꿀벌의 장내 미생물 구조는 겨울과 여름에 따라 달라집니다

[우성(旴成) 평택]

꿀벌의 장내 미생물 구조는 겨울과 여름에 따라 다릅니다.

유럽 꿀벌인 아피스 멜리페라는 자연 생태계와 농업 생산에 중요한 수분 매개 종입니다[1].
서식지 손실, 살충제 노출, 높은 기생충 및 병원균 부하 등 다양한 요인으로 인해 꿀벌의 건강 상태가 위협받고 있습니다[2-4].
축적된 증거에 따르면 성체 꿀벌의 장내 미생물은 꿀벌 건강에 중요한 역할을 합니다 [5].
꿀벌 미생물은 장내에서 식이 화합물[6, 7]을 전환하고 단쇄 지방산[8]을 생산하며 숙주의 자당 반응성을 향상시키고[8] 면역 체계를 자극합니다[9, 10].
또한 항생제 치료, 살충제 노출 또는 식단 조작으로 장내 미생물 구성이 파괴되면 병원균 부하가 증가하여 숙주 사망률이 높아지는 것으로 알려져 있습니다[11-14].

꿀벌 장내 미생물의 놀라운 특징은 분류학적 복잡성이 낮다는 점입니다.
일벌의 경우, 장내 세균 세포의 95% 이상을 차지하는 10가지 미만의 계통(즉, 16S rRNA 유전자에서 97% 이상의 염기서열 동일성을 공유하는 균주 클러스터)이 군집을 형성하고 있습니다[5, 15-18].
이러한 계통형은 지리적 위치, 생애 단계 또는 계절에 관계없이 꿀벌에서 일관되게 발견되었으며[16, 19, 20], 둥지 동료 및 벌집 구성 요소와의 접촉을 통해 수평적으로 획득됩니다[21].

여기에는 일반적으로 모든 성체 일벌에 존재하는 5가지 핵심 계통형(길리아멜라, 스노드그라셀라, 락토바실러스 펌-4 및 펌-5, 비피도박테리움)과 군집 전체에 널리 퍼져 있지만 모든 벌에 반드시 존재하는 것은 아닌 프리쉘라, 바르토넬라, 코멘살리박터 또는 봄벨라와 같은 다수의 비핵심 계통형이 포함됩니다 [15].
락토바실러스 쿤케이, 아피박터, 세라티아 마르세센스 및 기타 장내 세균과를 포함한 추가적인 계통형이 발견되었지만 일반적으로 꿀벌 장내 미생물 총에서 상대적으로 적은 비율을 차지합니다[20].

이러한 많은 계통이 성체 일벌에 일관되게 존재하지만, 그 풍부함은 꿀벌마다 다를 수 있으며, 이는 숙주 생리에 영향을 미칠 수 있습니다.
특히, 먹이 사냥 시즌에 이용할 수 있는 영양소(예: 꽃가루와 꿀)의 종류와 양은 장내 미생물 구성에 큰 영향을 미칠 수 있으며 대사 활동을 변화시킬 수 있습니다[22].

마찬가지로, 여름과 겨울 동안 일벌의 뚜렷한 식습관이나 수명 변화도 장내 미생물 구성에 영향을 미칠 수 있습니다.
봄부터 가을까지 어린 일벌(수벌)은 벌집 안에 머물며 애벌레를 돌보고 영양이 풍부한 꽃가루를 먹는 반면, 나이든 일벌은 에너지 소모가 많은 비행에 연료를 공급하기 위해 꿀과 꿀을 먹는 먹이 사냥꾼이 됩니다[23].

늦가을에 새로 출현한 일벌은 수명이 길어지고(~6개월) 추운 겨울철에 무리가 없는 상태에서 군집 생존을 보장하는 겨울벌("디우티누스"라고도 함)이 됩니다[24].
이 꿀벌은 벌통 내부의 온도 조절을 위해 밀집된 군집을 형성하고, 꽃가루, 벌빵, 꿀 등의 먹이만 먹으며, 겨울 내내 배설물을 보관하기 때문에[25] 장내 미생물 생태계에 영향을 미칠 가능성이 높습니다.

여러 연구에서 다양한 일벌 유형 또는 계절에 따른 장내 미생물 군집 구성을 조사했으며, 전반적으로 군집 구성이 비교적 안정적이라는 결론을 내렸습니다 [19, 20, 26-28].
그러나 이전 연구는 대부분 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱을 사용하여 상대적 풍부도를 비교 분석하는 데 기반했습니다.
이러한 분석은 특히 미생물 부하가 샘플마다 크게 다른 경우 풍부도 변화의 정도나 방향성에 대한 통찰력을 제공할 수 없습니다 [29].

실제로 미생물 총량의 변화는 그 자체로 다양한 꿀벌 유형(예: 포식자, 내역벌, 겨울 꿀벌), 계절 또는 환경 노출의 중요한 특징이 될 수 있습니다.
예를 들어 꿀벌을 항생제에 실험적으로 노출시킨 결과, 상대적인 구성에는 큰 변화가 없었지만 박테리아 부하가 전반적으로 감소하여 꿀벌이 병원균 침입에 더 취약한 것으로 나타났습니다[11].

상대적 풍부도 데이터 사용의 한계 외에도 겨울 꿀벌의 장내 미생물에 대해서는 포식자나 간호자에 비해 알려진 것이 거의 없습니다. 겨울 꿀벌은 자원이 제한적이고 대부분의 군집 손실이 발생하는 추운 계절에 군집의 건강과 생존에 매우 중요하기 때문에 이는 놀라운 일입니다 [30, 31].

겨울 꿀벌의 장내 미생물을 특성화하고 군집 구성을 형성하는 요인을 파악하면 꿀벌이 온대 지역의 추운 계절에서 생존하는 데 필요한 생리적 적응을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 연구에서는 여왕벌, 외역봉, 겨울 꿀벌의 장내 미생물 군집의 차이를 평가하기 위해 qPCR과 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱을 사용했습니다.
2년에 걸쳐 단일 벌통에서 샘플링한 566마리의 일벌에서 주요 커뮤니티 구성원의 박테리아 부하를 분석했습니다.
그런 다음 분석을 전체 커뮤니티로 확장하고 14개의 다른 벌통에서 채집한 샘플을 분석하여 여러 벌통에서 유사한 커뮤니티 변화가 겨울 꿀벌에게 발생하는지 테스트했습니다. 마지막으로, 장내 미생물 구성의 차이에 대한 식단의 영향을 테스트하기 위해 노토바이오틱 꿀벌을 대상으로 실험을 진행했습니다.

연구 결과, 수벌, 포식자, 겨울 꿀벌의 장내 미생물 군집에서 총 박테리아 부하와 특정 장내 군집 구성원의 풍부도에 큰 차이가 있음을 밝혀내고 식이 꽃가루가 주요 기여 요인으로 밝혀졌습니다.


.....실험방법 및 과정은 중략.....


결과
2년 동안 모니터링한 꿀벌 군집에서 주요 미생물 군집의 박테리아 부하는 먹이 활동과 겨울철에 따라 다릅니다.

계절에 따른 일벌의 장내 미생물을 특성화하기 위해 단일 벌통에서 2년 동안 성충 일벌의 5가지 핵심(길리아멜라, 스노드그라셀라, 비피도박테리움, 락토바실러스 펌-4, 락토바실러스 펌-5) 및 2가지 비핵심(프리셀라와 바르토넬라, 보충 표 S1)의 총 풍부도를 추적했습니다. 분석에는 566개의 개별 꿀벌 샘플이 포함되었습니다.

핵심 구성원인 길리아멜라, 스노드그라셀라, 락토바실러스 펌-5, 비피도박테리움은 분석된 모든 벌에서 존재했으며, 핵심 구성원인 락토바실러스 펌-4는 전체 벌의 98.4%에서 검출되었습니다(보충 그림 S1a). 특히, 비핵심 구성원으로 지정된 두 개의 바르토넬라와 프리쉘라 역시 상대적으로 높은 유병률로 존재했으며, 각각 5.3%와 26.9%의 샘플에서만 검출 한계 이하의 신호를 보였습니다(보충 그림 S1b, c). 이전 결과와 일관되게, 프리쉘라 유병률은 식민지화 시 프리쉘라에 의해 유도되는 국소 멜라닌화 반응인 딱지 표현형(보충 그림 S2)의 존재와 밀접한 상관관계가 있었습니다[32].

모니터링된 계통형의 절대적 풍부도는 비핵심 구성원인 프리쉘라와 바르토넬라를 제외하고는 같은 시점에 샘플링된 꿀벌들 사이에서 거의 변하지 않았습니다(보충그림 S3).
그러나 모니터링된 모든 커뮤니티 구성원의 박테리아 풍부도에는 월별로 뚜렷한 차이가 있었습니다(공변량 분석 P = 1e-4).

특히, 두 해 모두 채집 기간과 겨울철에 채집한 꿀벌의 박테리아 부하에 현저한 차이가 있는 것을 관찰했습니다.
이는 개별 계통의 풍부도와 7가지 계통의 총 풍부도를 합산하여 추론한 총 박테리아 부하량에서 분명하게 드러났습니다(보충 그림 S3, 그림 1a).
특히, 모든 겨울 꿀벌을 포식자와 비교했을 때 핵심 구성원인 락토바실러스 펌-4, 락토바실러스 펌-5, 비피도박테리움과 비핵심 구성원인 바르토넬라의 수준이 10~100배 증가한 것을 발견했습니다(그림 1c, Permutation T-Test P = 1e-4).

또한 겨울철 꿀벌에서 스노드그라셀라 수치가 약간 증가하는 것을 관찰했지만(그림 1c, Permutation T-Test P = 6e-4), 길리아멜라 수치에는 차이가 없었습니다(그림 1c, Permutation T-Test P = 0.7). 프리쉘라는 겨울 꿀벌의 개체 수 감소라는 반대 경향을 보인 유일한 군집 구성원이었습니다(그림 1c, Permutation T-Test P = 1e-4). 전체 박테리아 부하는 7가지 계통 모두의 합산된 풍부도(그림 1c, Permutation T-Test P = 1e-4)와 샘플의 하위 집합에 대해 범용 16S rRNA 유전자 qPCR 프라이머로 측정한 총 16S rRNA 유전자 사본 수(그림 1d, Permutation T-Test, P = 1e-4)를 기준으로 겨울 꿀벌이 포식자보다 약 10배 더 많았습니다.

그림 1
2년 동안 모니터링한 단일 군집에서 장내 박테리아 군집은 포식기와 겨울철에 차이가 있습니다.
a 매월 모니터링한 7가지 계통의 샘플당 게놈 등가 수에 의해 결정된 qPCR로 평가한 절대적 풍부도의 월별 변화는 분석된 꿀벌의 평균값(±SE)으로 표시되어 있습니다. 월별 꿀벌 수는 플롯 하단에 표시되어 있습니다. 별표는 DNA 추출 실패로 인해 2015년 7월의 데이터가 누락되었음을 나타냅니다. 이중 별표는 해당 월에 군집의 여왕이 교체되었음을 나타냅니다. b 모니터링된 7가지 계통형을 기준으로 매월 샘플링된 꿀벌의 장내 미생물 군집의 상대적 커뮤니티 구성. c 게놈 등가물의 수에 따라 결정된 포식자(F) 및 겨울 꿀벌(W)의 장당 각 계통형의 절대적인 박테리아 풍부도입니다. 모니터링된 7가지 문형의 풍부도 합계도 플롯되어 있습니다. 평균값은 검은색 수평선으로 표시됩니다. 검출 가능한 수준의 꿀벌만 플롯되었습니다(꿀벌 수는 플롯 하단에 표시되어 있으며, 유병률은 보충 그림 S1 참조). d 분석된 달의 하위 집합(2015년 4월, 2015년 8월, 2015년 10월, 2016년 1월, 2016년 4월, 2016년 7월, 2016년 10월, 2017년 1월, 2017년 4월)의 장 샘플에서 16S rRNA 유전자의 복제본 수입니다. e 포식자 꿀벌(F)과 겨울 꿀벌(W)의 서로 다른 박테리아 계통형의 세포 수에서 계산된 유효 종 수. f 분석된 모든 꿀벌에서 모니터링된 계통형의 풍부도를 첫 번째 및 두 번째 주성분으로 투영하고 두 축에서 분리를 주도하는 변수를 나타내는 상관관계 벡터를 함께 투영했습니다. 쌍별 비교에는 순열 T-검정을 사용했습니다. ns, 유의하지 않음; ***P <0.001.






모니터링된 계통이 일반적으로 꿀벌 장내에 존재하는 박테리아의 대부분을 구성한다는 점을 고려하여, 저희는 추가적인 비표적 구성원의 존재 가능성을 무시하고 데이터를 기반으로 커뮤니티의 상대적 구성을 분석했습니다.
두 해 모두 겨울 꿀벌의 커뮤니티는 주로 락토바실러스 펌-5와 바르토넬라가 지배적이었습니다.
이와 대조적으로, 채집 꿀벌은 더 고른 군집 구성을 보이는 것으로 나타났습니다(그림 1b).
겨울 꿀벌에서 락토바실러스 펌-5와 바르토넬라의 우세는 유효 종 수에 의해 결정된 바와 같이 포식자 꿀벌에 비해 겨울 꿀벌의 α-다양성이 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1e, Permutation T-Test, P = 1e-4). 또한, 주성분 분석 결과 주성분 1(PC1)을 따라 포식자와 겨울 꿀벌이 명확하게 분리된 것으로 나타났습니다(그림 1f, MANOVA Wilks = 0.6, F(7,392) = 39.4, P < 2.2e-4). 이러한 분리는 주로 락토바실러스 펌-4, 락토바실러스 펌-5, 바르토넬라, 비피도박테리움에 의해 주도되었는데, 이 네 가지 계통은 두 종류의 꿀벌 사이에 가장 큰 차이를 보였습니다(그림 1c).

이러한 결과를 종합하면 겨울 꿀벌과 포식자의 장내 미생물총은 모니터링 벌통에서 총 박테리아 풍부도와 개별 미생물총 구성원의 수준 모두에서 서로 현저하게 다르다는 것을 알 수 있습니다.

식민지 전체에 걸쳐 포식자, 내역벌, 겨울 꿀벌 간의 박테리아 부하와 커뮤니티 구성에 일관된 차이가 있음

모니터링한 벌통에서 포식자와 겨울 벌 사이의 박테리아 부하량 차이가 관찰됨에 따라 이후 1년 동안 14개의 다른 벌통에서 유사한 패턴이 나타나는지 확인했습니다.
포식자와 겨울 꿀벌 외에도 수벌도 분석하여 포식자와 겨울 꿀벌 간의 미생물군 차이가 계절적 변화와 관련이 있는지, 아니면 행동이나 식습관의 차이와 관련이 있는지 파악했습니다. 또한, 꿀벌 장내 미생물의 전체 커뮤니티로 분석을 확장하기 위해 qPCR 접근법과 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱을 결합했습니다.

범용 16S rRNA qPCR을 수행한 결과, 샘플링된 벌통에서 세 가지 꿀벌 유형에 따라 총 박테리아 부하가 다르다는 것을 발견했습니다.
겨울 꿀벌과 수벌 모두 포식자보다 박테리아 부하가 더 높았으며(그림 2a, 공변량 분산분석 P = 1e-4, 투키 HSD 테스트 결과, 각각 P = 5.1e-9 및 1.66e-6), 단일 벌통에서 얻은 이전 결과를 확인했습니다. 겨울 꿀벌은 수벌보다 박테리아 부하가 더 높은 경향을 보였지만 이 차이는 통계적으로 유의미하지 않았습니다(그림 2a, 공변량 분석(Permutation ANOVA) 후 투키 HSD 테스트, P = 0.224).

그림 2
박테리아 부하와 군집 구성은 14개 군집에서 포식자, 수벌, 겨울 꿀벌 간에 차이가 있습니다.
a 14개의 다른 식민지에서 수집한 장 샘플에서 확인된 포식자, 간호사, 겨울 꿀벌의 장당 평균 16S rRNA 유전자 카피 수. b α-다양성의 차이, 즉., 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱을 기반으로 한 포식자, 간호사 및 겨울 꿀벌의 장내 미생물 군집에서 유효 종 수. c 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱을 기반으로 한 포식자, 간호사 및 겨울 꿀벌의 장내 군집에 대한 Bray-Curtis 차이에 기반한 NMDS. d 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱으로 결정된 장내 미생물의 상대적 군집 구성. 커뮤니티의 대부분을 구성하는 qPCR(그림 1 및 보충 그림 S4 참조)로 모니터링한 7개의 계통형은 범례에서 회색 상자로 강조 표시되어 있습니다.
누적된 막대 아래의 대문자는 출처 벌통을 나타냅니다.
e 각 계통형의 상대적 풍부도에 총 16S rRNA 유전자 카피 수를 곱하여 계산한 장당 게놈 등가물 수를 기준으로 결정된 벌통 전체에서 포식자(F), 간호사(N), 겨울벌(W)의 7가지 주요 계통형 각각에 대한 절대적 풍부도입니다.
f 각 계통형의 상대적 풍부도에 총 16S rRNA 유전자 카피 수를 곱하여 계산한 장당 게놈 등가물의 수를 기준으로 결정된 벌통 전체에서 포식자(F), 간호사(N), 겨울벌(W)의 소공동체 구성원 하위 집합의 절대적 풍부도.
<LOD, 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱의 검출 한계 미만, 즉 해당 샘플에서 특정 분류군에 대한 판독이 획득되지 않았음을 의미합니다.
LOD 위의 샘플의 평균값은 검은색 가로선으로 표시됩니다.
나머지 계통의 절대적 풍부도는 보충 그림 S4b에 나와 있습니다. 같은 문자로 연결되지 않은 a, b, e, f 레벨(꿀벌 유형)은 분산분석(ANOVA)에 이어 투키의 HSD 테스트를 실시한 결과 유의미한 차이를 보였습니다(보충 표 S3 참조).



16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱은 42개 샘플에서 70개의 앰플리콘 시퀀스 변이를 산출했으며, 품질 및 풍부도 필터링 후 샘플당 최소 26,993개의 판독을 수행했습니다(자세한 내용은 방법 및 부록 표 S6 참조).
이러한 염기서열 변이는 이전 연구에서 정의한 대로 꿀벌 장내 미생물의 주요 계통에 할당하여 추가로 클러스터링하여 28개의 운영 분류 단위(OTU)를 도출했습니다. 총 박테리아 부하의 차이를 설명하기 위해 커뮤니티에서의 비율, 게놈의 rRNA 유전자좌 수, 샘플당 총 박테리아 부하에 따라 각 OTU의 절대적인 풍부도를 계산했습니다.

앰플리콘 시퀀싱 데이터의 다양성 분석 결과, 세 가지 꿀벌 유형 간에 커뮤니티 구성에 현저한 차이가 있는 것으로 나타났습니다. 겨울 꿀벌의 α-다양성이 포식자 및 간호사 꿀벌에 비해 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다(유효 종 수에 따라 결정된 ANOVA F(16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱은 42개 샘플에서 70개의 앰플리콘 시퀀스 변이를 산출했으며, 품질 및 풍부도 필터링 후 샘플당 최소 26,993개의 판독을 수행했습니다(자세한 내용은 방법 및 부록 표 S6 참조).

이러한 염기서열 변이는 이전 연구에서 정의한 대로 꿀벌 장내 미생물의 주요 계통에 할당하여 추가로 클러스터링하여 28개의 운영 분류 단위(OTU)를 도출했습니다. 총 박테리아 부하의 차이를 설명하기 위해 커뮤니티에서의 비율, 게놈의 rRNA 유전자좌 수, 샘플당 총 박테리아 부하에 따라 각 OTU의 절대적인 풍부도를 계산했습니다.

앰플리콘 시퀀싱 데이터의 다양성 분석 결과, 세 가지 꿀벌 유형 간에 커뮤니티 구성에 현저한 차이가 있는 것으로 나타났습니다. 겨울 꿀벌의 α-다양성이 포식자 및 간호사 꿀벌에 비해 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다(유효 종 수에 따라 결정된 ANOVA F(2,39) = 35.9, P = 1.60e-9, 모든 비교에서 Tukey HSD 테스트 P < 0.005, 그림 2b). 이것은 이 꿀벌의 장내 군집이 덜 풍부하고 덜 균일하다는 것을 나타냅니다.

또한, 브레이-커티스 불일치를 기반으로 한 비계량 다차원 스케일링(NMDS)은 꿀벌 유형에 따라 샘플이 크게 분리되는 것으로 나타났는데, 이는 수벌, 포식자, 겨울 꿀벌의 커뮤니티가 서로 다르다는 것을 나타냅니다(그림 2c). 일관되게, Bray-Curtis에 대한 ADONIS의 차이는 꿀벌 유형에 따라 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다(P = 0.001). 군집 구조의 차이는 샘플 전체에서 다른 분류군의 상대적 비율에서도 분명하게 나타났는데, 겨울 꿀벌은 먹이 사냥꾼과 간호사 꿀벌에 비해 스노드그라셀라와 프리쉘라의 상대적 풍부도가 뚜렷하게 감소하고 바르토넬라와 코멘살리박터가 증가했습니다(그림 2d). 그러나 간호사, 포식자, 겨울 꿀벌 간의 커뮤니티 분산에는 차이가 없었습니다. Bray-Curtis 차이에 근거한 집단 중심까지의 거리는 꿀벌 유형 간에 차이가 없었습니다(Permutest F(2,39) = 0.41, P = 0.68) (보충 그림 4a). 따라서 세 가지 꿀벌 유형의 장내 군집은 서로 다르지만 서로 비슷하게 가변적인 것으로 보입니다.

다음으로 생태계 변화의 방향성을 밝히기 위해 개별 생태계 구성원의 절대적 풍부도의 차이를 평가했습니다. 먼저 2년에 걸쳐 qPCR로 모니터링한 7개의 계통형을 살펴보았습니다(그림 2e). 이전 결과(그림 1c)와 마찬가지로 비피도박테리움, 락토바실러스 펌-4, 락토바실러스 펌-5, 바르토넬라는 수치가 증가한 반면(세 그룹에 대한 공변량 분석(Permutation ANOVA) P = 1e-4, 투키 HSD 테스트, P < 2e-4), 프리셀라는 겨울 꿀벌에서 수치가 감소했습니다(그림 2e, 공변량 분석(Permutation ANOVA) p = 2e-04, 투키 HSD 테스트(Tukey HSD) P = 2.79e-3). 2년 샘플링 결과와 일치하지 않는 풍부도 패턴을 보인 유일한 두 가지 계통형은 스노드그라셀라와 길리아멜라였습니다. 스노드그라셀라는 절대적 풍부도에 차이가 없었으며(그림 2e, 공변량 분석 P = 1.87e-1), 이는 상대적 커뮤니티 구성(그림 2d)을 살펴볼 때 발견되는 커뮤니티의 비례적 변화가 반드시 풍부도의 변화를 의미하지는 않음을 보여줍니다.

수벌과 겨울벌을 비교했을 때, 절대적인 개체수에서 차이를 보인 것은 바르토넬라와 프리쉘라뿐이었습니다. 바르토넬라는 수치가 현저하게 증가한 반면, 프리쉘라는 겨울 꿀벌의 개체 수가 간호 꿀벌에 비해 감소했습니다(그림 2e). 그림과 같이 월별 샘플링에 사용된 계통 특이적 프라이머로 동일한 샘플에 대해 qPCR을 수행하여 이러한 변화를 확인했습니다. 11 (보충 그림 S5). 앰플리콘 시퀀싱 데이터에서는 나타나지 않았지만 qPCR에서는 꿀벌과 겨울 꿀벌 사이에 유의미한 차이를 보인 락토바실러스 펌-5를 제외하고는 두 접근법의 결과가 놀랍게도 일치하여 꿀벌, 포식자, 겨울 꿀벌의 미생물총이 이 7가지 주요 커뮤니티 구성원의 구성에서 현저하게 다르다는 결론을 확증해 주었습니다.2,39) = 35.9, P = 1.60e-9, 모든 비교에서 Tukey HSD 테스트 P < 0.005, 그림 2b). 이것은 이 꿀벌의 장내 군집이 덜 풍부하고 덜 균일하다는 것을 나타냅니다. 또한, 브레이-커티스 불일치를 기반으로 한 비계량 다차원 스케일링(NMDS)은 꿀벌 유형에 따라 샘플이 크게 분리되는 것으로 나타났는데, 이는 수벌, 포식자, 겨울 꿀벌의 커뮤니티가 서로 다르다는 것을 나타냅니다(그림 2c). 일관되게, Bray-Curtis에 대한 ADONIS의 차이는 꿀벌 유형에 따라 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다(P = 0.001).

군집 구조의 차이는 샘플 전체에서 다른 분류군의 상대적 비율에서도 분명하게 나타났는데, 겨울 꿀벌은 먹이 사냥꾼과 간호사 꿀벌에 비해 스노드그라셀라와 프리쉘라의 상대적 풍부도가 뚜렷하게 감소하고 바르토넬라와 코멘살리박터가 증가했습니다(그림 2d). 그러나 간호사, 포식자, 겨울 꿀벌 간의 커뮤니티 분산에는 차이가 없었습니다. Bray-Curtis 차이에 근거한 집단 중심까지의 거리는 꿀벌 유형 간에 차이가 없었습니다(Permutest F(2,39) = 0.41, P = 0.68) (보충 그림 4a). 따라서 세 가지 꿀벌 유형의 장내 군집은 서로 다르지만 서로 비슷하게 가변적인 것으로 보입니다.

다음으로 생태계 변화의 방향성을 밝히기 위해 개별 생태계 구성원의 절대적 풍부도의 차이를 평가했습니다. 먼저 2년에 걸쳐 qPCR로 모니터링한 7개의 계통형을 살펴보았습니다(그림 2e). 이전 결과(그림 1c)와 마찬가지로 비피도박테리움, 락토바실러스 펌-4, 락토바실러스 펌-5, 바르토넬라는 수치가 증가한 반면(세 그룹에 대한 공변량 분석(Permutation ANOVA) P = 1e-4, 투키 HSD 테스트, P < 2e-4), 프리셀라는 겨울 꿀벌에서 수치가 감소했습니다(그림 2e, 공변량 분석(Permutation ANOVA) p = 2e-04, 투키 HSD 테스트(Tukey HSD) P = 2.79e-3).

2년 샘플링 결과와 일치하지 않는 풍부도 패턴을 보인 유일한 두 가지 계통형은 스노드그라셀라와 길리아멜라였습니다. 스노드그라셀라는 절대적 풍부도에 차이가 없었으며(그림 2e, 공변량 분석 P = 1.87e-1), 이는 상대적 커뮤니티 구성(그림 2d)을 살펴볼 때 발견되는 커뮤니티의 비례적 변화가 반드시 풍부도의 변화를 의미하지는 않음을 보여줍니다. 수벌과 겨울벌을 비교했을 때, 절대적인 개체수에서 차이를 보인 것은 바르토넬라와 프리쉘라뿐이었습니다.

바르토넬라는 수치가 현저하게 증가한 반면, 프리쉘라는 겨울 꿀벌의 개체 수가 간호 꿀벌에 비해 감소했습니다(그림 2e). 그림과 같이 월별 샘플링에 사용된 계통 특이적 프라이머로 동일한 샘플에 대해 qPCR을 수행하여 이러한 변화를 확인했습니다. 11 (보충 그림 S5). 앰플리콘 시퀀싱 데이터에서는 나타나지 않았지만 qPCR에서는 꿀벌과 겨울 꿀벌 사이에 유의미한 차이를 보인 락토바실러스 펌-5를 제외하고는 두 접근법의 결과가 놀랍게도 일치하여 꿀벌, 포식자, 겨울 꿀벌의 미생물총이 이 7가지 주요 커뮤니티 구성원의 구성에서 현저하게 다르다는 결론을 확증해 주었습니다.

또한 단일 벌통에서 2년간 샘플링하는 동안 qPCR로 평가한 것 이외의 커뮤니티 구성원의 풍부도 변화도 살펴봤습니다(그림 2f 및 보충 그림 S4b). 예상대로 다른 박테리아는 전체 커뮤니티에서 상대적으로 적은 비율(4~25%)을 차지했으며, 가장 널리 퍼진 박테리아(풀링된 장 샘플의 100%)와 가장 풍부한 박테리아(커뮤니티의 2~14%)는 커멘살리박터(Commensalibacter)였습니다. 또한 Commensalibacter는 포식자 및 간호자에 비해 겨울 꿀벌이 유의미하게 증가한 유일한 추가 커뮤니티 구성원이었습니다(Permutation ANOVA P = 1e-04, Tukey HSD 테스트 P = 7.68e-08). 이와 대조적으로, 다른 모든 추가 커뮤니티 구성원은 샘플의 일부에서만 발견되었으며 상대적으로 낮은 농도로 발견되어 기회주의적이거나 일시적인 식민지 개척자라는 것을 시사합니다.

또한, 이러한 커뮤니티 구성원 중 다수는 포식자 및 간호사보다 겨울 꿀벌에서 더 낮은 유병률 및/또는 풍부함을 보이는 경향을 보였습니다(그림 2f). 예를 들어, 아피박터는 모든 포식자 및 간호사 샘플에서 검출되었지만, 겨울 꿀벌에서는 14개의 샘플 벌통 중 5개에서만 검출되었으며 포식자 및 간호사보다 낮은 수준에서 검출되었습니다(순열 ANOVA P = 1e-04, 투키 HSD 테스트 P < 2e-8). 마찬가지로 락토바실러스 쿤케이는 일부 벌통의 수벌과 포식자에서 검출되었지만, 겨울철에는 어떤 벌통에서도 검출되지 않았습니다. 이러한 차이는 포식자와 수벌에 비해 겨울철 꿀벌의 α-다양성이 감소한 원인일 가능성이 높습니다. 흥미롭게도, 몇몇 장내 세균과(Klebsiella, Pantoea, Serratia, 또는 Tatumella)는 수벌 샘플에서는 만연했지만 거의 모든 포식자 및 겨울 벌 샘플에서는 발견되지 않아(그림 2f 및 보충 그림 S4b), 이러한 세균이 수벌과 특정 연관성이 있음을 시사합니다.

이러한 결과를 종합해 볼 때, 벌통 전체에 걸쳐 겨울 꿀벌과 일벌은 포식자에 비해 박테리아 부하가 증가했으며, 겨울 꿀벌은 특히 바르토넬라와 코멘살리박터 수치가 높지만 기회주의적 식민지화균은 낮은 것으로 나타났습니다.

꽃가루 먹이는 노토바이오틱 꿀벌의 장내 군집 크기를 증가시킵니다.

겨울 꿀벌, 포식자, 간호사 사이에서 관찰된 박테리아 부하와 커뮤니티 구성의 차이의 원인 중 하나는 식이 때문일 수 있습니다. 해부한 내장을 육안으로 관찰한 결과 세 종류의 꿀벌 간의 식이 차이가 분명하게 나타났습니다(그림 3a-c). 겨울 꿀벌과 수벌의 직장은 꽃가루가 있음을 나타내는 노란색으로 보였고, 포식자의 직장은 반투명했습니다. 또한 내장의 젖은 무게는 세 종류의 꿀벌 간에 유의미한 차이가 있었으며(ANOVA F(2,68) = 24.13, P = 1.21e-8), 포식자는 간호사(Tukey HSD 테스트 P = 1.14e-6)와 겨울 꿀벌(Tukey HSD 테스트 P = 6.81e-8)보다 평균 2배 가벼운 내장을 가졌습니다(그림 3d). 장 무게의 함수로 정규화된 16S rRNA 유전자 복제 수를 플롯했을 때, 장 무게는 세 가지 꿀벌 유형에 걸쳐 총 미생물 총량과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다(그림 3e).

그림 3
식단은 꿀벌의 장내 미생물을 형성하는 주요 요인입니다.
a-c 작물(c)(일부 샘플에서 누락됨), 중장(m), 회장(i), 침이 부착된 직장(r)과 마지막 복부 터지트로 구성된 포식자(a), 간호사(b), 겨울벌(c)의 해부된 내장. d 개별 포식자(F), 간호사(N), 겨울벌(W)의 젖은 내장 무게. 다른 글자는 분산분석(ANOVA)과 투키의 HSD 테스트에 따라 서로 유의하게 다른 그룹을 나타냅니다(자세한 내용은 보충 표 S4 참조). e 모든 꿀벌 유형에서 장 무게와 박테리아 부하 사이의 스피어만 상관관계(범용 박테리아 16S rRNA 프라이머를 사용하여 평가).

회색 영역은 95% 신뢰 구간을 나타냅니다. f 설탕물(SW) 또는 설탕물과 꽃가루(SW+P)를 먹인 실험적으로 군집화된 꿀벌의 젖은 장 무게. g 군집화된 꿀벌의 두 처리 그룹에서 장 무게와 세균 부하 사이의 스피어만 상관관계(범용 세균 16S rRNA 유전자 프라이머로 평가). h 군집화된 꿀벌의 두 처리 그룹에서 모니터링된 7가지 계통형의 총 풍부도는 계통형별 qPCR 프라이머를 사용하여 장당 게놈 등가로 결정합니다. 모니터링한 7가지 계통의 풍부도 합계도 표시되어 있습니다.

qPCR 방법의 검출 한계(<LOD) 미만의 박테리아 부하를 가진 꿀벌은 축의 104번 컷 아래에 표시되어 있습니다. 두 그룹 비교는 순열 T-검정으로 수행되었습니다. ns, 유의하지 않음; ***P <0.001



꽃가루 식단이 꿀벌의 박테리아 부하 증가와 직접적으로 관련이 있음을 입증하기 위해, 새로 태어난 꿀벌에 꿀벌 장내 미생물의 7가지 주요 박테리아 계통을 대표하는 11가지 박테리아 균주 군집을 실험적으로 집락화했습니다[6].
군집화된 꿀벌을 10일 동안 실험실에 보관하고 멸균 설탕물과 꽃가루(SW+P 처리) 또는 설탕물만(SW 처리)을 무제한으로 먹였습니다.

그 결과 두 처리 간에 장 무게에 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(그림 3f, 웰치 T-검정 t = 9.433, P = 1.452e-11). SW 처리 꿀벌의 장 무게는 먹이식물 꿀벌의 장 무게와 비슷했지만, SW+P 처리 꿀벌의 장 무게는 겨울 꿀벌의 장 무게를 능가하는 현저히 높은 수치를 보였습니다(그림 3d, f). 실험실에서 실험적으로 군집을 형성한 꿀벌(그림 3g)과 벌통에서 샘플링한 일반 일벌(그림 3e) 모두에서 장 무게와 미생물군 풍부도 사이에 양의 상관관계가 있는 것으로 관찰되었습니다.

또한, 두 실험 처리 간에 개별 군집 구성원의 박테리아 부하의 차이는 간호사, 포식자, 겨울 꿀벌 사이에서 발견되는 차이를 상당 부분 반영했습니다. 대부분의 계통은 설탕물만 먹인 꿀벌에 비해 꽃가루를 먹인 꿀벌에서 더 풍부했습니다(그림 3h, 통계는 부록 표 S4 참조). 두 가지 예외는 바르토넬라와 프리쉘라였습니다. 바르토넬라균은 두 실험 처리 간에 비슷한 수준을 보였지만(그림 3h), 겨울 꿀벌과 수벌에서 포식자에 비해 더 풍부하게 발견되었습니다(그림 2a). 특히, 꽃가루가 없을 때 바르토넬라는 전체 꿀벌의 75%만 군집을 형성할 수 있었습니다.

장내 식민지화를 위한 꽃가루 의존도는 프리쉘라에서 훨씬 더 두드러졌습니다. SW 처리를 통해 실험적으로 군집을 형성한 꿀벌의 50% 미만에서 검출 가능한 수준의 프리쉘라가 검출되었으며, 군집을 형성한 꿀벌의 부하량은 상대적으로 낮았습니다. 이와 대조적으로, SW+P 처리의 꿀벌은 모두 군집을 형성했으며 상대적으로 높고 일관된 프리쉘라 부하를 보였습니다(그림 3h).

이러한 결과를 종합하면 꽃가루 식단이 장내 무게와 전반적인 박테리아 부하를 증가시켜 포식자, 간호사, 겨울 꿀벌 사이에서 관찰된 부하 차이의 일부를 그럴듯하게 설명할 수 있음을 보여줍니다.


토론

여기에서는 성체 일벌의 장내 미생물이 수벌, 외역벌, 겨울벌에 따라 현저하게 다르다는 것을 보여주기 위해 qPCR과 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱을 결합한 접근법을 사용했습니다. 일벌과 겨울벌은 포식자보다 장내에 더 많은 수의 박테리아를 보유하고 있었으며, 프리쉘라(Frischella)와 스노드그라셀라(Snodgrassella)를 제외한 대부분의 우세한 군집 구성원이 박테리아 부하 증가에 기여하고 있었습니다.

겨울 꿀벌은 세 가지 꿀벌 유형 중 α-다양성이 가장 낮았는데, 이는 아피박터, 봄벨라, L. 쿤케이와 같은 기회주의적 식민지화자가 더 적기 때문으로 설명할 수 있습니다. 또한, 겨울 꿀벌에서는 높은 수준의 바르토넬라균과 코멘살리박터균으로 특징적인 변화가 관찰되었습니다. 이러한 군집 구조의 차이는 14개의 서로 다른 군집과 3개의 서로 다른 해에 걸쳐 발견되었으며, 이는 겨울 꿀벌의 미생물 군집의 '재구성'이 서부 스위스 군집에서 보존된 특징임을 시사합니다.

꽃 다양성의 지역적 차이[22] 또는 기후가 이 패턴에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 이 패턴의 보존 여부를 테스트하기 위해 다른 지역의 겨울 꿀벌에 대한 추가 조사가 필요합니다. 최근 독일에서 실시된 겨울철 보충 사료의 효과에 대한 연구에 따르면 겨울철 꿀벌의 경우 특정 군집 구성원(예: 락토바실러스 펌-5 및 바르토넬라)의 상대적 풍부도가 포식자에 비해 증가하여[19] 군집이 현저하게 변화하는 것으로 나타났습니다. 이번 연구 결과에서도 겨울 꿀벌의 프리쉘라 수치가 먹이벌에 비해 현저히 낮았다는 점에서 우리의 연구 결과와 일치했습니다. 그러나 이 이전 연구는 상대적 풍부도 데이터, 즉 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱만을 기반으로 했습니다.

16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱과 달리, qPCR은 박테리아의 절대적 풍부도에 대한 정보를 제공하며 개별 커뮤니티 구성원이 샘플 전체에서 박테리아 세포 수가 증가, 감소 또는 동일하게 유지되는지 여부를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 저희 연구에서 겨울 꿀벌은 포식자 및 간호자에 비해 스노드그라셀라의 상대적 풍부도가 감소했습니다(그림 2d).

그러나 이 효과는 총 스노드그라셀라 개체 수의 감소 때문이 아니라 qPCR로 확인된 다른 커뮤니티 구성원이 증가했기 때문이었습니다.
실제로 포식자, 간호사, 겨울 꿀벌의 총 스노드그라셀라 개체 수는 동일하게 유지되었습니다(그림 2e). 이러한 정량적 마이크로바이옴 프로파일링 접근법은 이전에 인간 마이크로바이옴 [29] 또는 애벌레의 마이크로바이옴 [47]에서 입증된 것처럼 장내 세균과 숙주 사이의 중요한 연관성을 밝혀낼 수 있습니다.

우리는 미생물 군집을 분석할 때 상대적 풍부도가 아닌 절대적 풍부도의 변화가 특정 박테리아가 환경에 미치는 영향을 변화시킬 수 있으므로 절대적 풍부도를 일상적으로 평가해야 한다고 주장합니다. 특히, qPCR은 표적화된 접근 방식이므로 해당 프라이머가 설계된 특정 커뮤니티 구성원만 정량화하거나 범용 프라이머를 사용하여 박테리아의 총량을 평가할 수 있습니다. 따라서 미생물 군집의 양과 변화의 방향성에 대한 정보를 제공하기 때문에 qPCR(또는 유세포 분석과 같은 다른 정량적 방법)과 상대적 구성 분석(예: 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱 또는 샷건 메타게놈학)을 결합한 접근 방식이 선호됩니다.

겨울철 꿀벌, 수벌, 포식자에서 관찰되는 박테리아 부하와 커뮤니티 구성의 변화는 무엇에 의해 유발될까요?

한 가지 가능한 설명은 분석된 꿀벌 유형 간의 식이 차이일 수 있습니다. 포식자는 주로 꿀과 꿀을 먹지만, 수벌과 겨울 꿀벌은 꽃가루도 섭취합니다[48]. 이러한 식이 차이는 우리 연구에서도 분명하게 나타났는데, 포식자, 간호사, 겨울 꿀벌의 해부된 내장의 모양과 무게에서 일관된 변화를 발견했기 때문입니다(그림 3a-c). 놀랍게도, 미생물 군집이 고갈된 꿀벌을 대상으로 박테리아 군집을 실험한 결과, 먹이에 포함된 꽃가루가 장 무게와 박테리아 부하를 겨울 꿀벌과 비슷한 수준으로 크게 증가시키는 것으로 나타났습니다. 반면, 설탕물만 먹은 꿀벌의 박테리아 수치는 먹이를 먹는 꿀벌과 더 비슷했습니다(그림 3f-h).

따라서 우리는 식단이 일벌 유형 간에 관찰된 많은 차이를 설명할 수 있는 중요한 요소라는 결론을 내렸습니다.

야생 설치류 개체군[49]과 인간[50, 51]의 장내 미생물 구성의 계절적 변화도 식이 변화와 일치하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 식이 선호도가 광범위한 동물에 걸쳐 커뮤니티 차이의 주요 동인이라는 일반적인 개념과 일치합니다[52-54].

꿀벌의 경우, 장내 음식물의 양이 많을수록 장내 미생물의 수용 능력이 증가할 가능성이 높습니다. 또한 꽃가루는 꿀, 꿀, 자당보다 영양분이 풍부하여 장내 박테리아에 더 다양한 대사 틈새를 제공합니다. 두 가지 요인 모두 설탕물만 먹은 꿀벌에 비해 꽃가루를 먹은 꿀벌의 박테리아 부하가 증가하는 데 기여하는 것으로 보입니다. 최근 생쥐와 파리 모델에 대한 보고에 따르면 영양이 풍부하고 특히 단백질의 양이 증가하면 미생물총의 전반적인 풍부도는 증가하지만 α-다양성은 감소하는 것으로 나타났습니다[55, 56].

이는 꽃가루를 먹이로 하는 꿀벌과 겨울 꿀벌에서 박테리아 부하가 증가하고 유효 종의 수가 감소하는 것을 관찰했기 때문에 우리의 연구 결과가 뒷받침합니다(그림 2a, b). 일관되게 총 풍부도가 증가한 대부분의 계통(락토바실러스 펌-5, 락토바실러스 펌-4, 비피도박테리움, 바르토넬라)은 꿀벌이 배변할 때까지 꽃가루가 축적되는 뒷창자의 마지막 부분인 직장에 위치해 있습니다.

이에 따라 이전 보고에 따르면 꽃가루 섭취 시 직장에서 총 박테리아와 특정 개별 계통(락토바실러스 펌-5, 비피도박테리움)의 양이 증가하는 것으로 나타났습니다[57]. 그러나 이러한 증가는 연령에 따라 달라졌으며, 저장 꽃가루 대신 오토클레이브 꽃가루를 사용했을 때는 유의하지 않았습니다 [57].

본 연구와 달리, 실험 꿀벌은 정의된 박테리아 군집에 의해 접종되지 않았으며[57], 이는 군집 성장과 역학에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 전반적으로, 특정 실험적 차이에도 불구하고 우리의 결과는 이전에 발표된 데이터와 일치하는 것으로 보입니다.

그러나 겨울 꿀벌에서 관찰된 모든 변화가 우리의 군집화 실험에서 요약될 수 있는 것은 아닙니다.
예를 들어, 꽃가루를 먹이거나 먹이지 않은 실험 꿀벌(그림 3h)에서는 포식자, 간호사, 겨울 꿀벌 사이의 바르토넬라 수치에서 관찰된 차이(그림 2e)가 관찰되지 않았습니다. 또 다른 예는 프리쉘라입니다. 이 박테리아는 포식자나 내역벌보다 겨울 꿀벌에서 덜 풍부했지만, 프리쉘라의 식민지화 성공 여부는 실험 꿀벌의 꽃가루 존재 여부에 크게 의존했습니다. 이는 다른 요인이 겨울 꿀벌의 군집 차이에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.

겨울 꿀벌은 평균 수명이 ∼6개월로 여름 꿀벌(즉, 간호사 및 포식자)의 경우 ∼4주에 비해 수명이 더 길다[58]. 대조적으로, 식민지화 실험의 꿀벌은 연령이 일치하고 출현 후 10일 후에 샘플링되었습니다. 초파리인 초파리(Drosophila melanogaster)에서는 장의 물리화학적 상태가 나이에 따라 변화하여 주로 특정 장내 세균 분류군의 침입을 특징으로 하는 미생물 군집의 구성에 변화가 생깁니다[59-61]. 따라서 겨울 꿀벌의 장내에서 관찰된 바르토넬라균과 커멘살리박터균의 확장은 나이와 관련이 있을 수 있습니다. 그러나 겨울 꿀벌은 노령에도 불구하고 노화의 징후를 보이지 않으며[62, 63], 이러한 차이는 파리에서 보고된 것처럼 장 조직의 기능적 쇠퇴 때문이 아닐 가능성이 높습니다[61, 64].

겨울 꿀벌은 몇 주에서 몇 달 동안 벌통에 저장된 꽃가루를 먹습니다.
이전에 숙성된 꽃가루 식단의 섭취가 꿀벌의 장내 미생물 구성에 영향을 미친다는 사실이 밝혀진 바 있습니다[12].
겨울 꿀벌과 여름 꿀벌의 꽃가루 식이 사이의 대사적 차이를 특성화하고 이러한 차이를 다른 꿀벌 미생물 군집 구성원의 대사 능력과 연관시키는 것이 중요할 것입니다.

예를 들어, 겨울 꿀벌에서 가장 많이 증가한 두 가지 커뮤니티 구성원인 코멘살리박터와 바르토넬라는 호기성 호흡을 수행하는 반면, 다른 미생물 군집 구성원은 대부분 당분 분해 발효기입니다 [15, 65].
특히 겨울 꿀벌은 대변을 장에 장기간 보관하기 때문에 장내 물리화학적 조건과 영양소 가용성에 영향을 미칠 가능성이 높습니다.
또한 배변이 없으면 겨울 꿀벌의 장에 박테리아가 시간이 지남에 따라 축적 될 수 있으며, 간호사 또는 포식자의 경우 배변이 더 자주 발생하면 미생물 군집의 회전율이 더 빨라질 수 있습니다.
겨울에는 ~21°C, 여름에는 ~35°C[66]인 꿀벌의 체온 차이와 함께 박테리아 성장률에 영향을 미칠 수 있습니다.
실제로 최근 메타게놈 연구에 따르면, 장내 박테리아는 어린 수벌에 비해 늙은 겨울 꿀벌의 평균 개체군 복제가 더 낮은 것으로 나타났는데, 이는 복제율이 감소했음을 나타냅니다[18]. 비배양 기반 커뮤니티 분석을 수행할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 이러한 방법은 일반적으로 죽은 박테리아 세포와 살아있는 박테리아 세포를 구분할 수 없다는 것입니다. 따라서 관찰된 차이점 중 일부는 용해된 박테리아 세포에서 환경 DNA가 축적되었기 때문일 수도 있습니다.

마지막으로, 겨울 꿀벌은 면역 유전자 발현이 감소하고[67-70], 간호사 및 포식자에 비해 단백질 대사에 변화가 있으며[71], 이는 장내 총 박테리아 부하와 커뮤니티 구성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 요인입니다.

프리쉘라의 경우, 늙은 겨울 꿀벌의 군집 수준 감소는 이 박테리아에 대한 숙주의 특정 면역 반응의 결과일 수 있으며[10], 꿀벌이 노화함에 따라 장에서 박테리아를 제거한다고 추측할 수 있습니다. 스노드그라셀라의 경우, 실험에서 일벌의 종류나 두 가지 사료 처리에 따라 스노드그라셀라 수치가 거의 변하지 않았다는 점이 흥미롭습니다. 이는 스노드그라셀라의 식민지화가 식이 상태, 장내 물리화학적 조건 또는 다른 공동체 구성원의 풍부함에 의해 조절되지 않는다는 것을 시사합니다. 가능한 설명은 스노드가셀라가 물리적으로 제한된 틈새를 제공하는 회장의 상피 내벽을 선택적으로 식민지화하기 때문에 식단보다는 숙주에 의존한다는 것입니다[8, 72, 73].

코멘살리박터와 바르토넬라의 증가 외에도 겨울철 꿀벌 장내 미생물 군집의 또 다른 흥미로운 특징은 꿀벌 장내 미생물 군집에서 비핵심 군집 구성원이 사라졌다는 것입니다. 꿀벌은 겨울 꿀벌과 비슷한 박테리아 부하를 가졌지만 마이너 커뮤니티 구성원의 존재에 대해서는 반대 경향을 보였기 때문에 커뮤니티 구성의 이러한 차이가 커뮤니티 샘플링 편향으로 인한 것임을 배제할 수 있습니다.

우리는 이러한 작은 군집 구성원이 꿀벌의 장내 환경에서 장기간 지속될 수 없는 일시적인 식민지이며, 따라서 오래된 겨울 꿀벌에서는 사라진다는 가설을 세웠습니다. 세라티아나 클렙시엘라와 같은 일부 박테리아는 꿀벌의 잠재적 병원균이므로, 겨울철 꿀벌의 이러한 기회주의적 식민지에 대한 식민지 저항성을 증가시키는 메커니즘이 있을 수 있습니다. 또한, 먹이 사냥 시즌에 성체 일벌은 꽃 등에서 환경 박테리아를 수집할 가능성이 높아 여름에는 벌통 내부에 박테리아가 쉽게 전파되지만 겨울에는 그렇지 않습니다.

최근 대부분의 군집 손실은 겨울철에 발생했습니다[30, 31]. 따라서 겨울철 꿀벌은 군집 생존에 매우 중요하며, 장내 미생물을 포함하여 꿀벌의 건강 상태에 영향을 미치는 요인에 대한 더 나은 이해가 필요합니다. 요약하면, 우리의 분석 결과 겨울 꿀벌의 장내 미생물은 특징적인 변화를 겪는 것으로 나타났습니다. 이러한 변화는 숙주에게 중요한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 향후 연구에서는 겨울 꿀벌의 장내 미생물의 기능적 역할과 군집 건강에 특히 초점을 맞춰야 합니다.


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7031341/