프로바이오틱스에 대한 현장실험..랜디올리버

[우성(旴成) 평택]

프로바이오틱스 현장 시험

양봉가 지원 연구

ABJ 5월 2021에 최초 게재

랜디 올리버

과학적 양봉

최근 몇 년 동안 꿀벌의 장내에는 몇 가지 핵심 박테리아 그룹으로 구성된 마이크로바이옴이 존재하며(그림 1), 이 마이크로바이옴이 파괴되면 꿀벌의 건강에 해로운 영향을 미칠 수 있다는 사실을 알게 되었습니다[[1]]. 많은 양봉가들이 특히 인공 사료를 먹일 때나 항생제를 투여한 후 군집 건강을 개선하기 위해 프로바이오틱스 보충제를 먹이면 효과가 있는지 문의해 왔습니다. 그래서 저는 두 번의 현장 실험을 통해 이를 알아봤습니다.



소개

프로바이오틱스는 살아있는 "유익한" 미생물을 함유한 제품으로, 일반적으로 섭취 시 인간의 장 또는 관리 가축의 공생 박테리아를 개선하거나 복원하여 건강상의 이점을 제공한다고 주장하며 홍보하는 제품입니다. 그러나 이러한 주장에 대한 근거가 거의 없는 경우가 많습니다 [[2]]. 꿀벌의 경우, 꿀벌의 장내 미생물 접종은 출현 후 첫 주 동안 벌통에서 자연적으로 발생하며[[3]], 이 기간 동안 핵심 마이크로바이옴은 영양분 섭취가 아닌 벌빵과 소비 접촉을 통한 '분변 구강 경로'에서 얻어지기 때문에 이러한 주장은 특히 의문입니다[[4]].

그림 1. 꿀벌의 핵심 장내 세균.

실용적인 질문: 일벌은 소비에서 핵심 장내 세균을 쉽게 얻을 수 있는데, 프로바이오틱스 제품을 먹여야 하는 이유는 무엇인가요? 어떤 차이가 있을까요?

이 현장 시험은 꿀벌을 위해 특별히 시판되는 두 가지 상업용 프로바이오틱스 제제 중 하나를 매달 먹이는 것이 군집의 힘(군집 크기로 측정)이나 성능(체중 증가로 측정)에 도움이 되는지 확인하기 위해 고안되었습니다.

저는 두 가지 이유로 위의 두 가지 간단한 지표를 사용하는 것을 좋아합니다:

두 가지 모두 콜로니 건강과 성체 생존의 모든 측면을 최종적으로 반영합니다.
이 두 가지 지표는 양봉가의 주머니에 돈을 넣어주는 유일한 지표입니다.
저는 현장 측정과 첨단 분자 생물학("차세대" 염기서열 분석)을 결합한 두 가지 간단한 실험을 통해 먼저 프로바이오틱스가 군집의 강도나 체중 증가에 영향을 미치는지 확인한 다음, (나중에 발표할 예정) 프로바이오틱스를 먹이면 다른 생물학적 이점이 있는지 알아보기 위해 실험을 진행했습니다.

테스트할 가설

과학적으로 이 실험은 다음과 같은 가설을 테스트하기 위해 설계되었습니다:

1.상업용 꿀벌 프로바이오틱스를 장기간에 걸쳐 먹이면 군집 크기 또는 체중 증가로 측정한 군집 성과가 개선되는지 여부.
2.테스트한 두 가지 프로바이오틱스 중 어느 것이 다른 프로바이오틱스보다 더 큰 군집 성능 개선을 보이는지 여부.
3.그렇다면 그러한 치료가 비용측면에서 효율적인지 여부(프로바이오틱스는 저렴하지 않음).
4.프로바이오틱스에 포함된 박테리아 균주가 실제로 장에 정착하는지 여부.
5.프로바이오틱스 섭취가 바이러스, 효모 또는 노제마의 유병률 또는 강도에 영향을 미치는지 여부.
6.장내 마이크로바이옴이 수족구병 치료제로 옥살산을 사용할 때 영향을 받는지 여부.
7.프로바이오틱스 공급이 유전자 발현에 영향을 미치는지 여부.
8.프로바이오틱스가 항생제 치료 후 핵심 장내 미생물 군집의 재구성을 개선하는지 여부.
예, 꽤 많은 목록이지만 실험을 통해 무엇을 알아낼 수 있을지 지켜보겠습니다.

실험 설계

이 실험은 가루 설탕으로 만든 가짜 대조군을 먹인 것과 비교하여 두 가지 상업용 프로바이오틱스인 SuperDFM(강력한 미생물) 또는 Pro DFM(만 레이크)(그림 2)을 매달 먹인 결과 군집 성과에 측정 가능한 영향이 있는지 확인하기 위해 설정되었습니다.

그림 2. 테스트한 두 가지 프로바이오틱스. 현장 데이터가 제조업체의 주장을 뒷받침할 수 있을까요?

방법
해발 약 2900피트의 시에라 산기슭에 있는 양봉장 두 곳(햇볕이 잘 드는 곳, 그늘진 곳, 그림 3과 4)에서 실험을 진행했습니다. 4월에 여왕벌이 있는 핵을 설치하여 여왕벌을 교미시켰고, 각 양봉장은 서로 다른 여왕벌 어미벌의 구성원으로 만들었습니다. 6월 말, 유밀이 끝나갈 무렵, 실험을 위해 좋은 군집 패턴을 가진 건강한 벌통만 선별하고 소비을 교체하여 강도를 대략적으로 균등화했습니다(봄이 좋지 않아 6월에도 대부분의 군집은 여전히 약했습니다). 실험을 시작하기 전에 모든 벌통을 포름산으로 처리하고, 실험이 끝난 후 각 군집에 여왕이 있는지 확인했습니다(필요한 경우 각 마당에 있는 몇 개의 여분의 군집에서 대체 여왕을 가져옴).

그런 다음 벌통에 연속적으로 번호를 매기고 세 개의 벌통으로 구성된 각 숫자 블록에 있는 한 벌통에 세 가지 처리 방법 중 하나를 무작위로 할당했습니다. 방문 연구원에게 프로바이오틱스(또는 가루 설탕 조절제)를 메이슨 병에 붓고 A, B, C로 표시해달라고 요청하여 어떤 처리가 어떤 처치인지 알 수 없도록 했습니다.

그림 3. 햇볕이 잘 드는 마당. 편견의 가능성을 없애기 위해 우리는 어떤 치료법이 어떤 치료법인지에 대해 눈을 멀게 했습니다.

그림 4. 그늘진 (그리고 시원한) 마당. 이 마당에는 늦여름에 삼나무 단물이 흐릅니다. 시험 기간 동안 군집이 강해질 것으로 예상했지만 가뭄과 더운 날씨로 인해 대부분 그렇지 않았습니다.

7월 2일 시작 시점에 전처리 클러스터 강도(그림 5)와 벌통 가중치(그림 6)에 대한 등급을 매겼습니다.

그림 5. 우리는 이른 아침(또는 서늘한 날)에 클러스터가 깨지기 전에 각 상자의 프레임 사이를 위아래로 살펴보면서 강도 등급을 매깁니다. 제 손자 라이더는 코로나로 인해 온라인으로 학교를 다니고 있었고, 시험 기간 내내 모든 데이터가 올바르게 입력되었는지, 모든 벌통이 올바른 먹이를 받았는지 확인하면서 일류 기록 현장 기술자임을 증명해 보였습니다.

그림 6. 저에게 큰 도움을 준 또 다른 기술자는 양봉가 앨리스 던바입니다. 빠르고 정확한 계량을 위해 제가 용접한 맞춤형 핸드트럭을 보여주고 있습니다. 파란색 디지털 크레인 저울은 각 벌통의 무게를 1/10파운드 단위로 측정했습니다.

또한 모든 군집의 벌집에서 약 50마리의 벌 샘플을 채취하여 드라이아이스에 즉시 얼려서(그림 7) 협력 기관인 USDA 칼 헤이든 꿀벌 연구소의 앤더슨 연구소에서 차세대 장내 미생물 염기서열 분석을 수행했습니다.

그림 7. 약 50마리의 꿀벌 샘플을 플라스틱 튜브에 넣고 즉시 드라이아이스로 포장한 다음, 나중에 분석할 수 있도록 하룻밤 사이에 (많은 비용을 들여) USDA 실험실로 배송했습니다.

초기 등급 판정 및 샘플링이 완료되면, 매월 첫 주에 하부 계사의 상단 막대 위에 제조업체에서 권장하는 비율인 한 달에 한 테이블스푼씩 프로바이오틱스 처리를 건식으로 급여했습니다(총 4회 급여)(그림 8).

그림 8. 첫 번째 먹이주기. 모든 봉군은 싱글로 설정되었으며 그 위에 빈소비 6 개와 소초 2 개가 들어있는 상자를 받았습니다. 이렇게 설정하면 세 번째 상자가 필요 없이 남은 꿀과 설탕 시럽을 보관할 수 있는 충분한 공간이 생깁니다. 흰색 가루를 잘못 사용하지 않도록 벌통과 프로바이오틱스 병에 색깔을 구분했습니다.

이 실험은 의도적으로 스트레스가 많은 여름철 꽃가루 부족 기간에 걸쳐 진행되었기 때문에, 이후 4개월 동안 소량의 자연 꽃가루 유입과 더불어 꽃가루 보조제(Healthy Bee, Mann Lake 벌크 소프트)와 1:1 설탕 시럽으로 구성된 인공 먹이를 군집에 추가적으로 균등하게 공급했습니다. 실험이 끝날 무렵, 군집은 꿀, 단물, 설탕 시럽 "꿀"로 상부 군집실을 대부분 채웠습니다. 시험 기간 내내 바로아 감염률을 모니터링하고 서방형 옥살산을 사용하여 진드기 수를 1% 수준 이하로 유지했습니다.

겨울이 오기 전 꿀벌의 번식을 줄이기 위해 11월 4일과 5일에 등급 분류, 무게 측정, 샘플링을 반복하여 종료점 결과를 도출했습니다.

결과

수치와 통계에 얽매이기보다는 각 벌통 그룹에 대한 실제 원시 데이터를 아래에 보여드리겠습니다(그림 9~14). 안타깝게도 결과는 다소 실망스러웠습니다.

군집의 크기 변화

비정상적으로 덥고 건조한 날씨로 인해 대부분의 군집 크기가 증가하지 않았지만, 그 중 일부는 11월에 훨씬 서늘한 날씨에 등급을 매겼기 때문입니다. 흥미로운 점은 시작 강도와 종료 강도 사이에 상관관계가 거의 없었다는 점입니다. 실제로 시작 시점의 군집이 강할수록 11월이 되면 더 많이 줄어드는 경향이 있었습니다(그림 9).

그림 9. 시작 강도가 강할수록 11월까지 군집의 크기가 줄어들 가능성이 높다는 것을 알 수 있도록 "변화 없음" 선을 추가했습니다(선 위 또는 아래의 데이터 포인트 수 비교). 이유는 모르겠지만 같은 시기에 다른 야드에서 실시한 다른 현장 시험에서도 같은 현상이 관찰되었습니다.

하지만 우리의 질문은 프로바이오틱스를 먹였을 때 겨울에 더 큰 군집 크기(더 건강한 군집을 나타냄)로 이어졌는가 하는 것입니다. 아래 그래프를 통해 직접 판단해 보시기 바랍니다. 다음은 각 군집의 절대적인 강도 변화에 대한 원시 데이터입니다(그림 10a).

그림 10a. 각 군집의 시작 강도는 파란색, 끝 강도는 빨간색, 벌통은 시작 강도에 따라 정렬되어 있습니다. 강도의 변화를 나타내는 각 기둥 쌍의 상단 사이의 높이에서 그룹별 차이를 비교합니다. 그늘진 마당에서의 군집 강도 변화(크러스칼 - 월리스 p = 0.89) 또는 절대 강도(p = 0.67)에서 처리 그룹 간 통계적 차이는 없었습니다.

식민지가 서로 다른 강도에서 시작되었으므로 변화를 비교하는 가장 좋은 방법은 종료 강도를 시작 강도로 나누어 상대적인 강도 변화의 분포를 비교하는 것입니다(그림 10b).

추가되었습니다: 그림 10b. 그늘진 마당의 세 테스트 그룹 모두에 대한 식민지별 상대적 강도 변화 분포의 히스토그램은 유사한 정상 곡선에 속하는 것으로 나타났습니다.

그림 11a. 햇볕이 잘 드는 마당에서 식민지 강도의 변화(Kruskal - Wallace p = 0.88)나 절대 강도(p = 0.66)에서 처리 그룹 간 통계적 차이는 없었습니다.

추가되었습니다: 그림 11b. 햇볕이 잘 드는 마당에 있는 세 테스트 그룹 모두에서 봉군의 상대적인 강도 변화 히스토그램도 비슷한 정상 곡선에 속하는 것으로 나타났습니다.

실제 적용: 이 실험의 데이터는 안타깝게도 두 프로바이오틱스 중 하나를 먹였을 때 더 강한 콜로니가 형성되었다는 주장을 뒷받침하지 못했습니다.

콜로니 무게의 변화

천연 꿀과 단물을 먹인 군집과 설탕 시럽을 똑같이 먹인 군집 사이에서 모든 군집의 체중이 증가했으며, 평균 체중 증가량은 거의 27파운드에 달했습니다. 당연히 최종 강도가 가장 큰 식민지가 더 많은 상점을 올리는 경향이 있었습니다(그림 12). 그렇다면 프로바이오틱스를 먹이면 체중이 증가했을까요?

그림 12. 종료 지점에서 더 강한 식민지가 더 많은 체중을 차지하는 경향이 있었지만 상관관계는 미미했습니다.

하지만 두 프로바이오틱스 중 하나를 먹였을 때 체중이 더 많이 증가했을까요? 다시 한 번 직접 확인해 보세요.

그림 13a. 그늘진 마당에서 체중 증가에 있어 치료 그룹 간 통계적 차이는 없었습니다(p = 0.73).

그림 13b. 그늘진 마당에서 벌집이 얻은 파운드의 수는 비슷한 정규 분포를 보이는 것으로 보입니다.

그림 14a. 햇볕이 잘 드는 마당에서 체중 증가에 있어 치료 그룹 간 통계적 차이는 없었습니다(Kruskal - Wallace p = 0.35).

그림 14b. 햇볕이 잘 드는 마당의 두드러기별 체중 증가 분포는 크게 다르지는 않지만, 처리 C가 이 마당에서 다소 더 많은 체중 증가를 초래했을 수 있음을 시사합니다.

실제 적용: 이 실험의 데이터는 안타깝게도 두 프로바이오틱스 중 하나를 먹였을 때 더 강한 콜로니가 형성되었다는 주장을 뒷받침하지 못했습니다.

토론
안타깝게도 수집된 데이터는 실험에 사용된 프로바이오틱스를 매달 먹였을 때 가루 설탕 대조군을 매달 먹였을 때와 비교하여 집락의 강도나 체중 증가에 측정 가능한 이점이 있었다는 주장을 뒷받침하지 못했습니다.

즉, 프로바이오틱스가 장내 미생물 군집에 다른 영향(유익하거나 그렇지 않은)을 미쳤을 가능성은 여전히 존재합니다. 다음은 제 공동 연구자인 USDA-ARS 앤더슨 연구소가 답변한 나머지 질문입니다.

적용된 박테리아 균주가 꿀벌의 장에 정착하나요?
두 프로바이오틱스 중 하나를 먹이면 장내 미생물 군집 구조에 영향을 미치나요?
프로바이오틱스를 먹이면 병원균에 영향을 주나요?
항생제 옥시테트라사이클린 또는 타이로신으로 벌통을 치료한 후 프로바이오틱스를 먹이면 장내 미생물을 회복하는 데 도움이 되나요?
마지막 질문에 답하기 위해 실험이 끝날 때 각 치료 그룹을 세 그룹으로 나누고 그 중 두 그룹에 항생제를 투여한 다음 프로바이오틱스를 다시 투여하고 세 시점에 벌 샘플을 채취하여 장내 미생물군집의 회복을 추적했습니다. 샘플 분석이 완료되면 결과를 공개할 예정입니다.


https://scientificbeekeeping.com/a-field-trial-of-probiotics/

[김국원/포항]

항생제 치료 후
프로바이오틱스의 투여와 함께
항생제와 프로바이틱스의 동시 투여에 대한
결과도 검증 해주었으면 좋겠습니다.

늘 귀한 자료 올려주심에 감사드립니다.