도 강한 항산화 작용 및 숙취해소기능을 가지는 약제로서의 가능성 이 크다고 보고하고 있다.
이에 본 실험에서는 옻의 생리활성 효과를 체계적으로 연구하고자 우선 옻 껍질 및 옻나무의 열수 추출물과 옻닭제품이 인체유래 암세포의 성장에 미치는 효과를 검토하였다.

<한국식품개발연구원>





1. 실험 방법


가. 시료의 조제
옻 나무 및 껍질시료는 3차 년도에 추출한 추출물을 50mg/ml이 되도록 증류수에 녹여 각 농도별로 희석하여 시료로 사용하였다.
옻닭제품은 옻닭제품의 수용성 수분을 1차 여과(Toyo No.1) 2차 여과(Toyo No2.)한 다음 멸균 filtering
(0.2um)하여 사용하였다.

나. 세포주 및 세포배양
사용한 암세포주로서는 사람유래 대장암 세포 SNU-C4, 위암 세포SNU-1, KATO III, 간암세포 HepG2 및 유방암 세포 MCF7을 이용하였으며 이들 세포는 Korea Cell Line Bank(KCLB)로붐터 구입하였다. SNU-C4, SNU-1, MCF 7 및 KATO III는 RPMI 1640배지를 사용하였다. 각 배지에는 penicillin과 streptomycin을 첨가하였고 fetal bovine serum을 10%되게 첨가하였으며 37°C, 5% CO2 incubater에서 배양하였다.
DAWN 808이 정상세포 및 암세포주의 세포독성을 암 예방 효과의 지표로 삼았으며 세포독성을 판독하는 방법으로서는 cell proliferation을 측정하는 colorimetric assay인 MTT assay인 MTT assay를 이용하였다.

다. MTT assay
각 세포의 증식속도를 고려하여 적정수의 세포를 10% fetal bovine serum을 함유한 배지에 부유시켜 seeding하였다. 즉 SNU-C4, Hep G2는 1x 10cell, KATO III, MCF 7, SNU-1는 2x10cell의 수로 seeding하였다. 옻 추출물 시료는 200,100, 50, 10 ug/well이 되도록 첨가하였고, 옻닭제품은 5, 10, 15, 20 ug/well 되도록 첨가하였고 시료당 각각의 실험군은 96 well piate의 1column(8well)을 동일한 조건으로 사용하였으며 37°C, 5% CO2 incubator에서 3일간 배양하였다. 여기에 0.1mg MTT를 각 well에 첨가하여 4시간 더 배양시켜 formazan 을 형성시킨 후 formazan이 흩트러지지 않도록 조심스럽게 상등액을 제거하고 DMSO를 150ul 가하였다. Formazan을 녹인 다음 microplate reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 세포에 대한 독성은 시험군 8well의 평균 OD값을 구하여 대조군 8well의 평균 OD값에 대한 백분율로 나타내었다.





2. 실험 결과



가. 옻추출물이 암세포의 성장에 미치는 영향
인체유래 각종 암세포주의 성장에 미치는 옻추출물의 영향을 검토한 결과, 우선 간암유래 세포인 GepG2 cell에 있어서 보면 0.5mg/well첨가시 약 80%의 세포성장 억제효과를 나타내었고, 0.2mg/well 농도에서는 약 50%의 억제효과를 나타내었으며 0.02mg/well농도에서는 10% 미만의 효과를 나타내었다. 또한 전체적으로 옻나무에 비하여 옻껍질 추출물에서 더 강한 활성을 나타내었으며 볶음 온도에 따른 영향은 크지 않았다.
유방암 유래 세포인 MCF7에서는 0.2mg/well 첨가시 옻나무 추출물에서는 볶음온도에 관계없이 대조군의 91-103%의 범위로서 암세포 성장억제효과가 없었으며 옻껍질에서는 대조군의 69-73% 범위를 나타내어 약 30%의 암세포 성장 억제효과를 보였고 마찬가지로 볶음온도의 차이에 의한 영향은 없었다.
대장암 유래세포인 WiDr에서는 0.2MG/WELL첨가 시 50-70%의 세포성장 억제 효과를 나타내었고 역시 옻나무보다는 껍질이 더 강한 효과를 나타내었다. 그러나 위암유래 세포인 SNU-1 세포성장에는 옻나무 추출물의 첨가량에 관계없이 94 ? 112%의 범위로서 암세포의 성장에 전혀 영향을 미치지 않았다.
이상 옻추출물이 각종 인체유래 암세포주의 성장에 미치는 영향을 검토한 결과 대장암 유래 암세포에서 가장 높은 효과를 나타내었고 다음은 간암 유래 세포였으며 유방암 유래 세포에는 거의 미미한 효과만을 보였고 위암유래 세포주 SNU-1에는 효과가 없는 것으로 확인 되었다.

나. 옻닭 제품이 암세포의 성장에 미치는 영향
옻을 이용한 제품 옻노계, 옻오리, 옻세미 제품의 수용성 성분이 인체유래 각종 암세포의 성장에 미치는 영향을 검토하였다.
간암 세포인 HepG2에 있어서 노계, 오리, 세미 시료를 5ul/well첨사시 세포성장률은 각각 대조군의 105, 107 95%로 암세포으 성장에 영향을 미치지 않았으마 10ul/well첨가시에는 노계, 오리는 대조군의 90% 이상이었으나 10el/well 첨사시에는 노계, 오리는 대조군의 90% 이상이었으나 세미에서는 77%로서 약 23%의 성장억제 효능을 나타내었다. 15ul/well에서는 3시료 모두 약 50%의 암세포 성장억제효과를 나타내었으며 20ml/well에서는 오리가 대조군의 30%로 가장 낮았고 노계, 세미는 약 44%로서 각각 70%, 56%의 암세포 성장억제효과를 나타내었다.
유방암 세포인 MCF7과 위암 세포인 SNU-1에서는 첨가농도 20ul/well에서도 암세포의 성장이 감소하지 않아 옻닭제품은 유방암과 위암세포에는 영향이 없는 것으로 판단되었으며 이는 옻 추출물을 첨가한 시험결과와 동일한 경향이었다.
대장암 세포인 SNU-C4에서는 5ul/well첨가 시에도 대조군의 약 65% 전후로소 약 35%의 암세포성장억제효과를 나타내었다. 10ul/well 첨가 시에는 약 55%의 암세포 성장 억제효과를 나타내 각종 암세포 중에서 옻닭제품의 효과가 가장 큰 것으로 나타났다.
이상과 같이 옻을 세미, 노계, 오리에 적용한 옻닭 제품에 있어서도 강한 암세포성장 억제효과를 나타내었고 암세포 중에서도 대장암에 가장 효과적이었으며 다음은 간암 세포인 HepG2였다. 그러나 본 실험에 이용한 유방암 세포인 MCF7과 위암 세포인 SNU-1에서는 효과가 없었다. 또한 각 시료간에는 차이를 보이지 않은 점으로 보아 옻 제품에 나타난 이러한 효과들은 닭이나 오리에 의한 효과가 아니라 옻 그 자체의 효과인 것으로 판단되었다.



<옻닭 및 옻오리의 편이식품 개발 연구 보고서의 일부 인용>