◇ 미생물의 생장(growth) : 미생물 구성성분의 양적 증가와 구조 및 크기의 증가
- 세포의 무게와 크기의 증가 → 세포분열 → 세포 수 증가
- 개체생장 : 개체의 질량과 크기의 증가
- 집단생장(population growth) : 미생물 총수의 증가
A. 세포분열
◇ 이분법*(binary fission)에 의해 증식
* 이분법: 하나의 모세포가 두 개의 세포로 등분
① 세포 구성성분의 증가(DNA의 복제)
② 세포 핵 분열
③ DNA의 분열
④ 세포막의 내곡 형성
⑤ 횡막(transverse septum) 형성
⑥ 세포벽 형성 물질* 새로 생성
⑦ 두 개의 세포로 분리
* 증산 부위에 따라 →세균의 종류 다르다
- 그람 양성구균: 모체의 중앙 부위, 그람 음성간균: 모체의 여러 곳에 동시에 증산
B. 집단생장
◇ 집단생장
- 한 개의 세포가 분열 때마다 두 개의 세포 형성
- 2n, 즉 2의 지수적 비율로 증가
- 시간에 따른 세포 수의 증가: 대수적으로는 같은 성장 속도로 증가, 산술적으로는 급속 증가
- 최적환경에서 모든 단일 세포성 미생물: 대수학적 생장 (대수적인 생장의 예)
◇ 세대시간(generation time, doubling time, tg)
- 미생물 집단의 크기가 두 배로 증가하는데 걸리는 시간
- 단위시간에 일어나는 분열회수로 표시
* 일부 미생물의 세대시간
◇ 세대시간 계산식
- X0: 출발시간의 세포수, Xt:일정한 시간이 경과한 후 의 세포수, k: 단위시간에 일어난 분열회수, t: 세포수가 두 배로 되는데 필요한 시간
Xt = 2ktX0
log2Xt/X0 = kt (2의 대수로 표시)
k = (log2Xt - log2X0)/t
k = (log10Xt - log10X0)/0.301t (10의 대수로 표시)
tg = 1/k
◇ 예, 1,000 개의 세포가 5시간 후 100,000개로 증식
- k = (log10100,000 - log101,000)/(0.301 X 5) = (5-3)/1.505 = 1.33 → tg = 1/k = 60 min/1.33 = 45 min
C. 동기생장(Synchronous growth)
◇ 동기생장: 미생물 집단의 모든 개체가 동일한 양상의 생장과정을 거치는 것
- 어떤 특정한 효소가 얼마만큼 생산되며 세포의 유전적 과정 연구
→ 한 집단 안의 모든 세포들의 생장이 동시에 동일한 단게를 거치도록 조건을 구비
- 온도의 변화, 특정 영양성분의 공급제한, 미생물의 크기에 따라 분획하는 연속적 여과 등으로 유발
D. 생장곡선(Growth curve)
◇ 폐쇄상태*(closed system)에서의 집단성장
* 새로운 영양분 공급과 대사산물의 제거가 안 된 상태
- 여건이 허락하는 시간범위 안에서 대수적 증가
- 영양분 소모, 고갈되고 독성 대사산물의 축적 →생장률 점차로 저하 → 생장 멈추고 → 사멸
- 생장유도기, 대수증식기, 정지기, 사멸기로 구분
1) 생장유도기(Lag phase)
- 접종균이 새로운 환경에 적응하는 시기
- 성장에 필요한 효소나 세포 구성성분의 합성이 완비된 상태 X → 재합성이 이루어 질 때까지 걸리는 시기
- 대사가 왕성한 균: 유도기 짧다, 노후된 균: 유도기 길다
2) 대수증식기(Stationary phase)
- 세포의 수가 2의 지수적으로 증가하는 시기
- 미생물 세포의 증식이 활발
- 미생물의 생장률: 배지의 성분, 구비된 조건, 미생물의 종류에 따라 달라진다
3) 정지기(Stationary phase)
- 영양분의 고갈, 대사산물의 축적 시기
- 신생되는 세포의 수 = 사멸되는 세포의 수
- 생존 미생물의 수: 변동 없는 시기
4) 사멸기(Death phase)
- 사멸 세포수의 증가 → 생존 미생물의 수 감소 시기
- 미생물의 종류에 따라 사멸기의 기간 다르다
- 생균수 급격히 감소, 현탁도는 서서히 감소(사멸균의 용해(lysis) 까지 상당 시간 소요)
E. 미생물 생장의 측정
◇미생물의 생장 속도 측정: 생체량의 증가나 세포수의 증가 측정
- 대수증식기에서 미생물 집단의 생체량(biomass)과 세포수: 시간이 지남에 따라 일정 속도로 증가
◇ 세포수의 측정법
- 직접계수법(direct microscopic count), 생균수 측정법(viable count)
◇ 직접계수법
- 배양액의 일정량을 일정 넓이의 검경 면적위에 놓고(계수장치, counting chamber) 현미경으로 균수를 세는 것
* 페트로프-하우저(Petroff-Hausser) 계수기 (a)측면 (b)정면 (c)눈금 확대한 모양
- 사균과 생균의 구별 없이 시료속의 총 세균수 측정
- 시료가 액체이어야 함
- 신뢰도 높이기 위해 균체가 적어도 107/ml 이상이 되야 함
- 시료수가 많을 때 조작이 지루한 단점
- 조작이 쉽고 결과를 단시간에 얻을 수 있는 장점
- Coulter counter : 입자 계수기, 현미경 대신 전기 이용 → 세포현탁액이 미세유리관 통과할 때 관사이 흐르는 전류량 감소 측정을 기록(생균, 사균 모두 집계)
◇ 생균수 측정법
① 최확수(most probable number) 측정
- 시료를 충분히 희석 → 희석액 1 ml에 한 개의 세포가 들어가도록 → 일정량의 액체배지에 접종 → 배양 → 성장의 유무 기록 → 최확수 통계표에 의해 생균수 추정
- 수질 검사나 음료의 미생물 검사에 주로 이용
② 표면도말법(Spread plate method) (순수분리 및 배양방법참조)
- 적절히 희석된 시료의 일정량을 고체배지 표면에 균일하게 접종
③ 주입평판법(Pour plate method) (순수분리 및 배양방법참조)
- 적절히 희석된 시료의 일정량을 액상의 고체영양배지에 섞어 그 혼합물을 멸균된 평판접시에 붓는법
- 일정한 배양기간 후 →배지상의 집락(colony)수 계수 → 시료속의 균수 계산
- 배지상의 집락: 30~300 개 되도록 시료 희석
- 수일의 시간이 걸리는 단점
* 박막여과법 : 천공의 크기가 서로 다른 박박을 이용해 다른 미생물 여과, 박막 배양시간은 배지와 미생물의 종류에 따라 달라진다
- 박막에서 자란 집락 : (a)총균수 측정 위한 표준영양배지(집락 염색) (b)분변에 존재하는 대장균성 세균 (c)대장균성 세균이 금속성 녹색을 나타내는 m-Endo 한천배지 (d)효모와 곰팡이 배양을 위한 Wort 한천배지
◇ 생체량(biomass) 측정
- 배양액의 일정량 속에 있는 모든 세포의 습량(wet weight)이나 건량(dry weight)을 재는 것
- 시간이 많이 걸리고, 정밀한 검량이 어려운 단점
◇ 빛의 분산도(turbidity, 현탁도) 측정
- 현탁한 세포(cell suspension)에 의해 야기되는 빛의 분산도 측정 →생체량의 상대적 증가 관찰
- 세포의 현탁액 →광선 조사 → 세포 입자에 의한 광선의 분산 →투과된 광선 감소 → 투과된 광량 spectrophotometer(분광기)로 측정 →흡광도(absorbance, A*)로 표시
* A600 = 1.0 → 8 X 108 cell/ml
* Spectrophotometry의 원리
Io: incident light, I:transmitted light, T: transmittance
T = I/Io → %T = I/Io X 100
Lambert law : - log T = - log I/Io = A(bsorbance) = K1 X b
K1: constant, b: lenth of medium
Beer's law : - log I/Io = - log T = K2 X C
K2: constant, C: concentration of absorbing substance
Lambert-Beer law: - log I/Io = - log T = A = abc
a: extinction coefficient(K1,K2: constant)
b: 1 cm, a: L mol cm-1, c: mol/L
- 분산된 광량은 nephlometer(탁도기)로 측정 →분산도(klett 단위)로 표시
◇ 배양액의 생체량 증감의 상대적 평가법
- 미생물 집단의 총 단백질량, 총 질소량, 핵산양, ATP의 양 등 측정
- 미생물 집단의 생화학능력, 대사능력 평가
- 생균만 염색시키는 형광염료 사용 → 세포내에 결합된 형광염료의 양 측정(fluorospectrophotometry) → 상대적인 배양액의 생균성 평가
F. 생장과 영양분의 농도
◇ 영양분의 농도: 총 생장(total growth), 생장속도(growth rate)에 영향
- 일정한 영양분의 농도 범위안 → 생장속도와 총 생장 : 영양분 농도에 비례
- 일정 농도 이상 → 생장속도 일정 유지, 총 생장수확량만 변화
◇ 저농도의 영양분 : 생장수확량 적음
- 대사 합성에 요구되는 영양분의 양 < 세포막 통과 영양분의 양
◇ 영양분의 농도 > 한계 → 생장 속도 최대 → 생장수확량만 농도에 비례해 증가
G. 생장수율(Growth yield)
◇ 생명유지 에너지: 생명을 유지하기 위해 필요한 최소한의 에너지
- 생장 : 보다 많은 에너지 소모
◇ 생장수율: 소모된 영양분의 양과 생장 결과 얻어진 세포수확량 또는 생체량(cell yield, biomass)의 비율로 표시
- y = (X-XO)/C, X : 배양액의 생체량, XO : 접종 초기의 생체량, C : 제한영양분의 농도
◇ 생장수율의 측정
- 어떤 영양소에 대해서도 측정 가능
- 얻어진 생장수율 →배지속의 제한영양분의 농도 측정 가능 : 생측정 또는 생분석*(bioassay)
* 특정 제품속의 미량 함유 아미노산이나 비타민 등의 생장촉진물 검량에 많이 사용
- 생측정: 간단, 강도 높고, 방법의 독특성 높이 평가
◇ 에너지수율(YATP) = 세포수확량/ATP mole
- 세포수확량(cell yield) 또는 생체량(biomass) : 생장 결과 얻어진 값
- 에너지 수율: 한 분자의 ATP 소모에 의해 얻어진 세포수확량 또는 생체량
- 영양기질이 분해되는 과정에 따라 생성되는 ATP의 양은 다름
- 미생물의 YATP = 9~10 gram dry weight/ATP mole 로 일정
