허준의 본관은 양천, 자는 청원(淸源), 호는 구암(龜巖)이다. 경상도우수사를 지낸 허곤이 할아버지이며, 아버지는 무관으로 용천부사를 역임한 허론이다. 허론의 정실은 일직 손씨였으며 허준의 생모였던 영광 김씨는 소실이었다. 허준의 이복형 허옥은 임금의 신변보호와 궁궐수비를 책임지는 내금위에 있었고, 동생 허징은 서자이면서 문과에 급제하여 승문원 교검, 교리 등 내직을 지냈고 선조 때 영의정이었던 노수신의 사위가 되었다.
허준은 경기도 양천현 파릉리(현 강서구 등촌2동 능안마을)에서 태어났다. 비록 서자였지만 차별받지 않고 명문가 출신답게 좋은 교육을 받았으며 어릴적부터 경전과 사서 등에 밝았다. 허준이 형제들과 달리 어떤 계기로 의학을 연구하기 시작했는지는 알려지지 않았다. 유희춘의 《미암일기》에 의하면 1569년(선조 2) 이조판서 홍담에게 내의원에 천거해 주도록 부탁하였고, 1573년(선조 6)에 정3품 내의원정에 올랐다는 기록으로 보아 1569년 이후 내의원에 들어간 것으로 추정된다. 하지만《양천 허씨 세보》에는 1574년(선조 7) 의과에 급제하였다고 알려져 있어 두가지 설 모두 사실을 확인하기 어렵다.
1575년 명나라 의원으로 어의 안광익과 함께 선조를 진료하기 시작했으며, 1578년 내의원첨정이 되었다. 1587년 10월에는 태의 양예수 등과 함께 선조를 진료하여 건강이 좋아지자 호피를 상으로 받았다. 그리고 1590년에는 광해군의 두창을 치료하여 이듬해 당상관의 반열에 올랐다.
1592년 임진왜란의 발발로 선조가 의주로 피난갈 때 어의로서 선조 옆을 떠나지 않고 끝까지 모셨으며, 그 공으로 전쟁이 끝난 후 호종공신이 되었다. 1596년에는 광해군의 병을 고쳐 종2품의 가의대부가 제수되었고, 이때부터 선조의 명을 받아 양예수 등 여러 의원들과 함께 조선의 실정에 맞는 의서인 《동의보감》 편찬에 착수하였다. 그러나 정유재란의 발발로 의서 편찬이 어려워 보류되었다가 본격적인 편찬은 1600년부터 시작되었다. 이후 1601년 지중추부사로 승진하였고, 1604년 호성공신 3등에 책록되었으며, 1606년에는 양평군에 올라 정1품인 보국숭록대부로 승진하였으나 중인 신분으로는 과도한 벼슬이라 하여 대간들의 반대로 보류되기도 하였다.
1608년 선조가 승하하자 책임 어의로서 의주로 유배되었다가 바로 풀려나 광해군의 어의로서 왕의 측근에서 총애를 받았다. 그는 광해군 대에 주로 의서를 편찬하는데 많은 시간을 보냈다. 그 대표적인 것이 《동의보감》의 완성이다. 1610년 완성된 이 책은 총 25권 25책으로 당시 국내 의서인 《의방유취》·《향약집성방》·《의림촬요》를 비롯하여 중국측 의서 86종을 참고하여 편찬한 것이다. 내용은 내경·외형·잡병·탕액·침구 등 5편으로 구성된 백과전서로서 오늘날까지 애용된다. 이 책은 일본과 중국에까지 전해져 중국판 서문에는 ‘천하의 보(寶)를 천하와 함께한 것’이라 하였고, 일본판 발문에서는 ‘보민의 단경이요 의가의 비급’이라 평하고 있어 그 가치를 높이 평가하고 있다.
그는 또 《구급방》을 언해한 《언해구급방》 2권, 《창진집》을 개정하여 언해한 《언해두창집요》 2권, 노중례의 《태산요록》을 개편하여 언해한 《언해태산요집》을 비롯하여 《벽역신방》《신찬벽온방》《맥결집성》《찬도방론맥결집성》 등의 저술이 있다. 죽은 후 보국숭록대부에 추증되었다.