기본필독코스 1단계 (생화학강의)2. The Solvent for Biochemical Reactions

[colony]

2. The Solvent for Biochemical Reactions
사실상 세포에서 일어나는 모든 화학반응은 물과 관계되어 있다. 그것들은 유기화학 반응으로 똑같은 functional group을 사용하며 세포의 환경에 영향을 미친다. 생명의 특별한 특성은 물 주변에서 진화해 왔다. 자연 상태의 물 분자에서 중요한 구조는 부분적으로 양으로 하전된 수소 원자들과 부분적으로 음으로 하전된 산소 원자를 갖는 다는 것이다. 이러한 구조 때문에 물 분자는 4개의 분자가 모이게 된다. 4개의 수소결합은 4면체를 형성한다. 수소결합은 biomolecular structrue엣 어느때나 중요하다(enzyme의 protein chain 부분을 고정시켜 주고, double helix의 DNA 사슬을 고정해 준다). 물의 또 다른 기능은 세포의 산도를 조절하는 것이다. 세포는 내부의 정확한 pH 조절에 의해 생존한다.

2.1. The Polar Nature of The Water Molecule

물은 대부분의 세포에서 중요한 구성 요소이다. 물 분자의 기하학적인 구조와 특징은 생명체의 특징을 결정짓는 중요한 임무인 촉매로 작용한다.

전자가 화학결합의 원자 사이에서 공유될 때 전가가 똑같이 나누어질 필요는 없다. 전자가 동일하지 않게 나누어진 결합은 극성과 관계가 있다. 화학결합엣 원자가 전자를 끌어 당기는 경향을 electronegativity라 한다. 같은 원소의 원자는 물론 결합에 동일한 전자를 electronegativity를 갖는다. F, O, N는 모푸 C나 H 보다 더 큰 electronegativity를 갖는다.

물의 O-H 결합에서 산소는 더 많은 전자를 가지고 있기 대문에 수소 보다 더 큰 electronegativity를 갖는다. 이러한 산소와 수소 사이의 electronegativity 차이는 각각 부분적인 양전하와 음전하를 띠게 하고, Մ⁺와 Մ^-로 표기한다. 그러므로 O-H 결합은 극성 결합이다. 메탄(CH₄)의 C-H 결합처럼 electronegativity 차이가 거의 없는 상태는 결합의 전자 공유가 거의 같다. 그리고 그러한 결합은 비극성 결합이다.

분자는 극성 분자를 가질 수 있지만 기하학적 구조를 나타내기 때문에 비극성을 나타낸다. 이산화탄소를 예로 들어보면, 두 개의 C-O 결합은 극성이지만 CO₂ 분자는 선상의 구조를 갖는다. 왜냐하면 하나의 결합에서 산소 전자를 끌어당기는 힘은 분자의 반대편에 있는 전자를 끌어 당기는 힘에 의해 상쇄되기 때문이다.

물은 결합각이 105⁗로 구부러진 분자이다. 그리고 두 결합의 전자가 공유되어 있지 않아 CO₂에서처럼 힘이 상쇄되지 않는다. 그 결과 전자 결합은 수소의 끝 보다 산소의 끝에서 더 많이 발견될 것이다. 양전하의 끝과 음전하의 끝을 포함하는 분자를 dipoles라 한다.

Solvent Porperties of Water

물의 극성은 주로 물의 촉매 특성을 결정한다. KCl과 같은 이온 화합물들은 물 속에 녹아 모두 하전되고, 에틸알콜(C₂H₅OH) 또는 아세톤((CH₃)₂)C=O)과 같은 극성 화합물은 부분적으로 하전되는 경향이 있다. 기본적인 물리 법칙에 의하면 전하가 다른 것들 사이에는 전기적 인력이 작용한다. 쌍극자인 물의 음으로 하전된 끝 부분은 양이온 또는 다른 물의 양으로 하전된 부위를 끌어 당긴다. 전기적 인력 때문에 서로 근접한 것을 잡아 모아진 다른 전하의 분자들은 이것들이 상호작용을 하지 않을 만큼의 낮은 에너지를 갖는다. 낮은 상태의 에너지는 보다 안정한 system을 만든다. 이러한 ion-dipole 그리고 dipole-dipole의 상호작용들은 발생된 에너지의 양에 의하여 반응하는 물 분자와 비슷하다. 물에 쉽게 용해되는 극성 화합물의 예는 산소나 질소 원자 같은 electronegativity atom 또는 alcohols, amines, carboxylic acid을 하나 또는 그 이상 포함하는 작은 유기분자이다. 이러한 분자의 쌍극자와 물의 쌍극자 사이의 인력은 그것들을 용해시키는 경향을 만든다. 이온 물질과 극성 물질은 이러한 경향 때문에 hydrophilic으로 간주된다.

Hydrocarbon(하나의 탄소 원자와 수소 원자를 포함하는 화합물)은 비극성이다. 이온 화합물과 극성 화합물의 용해도에 영향을 미치는 ion-dipole과 dipole-dipole 상호작용은 비극성 화합물과 반응이 일어나지 않고, 따라서 이러한 화합물들은 물에 용해되지 않는 경향이 있다. 비극성 분자와 물 분자 사이의 상호작용은 쌍극자의 상호작용보다 약하다. 물 분자의 변하지 않는 쌍극자는 결합에 있는 전자 배열을 부분적으로 파괴함으로써 비극성 분자에서 임시적인 쌍극자를 형성할 수 있다. 비극성 분자에서 임시적으로 형성된 쌍극자와 물 분자의 변하지 않는 쌍극자 사이에서 정전기적 인력이 생성될 수 있다. 그렇지만 변치않는 쌍극자 사이의 인력보다 강하지 않다. 따라서 물 분자 사이의 인력 보다도 약한 에너지를 갖는다. 물 속의 비극성 분자들은 물 끼리의 반응보다 더 일어나지 않는다. 그 결과 비극성 분자는 물에 용해되지 않으며, 이러한 성질을 hydro- phobic이라 한다.

분자는 극성 부위(hydrophilic)와 비극성 부위(hydrophobic)를 모두 가질 수 있다. 이러한 형태의 물질을 amphiphilic(amphi-on both ends, philic-loving)이라한다. 왜냐하면 분자의 한쪽 부위는 물에 용해되는 경향이 있고, 다른 부위는 비극성이기 때문이다. 극성의 carboxylic acid group과 긴 비극성의 hydrocarbon 부위를 갖는 긴 사슬의 fatty acid는 amphiphilic 물질의 가장 좋은 예이다. Head group을 형성하는 carboxylic acid group은 두 개의 산소 원자에 탄소와 수소 원자가 첨가되어 있다(강한 극성을 띠며 carboxylate anion을 형성할 수 있다). 분자 꼬리의 나머지 부분은 탄소 원자와 수소 원자로만 구성되기 때문에 비극성이다. 이런 화합물들은 구조를 형성하는데 이를 micelle이라 한다(극성의 head group은 물 환경과 접하게 되고, 비극성의 꼬리는 물로부터 분리된다).

비극성 분자 사이의 상호작용은 매우 약하고 아주 짧게 생성되는 쌍극자 사이의 인력에 의존한다. 임시적인 쌍극자는 변하지 않는 쌍극자를 갖는 이웃 분자의 다른 쌍극자를 유도할 수 있다. 이러한 상호작용의 에너지는 잠깐 동안 형성되기 때문에 약하다. 이것을 van der Waals bond라 한다.

2.2 The Importance of Functional Group in Biochemistry

유기화학은 탄소와 수소의 화합물과 그들의 유도체를 연구한다. 생물의 세포 기관을 구성하는 것들은 탄소 화합물이기 때문에 biomolecule은 유기화학 물질의 한 부분이다.

19세기 초까지만해도 힘이 생명의 전부라는 "Vital forces"의 주장이 널리 받아들여 졌다. 이 이론은 실험실에서 생성할 수 없는 생물체에서만 발견되는 화합물에 대한 견해이다. 1828년 독일의 화학자 Friedrich Wöhler에 의해 이 이론이 잘못 되었다는 것이 입증되었다. Wölhler는 ammonium cyanate(NH₄OCN)에서 동물의 대사 노폐물로 알려진 urea(H₂NCONH₂)를 합성해 냈다.

Biomolecules의 반응은 유기화학의 방법으로 설명될 수 있다. 이러한 방법들 중에서 가장 유용한 방법은 functional group에 따라 화합물을 분류하는 것이다. 분자의 반응은 functional group의 반응이다. 생물학적으로 중요한 functional group은 아래 표에 있다.

Class of Compound	Characteristic Functional Group	Name of Functional Group
alkenes alcohols ethers amines thiols aldehydes ketones carboxylic acids esters amides		double bond hydroxyl group ether linkage amino group sulfhydryl group carbonyl group carbonyl group carbonyl group ester group amide group

ATP는 ester bond와 anhydride linkages를 모두 가지고 있어 인산을 연결시킨다.

2.3. The Hydrogen Bond

Hydrogen bond는 noncovalent interaction으로 전정기에 의해 형성되며, dipole-dipole 상호작용의 특별한 경우라 할 수 있다. 수소가 산소, 질소, 플르오르와 같은 음전기의 원자와 공유결합을 형성할 때 부분적으로 양전하를 띠기 때문에 극성결합을 한다. 하지만 수소가 탄소와 공유결합을 하고 있을 때는 전하가 발생하지 않는다. 이렇게 수소가 부분적으로 양전하를 띨 때 다른 음전기 원자의 전자쌍과 공유하지 않고 서로 작용할 수 있다. 세 원자가 선상으로 배열되어 hydrogen bond를 형성한다. 이러한 배열은 수소 원자의 부분적인 양전하를 최대로 해 주고, 전자쌍을 공유하지 않는 두 번째의 음전기 원자의 상호작용을 가장 크게 해준다. 수소 원자가 음전기 원자와 공유결합해 있는 것을 hydrogen-bond donor이라 하고, 음전기의 원자가 전자쌍을 공유하지 않고서 서로 작용하는 것을 hydrogen-bond acceptor라 한다(수소 원자는 acceptor와 공유결합하는 것이 아니다).

물 분자는 hydrogen bond에 쓰이는 두 개의 수소원자를 가지고 있고, 다른 물 분자에는 산소 원자의 두 전자쌍이 공유하지 않아 수소결합을 할 수 있다. 각 물분자는 4개의 hydrogen bond에 관계된다(donor에 2개, acceptor에 2개). 플루오르화수소(FH)는 하나의 수소가 있어 donor과 hydrogen bond를 형성한다. 그러나 플루오르는 다른 수소와 결합을 형성할 수 있는 3개의 공유되지 않은 전자쌍을 가지고 있다. 암모니아(NH₃)는 3개의 수소 원자를 가지고 있어 hydrogen bond를 할 수 있으나 하나의 공유되지 않은 질소 원자의 전자쌍을 가지고 있다.

물 분자가 수소결합의 기하학적으로 배열하는 것은 물의 촉매적 특성에 중요한 영향력을 미친다. 물 분자의 결합각은 105°이고, 공유되지 않은 전자쌍의 각도 이와 비슷하다. 이로 인해 물 분자의 3차원 구조가 형성된다. 수용액 상태의 물 분자는 얼음 결정과 비슷한 배열의 수소결합으로 구성된다. 수용액 상태의 물 분자와 얼음의 차이점은 수용액 상태의 물은 수소결합으로 배열되어 있고, 얼음은 결정으로 구조화되었다는 것이다. 수용액 사태의 물에서 hydrogen bond는 계속해서 끊어지고, 계속해서 생성된다. 이러한 파괴와 생성은 물이 25℃에 있을 때 10^-10∼10^-11초당 1회꼴로 발생한다. 얼음 결정은 hydrogen bond가 항상 안정한 상태를 이룬다.

Hydrogen bond는 일반적인 covalent bond보다 결합력이 약하다. 반면 O-H의 공유결합을 끊는데는 460kJ/mole(110kcal/mol)의 에너지가 필요하고, 물의 수소결합을 끊는데 필요한 에너지는 20kJ/mol(5kcal/mol)이다. 비록 비교적 적은 양의 에너지라도 물의 melting point, boiling point, 수용액의 밀도, 얼음의 밀도 같은 특징을 나타내기에 충분하다. 물 분자의 녹는점과 끓는점은 다른 분자에 비해 높다. 분자량이 비슷한 메탄(CH₄), 암모니아(NH₃)같은 다른 물질들은 녹는점과 끊는점이 매우 낮다. 이러한 물질들의 분자 사이의 인력은 물 분자 사이에 있는 수소결합보다 약하기 때문에 불 분자보다 약하다.

얼음은 수용액 상태의 물보다 밀도가 낮다. 왜냐하면 얼음 결정의 모든 수소결합 배열이 분자 사이에서 빈 공간을 많이 형성하기 때문이다. 수용액 상태의 물은 수소결합이 광범위하지 않기 때문에 얼음보다 밀집되어 있다. 대부분의 물질은 얼면 부피가 줄어들지만, 물은 이와반대이다. 그래서 얼음은 입방체이며 떠 다니는 빙산이 된다. 그리고 물질을 둘러싸서 상처를 입힐 수 있는 얼음 결정에 의해 수용액 상태의 물 분자와 교체된 결과 팽창된다. 이러한 원리는 세포를 주기적으로 얼리고 해동시키는 것을 반복해 붕괴시키는 데 사용된다.

Hydrogen bond는 또한 촉매같은 물 분자의 성질은 타나나게 한다. 극성 용질은 hydrogen bond의 donor 또는 acceptor를 제공할 수 있다. 그래서 dipole-dipole 상호작용이 관계되어 물과 hydrogen bond를 형성한다. Alcohols, amines, carboxylic acid, esters 그리고 ketones는 모두 물과 hydrogen bond를 형성할 수 있다. 그래서 물에 녹을 수 있는 것이다.

Biologically Important Hydrogen Bonds Other Than to Water

Hydrogen bond는 생물학적으로 중요한 분자인 DNA, RNA, protein의 3차원 구조의 안정성과 관련이 있다. DNA의 2중 나선구조 각 가닥은 염기 사이에서 hydrogen bond가 형성되어 두 가닥을 고정한다. Transfer RNA(tRNA)도 또한 hydrogen bond에 의해 안정된 3차원 구조를 형성한다. Protein에서 hydrogen bond는 두 가지의 중요한 구조를 형성하는데 Ձ-helix 구조와 Ղ-pleated sheet 구조이다. 이러한 두 가지 형태의 구조들은 protein 안에서 서로 넓게 마주하고 있다.

2.4. Acids and Bases

생화학의 아주 중요한 화합물들의 특성은 그것들의 산-염기 특성에 의해 결정된다. 산은 양성자 주게(hydrogen ion donor), 염기는 양성자 받게(hydrogen ion acceptor)라 정의한다.

물에 용해된 많은 양의 산이 있을 때, 여기에서 방출된 수소 이온의 양으로 산의 세기를 숫자로 유도할 수 있다. 산 해리상수 또는 K'_a는 어떠한 산이든 HA라 쓸 수 있고, 그 반응은 다음과 같다.

HA(acid) ⇆ H⁺ + A^-(conjugate base)

K'_a {}={}{ [H^+ ][A^- ]} over [HA]

위의 예어서 [ ]는 mole농도(1 liter 당 몰의 농도)를 나타낸다. 각 산의 K'_a값은 열을 가해주면 변하게 된다. 이 값의 크기는 산이 완전히 해리될수록 커진다(K'_a값이 가장 큰 것이 가장 강산이다).

엄밀하게 말해서 산-염기 반응은 촉매인 물이 염기로 작용할 때 양성자 전달 반응이다.

HA(aq) + H₂O(l) ⇆ H₃O⁺ + A^-(aq)

(acid) (base) (짝산) (짝염기)

(aq)기호는 수용액 속의 용질을 나타내고, (l)기호는 용액 상태의 물을 나타낸다. 용액에는 자유 수소 이온은 존재하지 않고, 단지 hydronium ion(H₃O⁺)이 수용액의 hydrogen ion의 수화는 거의 없다. 모든 용질은 수용액에 잘 수화된다.

2.5. The Self-Dissociation of Water and The pH Sacle

물의 산-염기 특성은 촉매 역할을 수행하기 때문에 생명의 유지에 중요하다. 물이 hydrogen ion과 hydroxide ion으로 자가분해되는 한계는 작지만 많은 용질의 중요한 특징을 결정짓는다.

H₂O ⇄ H⁺ + OH^-

Hydrogen ion(H⁺)과 hydroxide ion(OH^-)은 일부 물 분자와 결합되어 있다. 그리고 반응식의 물 분자는 같은 분자 집합체의 일부 그 자체이다. 이것은 물의 자가분해 정도를 측정할 수 있다.

K' _a {}={} {[H^+ ][OH^- ]} over {[H_2 O]}

순수한 물의 mole 농도 [H₂O]는 용질의 어떠한 농도와도 상당히 비교된다(55.5M이라는 수량은 물 1 liter의 g수(1000)을 물의 분자량(18g/mole)으로 나누어 얻어진다). 따라서

K' _a {}={} {[H^+ ][OH^- ]} over {55.5}

K' _a × 55.5 {}={}[H^+ ][OH^- ] {}={}K_w

새로운 상수 K_w는 물에서 형성된 이온상수라 정의되고, 이 값의 크기는 물의 농도에 영향을 미친다.

K_w의 수치는 순수한 물의 수소 이온 농도를 측정하여 실험치를 정의할 수 있다. 수소 이온 농도는 또한 수산화 이온 농도와 같다. 왜냐하면 물은 한 분자에서 하나의 양성자가 방출되는 monoprotic acid이기 때문이다. 25℃의 순수한 물을 보면 다음과 같은 식이 성립된다.

[H^+ ] {}={}10^-7 {}={}[OH^- ]

따라서 25℃의 K_w값은 다음과 같이 표현된다.

K_w {}={} [H^+ ][OH^- ] {}={}10^-7 × 10^-7 {}={}10^-14

순수한 물에서 유도되는 이러한 관계는 수용액이 중성이든 산성이든 또는 염기성이든지 간에 모두 적용된다. 넓은 범위를 갖는 수용액의 hydrogen ion과 hydroxide ion 농도는 지수 표기법보다는 알맞은 표현법이 있는데, 이를 pH라 하고 다음과 같이 정의된다.

pH {}={} -log_10 ^{[H^+ ]}

pH의 한 단위의 차이는 hydrogen ion 농도([H⁺]) 10배 차이이다. 일반적인 수용액의 pH값은 간단한 계산을 통해 구할 수 있다.

Practic Session

순수한 물의

[H^+ ] {}={}10^-7

이고 pH=7일 때, 다음 용액의 pH를 계산하여라.

① 10^-3M HCl

10^-3M의 HCl이 이온화하면 H⁺는 10^-3M이 이온화된다(Cl^-는 10^-11M).

∴

pH {}={} -log^{[H^+ ]} 이므로{}pH{}={} -log_10 ^-3 {}={}3

이 된다.

② 10^-4M NaOH

10^-4M NaOH가 이온화하면 OH^-가 10^-4M이 이온화된다(Na⁺는 10^-10M).

∴

pH {}={} -log ^{[OH^- ]} {}={} -log^K_w -[OH^- ] {}={}-log^10^-4 {}={}4

순수한 물의 pH는 7로 중성이다. 산성 용액은 pH값이 7보다 낮고, 염기성 용액은 7보다 높다.

pH의 정의는 pK'_a의 양으로 정의될 수 있다.

pK'_a {}={}-log_10 ^K'_a

pK'_a는 산의 강도를 측정하는 또 하나의 수치이다. pK'_a값이 작은 것이 더 강산이다. 역으로 K'_a값이 크면 강산을 나타낸다.

Monitoring Acidity

어떤 약산의 K'_a는 산과 염기를 포함하는 수용액의 pH와 동일하다. 이러한 관계는 생화학 실습에 널리 이용되며, 특히 최적 조건의 반응 상태를 위한 pH 조절에 필요하다. 어떤 반응은 최적 조건의 pH가 변하면 발생하지 않는다. 생물학적으로 중요한 고분자는 최적 pH가 변형되면 활성을 잃는다. pH의 조절에서는 산인 HA의 해리에 의해 발생되는 hydrogen ion 농도의 반응식 k'_a를 구하는 것이 가장 필요하다.

K'_a {}={} {scale70 {[H^+ ][A^- ]} over [HA]}

이 식을 [H⁺]에 대해 풀면

[H^+ ] {}={}{scale70 {K'_a [HA]} over {[A^- ]}}

가 된다. 이 식을 pH와 pK'_a의 정의 그리고 로그의 성질을 이용하여 최종 반응식을 유도할 수 있다.

pH의 정의를 이용하여 양변에서 음의 로그를 대입하면

pH{}={}-log left({scale70 K'_a [HA]} over {scale70 [A^- ]}right)

가 된다. 이 식을 풀어주면 다음과 같아진다.

pH{}={} -left(logK'_a {}+{}log{scale70 [HA] over {[A^- ]}}right)

pH{}={} -logK'_a {}-{}log{scale70 [HA] over {[A^- ]}}

-logK'_a {}={}pK'_a

이므로

pH{}={}pK'_a {}-{}log{scale70[HA] over {[A^- ]}}

가 된다. 이 식을 로그의 성질을 이용하여 다음과 같이 바꾸어 쓸 수 있다.

pH{}={}pK'_a {}+{}log{scale70{[A^- ]} over [HA]}

이러한 관계식은 Henderson-Hasselbalch식이라 아렬져 있으며, pH 조절을 이용해 buffer solution의 특성을 알아내는 데 이용된다. Buffer에 대해서는 2.7절에서 다루어지고, 산의 농도([HA]), 염기의 농도([A^-])가 같아질 때([HA] = [A^-])에 대해서 자세히 알아 볼 것이다. 짝산과 짝염기가 같으면

{[A^- ]} over [HA]

는 1이되고, log1이 되어 pH값은 0이 된다.

2.6 Titration curves

산에 염기를 가하면 pH가 변하게 된다. 적정이란 일정량의 염기에 일정량의 산을 첨가해 주는 것이다. 염기의 양은 같은 양의 산과 완전히 반응해야 한다. 적정점에서는 산이 정확히 중성이 되어야 한다. 적정과정에서 아세트산에 염기를 첨가하면서 pH를 살펴보면, 적정곡선의 변곡점은 아세트산의 pH와 pK'_a가 같아질 때 형성된다. Henderson-Hasselbalch식에서 알아보았듯이 pH와 pK'_a가 같은 것은 약산과 짝염기의 농도가 같다는 것과 일치한다(이 경우에서는 아세트산과 아세트산 이온). pH 변곡점은 아세트산의 pK'_a가 4.76인 지점이다. 0.5 당량의 염기가 추가될 때 변곡점이 형성된다. 변곡점 주변에서 염기를 계속 첨가하면 pH는 아주 느리게 변화한다. 염기 1 당량이 첨가될 때 당량점에 이르고, 모든 아세트산은 아세트산 이온으로 전환된다. 그림 2.9b의 도표를 보면 아세트산의 양과 아세트산 이온의 양은 NaOH의 증가에 관계되어 있다. 주목할 점은 아세트산의 백분율과 아세트산 아세트산 이온 백분율의 합은 100%라는 것이다. 산(아세트산)은 NaOH를 첨가하거나 적정과정을 진행할 때 처럼 짝염기(아세트산 이온)로 변하게 된다. 적정과정에서 발생하는 반응의 의미를 이해할 수 있는 이러한 방법은 짝산과 짝염기의 백분율을 알아내는 데 유용하다.

첫번째 group은 monoprotic acid로 하나의 hydrogen ion을 방출하고 하나의 K'_a와 pK'_a값을 갖는다. 두번째 group은 diprotic acid로 두 개의 hydrogen ion을 방출하고 두 개의 K'_a와 pK'_a값을 갖는다. 세번째 group은 polyprotic acid로 두 개 이상의 hydrogen ion을 방출한다. Polyprotic acid의 예인 시트르산과 인산은 세 개의 hydrogen ion을 방출하고, 3개의 K'_a값과 3개의 pK'_a값을 갖는다.

2.7. Buffers

Buffer solution은 약산과 그것의 짝염기가 혼합되어 구성된다. Buffer solution은 강산이나 강염기를 조금식 첨가할 때 pH의 변화에 저항하는 경향이 있다. pH7의 순수한 물과 buffer solution에 같은 양의 강산이나 강염기를 첨가할 때 pH의 변화를 비교해 보자. 0.1M의 HCl 0.1mL를 99mL의 순수한 물에 첨가하면 pH는 급격히 떨어진다. 똑같은 실험에서 0.1M HCl 대신 0.1M NaOH를 첨가하면 pH는 급격히 증가한다. 순수한 물 대신에 buffer solution을 사용하면 결과는 달라진다.

적당량의 HPO₄^2-와 H₂PO₄^-가 함유된 용액은 buffer와 같은 기능을 제공한다. Henderson- Hasselbalch식을 사용하여

{scale70 {[HPO_4^2- ]} over {[H_2 PO_4^- ]}}

비율을 계산하면 pH7.0이 된다. HPO₄^2-의 농도가 0.063M이고, H₂PO₄^-가 0.01M인 용액을 예로 설명하면 다음과 같다. 만약 0.1M의 HCl 1.0mL를 99.0mL의 buffer에 첨가하면 반응은 첨가되는 거의 모든 H⁺가 사용된다.

HPO_4^2- {}+{}H^+ {}{}⇄{}{}H_2 PO_4^-

HPO₄^2-와 H₂PO₄^-의 농도는 변하게 되고, 새로운 농도는 계산할 수 있다. 새로운 pH는 Henderson-Hasselbalch식과 인산이온의 농도를 이용하여 계산할 수 있다. pK'_a값이 7.20이므로

pH {}={}pK'_a {}+{}log {scale70 0.062 over 0.101}

pH {}={}7.20 {}+{}log {scale70 {[HPO_4^2- ]} over {[H_2 PO_4^- ]}}

새로운 pH는 6.99로 buffer solution이 아닌 순수한 물에서 발생하는 변화보다 매우 작다. 이와 비슷하게 0.1M의 NaOH 1.0mL를 사용하면 적정과정에서 같은 반응이 발생한다.

H_2 PO_4^2- {}+{}OH^- {}{}⇄{}{}HPO_4^2- {}+{}H_2 O

첨가되는 거의 모든 OH^-가 사용되지만 pH의 변화는 거의 없다. 이러한 buffer는 수용액이기 때문에 K_w=[H⁺][OH^-]가 된다. 수소 이온 농도에서의 증가는 수소 이온 농도의 증가와 pH의 감소를 의미한다. Henderson-Hasselbalch식을 사용하여 새로운 pH를 계산해 보면 pH는 7.01이고, 순수한 물에서 발생하는 변화보다 적다는 것을 알게 될 것이다. 많은 생물학적 반응들은 극히 좁은 범위의 pH 변화가 있을 뿐이고, 따라서 buffer는 생화학 실험에 있어서 아주 중요하다.

적정곡선을 보면 이러한 특성이 형성되는 것을 관찰할 수 있다. H₂PO₄^-를 적정하면 pH는 적정 곡선의 변곡점 근처에서 아주 느리게 변화한다. 또한 변곡점에서 원래의 산이 짝염기로 전환된다. 인산 이온화의 두번째 단계(

H_2 PO_4^- {}{}⇄{}{}H^+ {}+{}HPO_4^2-

)는 buffer의 원리로 쓸 수 있는 유일한 예이다. 적정의 변곡점에 대한 pH값은 7.20이고, H₂PO₄^-의 pK'a값과 같다. 이 값의 pH를 갖는 용액은 같은 농도의 HPO₄^2-와 H₂PO₄^-를 포함하고 있다.

Buffer solution은 비교적 일정한 pH값은 유지할 수 있다. 왜냐하면 산과 짝염기의 양이 조금 존재하기 때문이다. 이러한 상태는 산의 pH나 pK'_a 근처에서 형성된다. 만약 OH^-가 첨가되면 용액에 존재하는 buffer가 산을 형성하여 첨가되는 염기와 반응하게 된다. 만약 H⁺가 첨가되면 buffer는 염기를 형성하여 첨가되는 염기와 반응한다.

{H_2 PO_4^-}/

{HPO_4^2- }

쌍은 pH7.2 근처에서 적절한 buffer가 되고,

CH_3 COOH/

CH_3 COO^-

쌍은 pH4.76 근처에서 buffer를 형성한다. pH값에서 pK'_a보다 낮으면 산의 형성이 우세하고, pK'_a보다 높으면 염기의 형성이 우세하다. 산과 염기의 비가 10:1이라는 것은 pH가 pK'_a보다 1pH 낮다는 의미이다. 왜냐하면 pH 크기에서의 단위 변화는 수소 이온 농도의 10배와 같기 때문이다. 산과 염기의 비가 1:10이라는 것은 pH가 pK'_a보다 1pH 낮다는 의미이다. 적적 곡선의 완만한 부분은 pH가 빠르게 변하지 않는 범위로 pK'_a가 ⁑1pH 범위를 갖는 부위이다. 따라서 buffer가 영향을 미치는 구간은 이 2pH의 범위이다. 만약 buffer solution이 아주 작은 농도의 산과 염기를 적당히 함유한다면 아주 적은 양의 산을 첨가하면 형성한 모든 염기를 사용할 것이다. Buffer solution이 형성하는 산과 염기의 농도가 낮으면 buffer 능력(buffering capacity)이 낮고, 산과 염기를 많이 포함하고 있으면 buffering capacity가 높다.

생명체와 실험실의 buffer system은 많은 형태의 화합물을 기초로 한다. 거의 모든 생명체의 생리적인 pH는 7에 가깝게 유지되기 때문에 인산 buffer system이 생물에서 널리 쓰여진다고 예측할 수 있다. 이 경우의 인산 이온 농도는 대부분의 intracellular fluid에서 효과적인 buffer로 충분하다.

{H_2 PO_4^-}/

{HPO_4^2- }

쌍은 세포에서 중요한 buffer이다. 혈액에서의 인산 이온 수준은 buffer에 불충분하여 다른 buffer system이 작용한다.

혈액에서의 buffer system은 탄산(H₂CO₃)의 해리에 의해 일어난다.

H_2 CO_3 {}{}⇄{}{}H^+ {}+{}HCO_3^-

H₂CO₃의 pK'_a는 6.37이다. 사람 혈액의 pH는 7.4로 buffer 한계 범위 끝에 가깝지만 이러한 상태에 다른 요인이 개입된다. Hemeglobin protein은 적혈구 세포의 주요 구성물로 폐에서 조직으로 산소를 운반하고, 이산화탄소를 조직에서 폐로 운반하는 기능을 수행한다. 이산화탄소는 혈액과 같은 물로 이루어진 fluid에 녹을 수 있다. 용해된 이산화탄소는 탄산(H₂CO₃)을 형성하고, 반응에 의해 HCO₃^-를 형성한다.

CO_2 (g) {}{}⇄{}{}CO_2 (aq)

CO_2 (aq){}+{}H_2 O (l ) {}{}⇄{}{}H_2 CO_3 (aq)

H_2 CO_3 (aq) {}{}⇄{}{}H^+ {}+{}HCO_3^- (aq)

{N}et}{}equation{}:{}CO_2 (g){}+{}H_2 O (l ) {}{}⇄{}{}H^+ (aq) {}+{}HCO_3^- (aq)

혈액의 pH에서 용해된 이산화탄소의 대부분은 HCO₃^-로 나타나고, 탄산의 pK'_a보다 pH1보다 높다. 이산화탄소는 폐로 수송되어 HCO₃^-의 형성을 끝마친 다음 단백질의 하전된 group의 이온 인력에 의해 hemoglobin과 결합한다. 혈액의 pH와 폐의 CO₂(g)의 압력 사이에는 직접적인 관련이 있다.

인산 buffer system은 실험실(in vitro)과 생명체(in vivo : living)에서 공통적으로 사용된다. TRIS라 부르는 tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer system은 in vitro(in glass)에 널리 쓰인다. 최근에 널리 쓰이고 있는 다른 buffer로는 양전하와 음전하를 모두 가지고 있는 화합물인 zwitterion(양성이온)이 있다. Zwitterion은 일반적으로 초기의 buffer보다 화학반응에서 해가 적다고 생각되어 진다.

대부분의 생물은 pH 수준이 7에 가깝게 작용한다. Carboxyl group이나 amino group같은 많은 작용기들의 pK'_a값은 pH7보다 조금 높거나 낮다.