환경 stress 내성 인삼의 선발 및 증식기술 개발

[심메마니]

환경 stress 내성 인삼의 선발 및 증식기술 개발

Selection and Mass Propagation of Superior Ginseng Lines Tolerant to Environmental Stress
한국인삼연초연구원
년 월 일
 주관기관  과학기술부
본 보고서를 "환경 stress 내성 인삼의 선발 및 증식기술 개발" 과제의 최종보고서로 제출합니다. :
년 월 일

한국인삼연초연구원
주관연구책임자 : 최광태
연구원 : 이명구
연구원 : 박지창
연구원 : 이성식
연구원 : 양덕춘
연구원 : 강제용
요약문
제 1 장 제 목
  환경 stress 내성 인삼의 선발 및 증식기술 개발

제 2 장 연구개발의 목적 및 필요성
  고려 인삼(panax gineseng C.A.Meyer)은 국내외에서 소비가 급증하고 잇는 우리나라 유일의 경제작물이다. 그리고 반음지성 약용식물인 인삼은 해가림 시설하에서만 재배가 가능하여 노동력이 많이 들고 생육이 늦어 3~5년간 한 곳에 머물게 되므로 뿌리썩음병고 같은 지하부 병해, 한발, 생육에 부적합한 토양환경 등의 자연재해애 의한 피해가 많으며, 특히 토양환경 stress 때문에 품질좋은 인삼의 안정된 수량확보가 대단히 어렵다. 작물재배에서 필요한 영양분은 외부로부터 공급하는데 그 방법으로서 유기질 비료나 무기질 비료를 시용한다. 시용한 비료는 작물이 이용하고 잔량은 유실되거나 토양에 집적하여 염류로 집적된다. 집적된 염류는 또다시 다음 작물 재배시에 이용할 수가 있기 때문에 비료 시용량을 절감할 수가 있다. 그러나 관행적으로 집적된 염류의 양은 배제하고 또다시 통상적인 량의 비료를 시용하는 것이 보통이다. 인삼은 비료 요구량이 그리 많지 않는 작물이다. 그런데도 인삼재배 농민은 토양의 염류농도수준과는 별개로 관행적으로 사용하던 종류의 비료를 사용하는 것이 통례이다. 인삼연구원에서 2000년도에 공사의 계약 삼포지 310개소의 토양 염류를 조사한 결과 포지의 25.5%는 토양의 염류농도가 인삼재배 적정치(EC 0.1dS/m)이상이었다.(박현석 등, 2000). 이로 인하여 염류농도가 적정치 이상인 포지에 인삼을 재배할 시에 결주와 적변삼 생산율의 증가, 근증, 수량이 감소된다(목성균 등, 1997). 이런 인삼포 염류환경에서 인삼재배를 위해서는 염류장해방제를 위한 재배법을 연구 보급하고 있으나(목성균 등, 1997) 용이하지 않다. 그 방법의 하나로서 본 시험기간 동안에는 보유하고 있는 인삼계통에 대하여 염류 stress 내성을 점검후 선발하여 염류 stress 내성 인삼의 품종을 육성 보급할 필요성이 매우 높다.

  인삼의 환경 stess 중에는 인삼의 뿌리생장에 관여하는 토양환경이 가장 중요한 것으로서 생장에 필요한 영양분, 특히 N, P, K, Ca, Mg, Fe등의 무기물이 인삼생육에 큰 영향을 미치지 있다. 그러나, 현재 재배하고 있는 인삼포장은 이들 무기질의 함량이 너무 많아 생육장해현상이 뚜렷하고 인삼의 품질마저도 나쁘게 하는 결과를 초래하므로 이런 나쁜 환경에 견디는 염류내성 인삼유전자의 선발과 품종개발이 절실히 필요한 실정이다. 염류내성 인삼계통선발은 인위적으로 영양물질이 과다하게 조절된 in vitro 혹은 포장환경에서 용이할 것으로 생각되며, 또한 stress 조건하에서 어떤 유전자가 발현하는 지의 여부도 탐색하므로써 염류 stress관련 유전자의 screening과 형질전환이 가능하게 될 것으로 생각된다. 그리고 우수한 유전자를 소지하고 있는 인삼계통을 선발하였다고 하더라도 인삼조직세포에서 재분화가 이루어져야 형질전환체 생산 및 대량증식이 가능하게 되므로 in vitro에서 대량증식 할 수 있는 기술 또한 반드시 개발되어야 할 것이다.

제 3 장 연구개발의 내용 및 범위
  염류 stress내성 인삼과 기내증식 기술을 개발하기 위하여 다음과 같은 연구를 수행하였다.

염류 Stress 내성 인삼계통의 신규 선발 및 포장 검정
● 기내선발

● 포장선발

염류관련 유전자에 의한 임삼의 형질전환 및 기내증식기술 개발
● Sall gene의 식물형질전환용 운반체에 재조합 및 형질전환

● Ferritin light heavy chain유전자에 의한 임삼의 형질전환

● Betain aldehyde dehydrogenase dbwjswkdp 의한 인삼의 형질전환

● 인삼 Sall gene의 cloning 및 운반체 재조합

제 4 장 연구개발결과
  고염류 토양에서도 견딜 수 있는 인삼계통을 선발, 육성하고 염류관련유전자를 탐색하여 이를 형질전환 시켜서 재분화 시키는 기술을 개발하기 위하여 본 연구를 수행하였던 바, 그 결과는 다음과 같다.

4.1 염류 Stress 내성 인삼계통의 신규 선발 및 포장 검정
기내선발
● '98년도와 '99년도에 각각 39 계통과 64계통을 고염류 MS배지에서 배배양하면서 배 의 경장과 엽색을 조사하여 선발한 결과, '98년도 공시계통 39개중에서 79302, 86038, 82096, 86053 계통은 경장과 엽색이 정상으로서 염류 stress 내성 계통인 것으로 추정되었다. 또 86050, 82722, 85074 도 비교적 염류 stress 내성계통이었다. 86108등 21개 계통이 고염류 배지상에서 배신장이 전혀 안되어 염류에 민감한 계통인 것으로 나타났다.

● 99년도 공시계통 63개 중에서, 다416, 84718, 86003, 82004는 염류stress에 강한 계 통인 것으로 나타났고, 82115, 78206, 천풍(KG101)은 염류stress내성계통으로 판단되었다.

포장선발
● 예정지에 복합비료를 인삼 작토층에 전층시비하여 토양의 염류농도을 재배 한계선 이상으로 시용하고 계통별로 묘삼을 난괴법 3반복으로 이식후 잎 황병 발생율과 생존율 등을 조사하여 염류 stress 내성을 점검한 결과, 2년생 계통에서는 82105, 85080, 86038 계통이 염류 stress 내성계통이었다.

● 3년생 계통에서는 황병발생율과 생존율, 근부율을 종합하여 볼 때, 염류 내성 계통 은 82068, KG106, 86031, 82887 계통들이었다.

● 4년생 계통에서는 황병발생율과 생존율, 근부율을 종합하여 볼 때, 염류 내성 계통 은 85735, KG101, KG108, 농자경, 황숙종의 5계통이었다.

● 기내실험과 포장선발간에 계통간 반응이 상이한 계통이 많았다. 그러나 KG106, 86038 계통은 기내와 포장에서 공히 염류 stress내성인 것으로 나타났다.

4.2 염류관련 유전자에 의한 인삼의 형질전환 및 기내증식기술 개발
Sall gene의 식물형질전환용 운반체에 재조합 및 형질전환
● 염류내성관련 유전자인 Sall gene에 의하여 인삼을 형질전환시키기 위해서 수확직 후 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 종자를 개갑시킨 후 저온처리하여 발아직전의 자엽을 이용하여 형질전환을 수행하엿다. 형질전환체는 식물홀몬을 첨가하지 않은 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지에 5% sucrose와 항생제가 첨가된 배지에서 단일배를 선발하였다.

● 단일배의 발생은 식물호르몬 무첨가배지에서 자엽의 상태에 따라 단일배가 형성되 는데 단일배의 경우에는 정상적인 뿌리의 발육이 가능하여삳. 그러나 식물호르몬을 첨가하지 않았기 때문에 형질전환율이 매우 낮았다.

● 형질전환단일배의 경우에는 뿌리의 발육이 양호하지만 식물호르몬 무첨가배지에서 독성을 가진 항생제가 첨가된 선발배지를 사용한 인삼형질전환시시템에서는 형질전 환빈도가 매우 낮아 많은 단일배를 획득할 수 없었다. 따라서 일차적으로 선발배지 에서 형성된 형질전환 단일배를 배양하여 체세포배를 만든다음 다시 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 접합자배를 발생시킨 방법과 동이하게 이차배발생을 통해서 증식시킨 결과 매우 많은 량의 형질전환 단일배를 획득할 수 있었다. 그러나 이차배의 경우에는 형질전환된 체세포배의 크기가 적어도 심장형이후에 3mm이상이 되어야 단일배의 발생이 가능하였다.

● 단일배를 발생할 경우에는 식물호르몬을 첨가하지 않고 발아직전의 자엽을 사용하기 때문에 단일배의 발생이 기분의 바로 윗부분에만 형성되지만 식물호르몬을 첨가할 경우에는 비록 뿌리의 발육이 불량한 다배형태이지만 자엽의 전면에 형성되었다. 또한 plasmolysis를 시켜 자엽을 원형질분리 직전까지 유도한 후 배발생을 할 때에도 식물호르몬을 첨가한 것 같이 전면에 배가 형성되었지만 모두 단일배의 상태로 생장하였다.

● 따라서 염류관련유전자에 의한 인삼 형질전환체의 발생을 위해 인삼 체세포배의 자 엽을 1M설탕용액에 1일간 원형질분리 처리 후 회복시키고나서 MS기본배지에 배 양하였는데 이 경우 거의 모든 자엽에서 고빈도로 배가 발생되었으며 발생된 배가 대부분 접합자배와 같은 단일배로 발생되었다.

● 형질전환 체세포단일배를 발아시키기 위해서 지베렐린 1mg/1, 또는 -2-4℃에서 저 온처리하여 발아시켰다. 발아된 체세포배로부터 식물체의 생장을 촉진시키기 위해 서 1/2, 또는 1/3 MS 배지에 옮겨 재분화체를 획득하였다.

Ferrtin light heavy chain유전자에 의한 인삼의 형질전환
● Ferrtin light heavy chain gone은 식물 발현용 promoter인 35S promoter를 사용하 고 terminator는 Tnos를 사용하였으며 식물세포형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하여 최종적으로 kanamycin내성유전자(NPT II gene)와 tadpole ferritin heavy chain gene 및 human ferrtin light heavy chain gene를 함 유하고 있는 binary vector를 재조합하였다.

● Binary vector이 아그로 박테리움에 도입은 tri-parental mating 방법에 의하여 수행 하여 AB배지 및 kanamycin함유 배지에서 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 Agrobacteirum tumefaciens MP90/FLHC을 선발하였다.

● Ferrtin light heavy chain gene이 도입된 식물형질전환용 binary vector를 이용하여 작년에 개발한 형질전환방법을 변형하여 많은 embryo를 유도하였으며 유도된 embryo들은 GA 10mg/L가 첨가된 배지에 지상부를 유도하였다. 형질전환식물체의 정상적인 생장을 유도하기 위해 최적의 배양조건을 조사하였던 바, 비교적 1/3MS 배지에서 뿌리의 생장과 지상부의 생장이 균일하게 생장하는 경향을 보였으며, 뿌 리와 줄기가 잘 발달된 약 7cm의 유식물체를 대량으로 증식하여, 모래와 흙이 1:1 로 혼합된 토양에 옮겼다.

Betain aldehyde dehydrogenase 유전자에 의한 인삼의 형질전환
● 염류내성 식물은 염류농도의 변화에 따라 세포내의 삼투압을 유지하기 위한 화합물 을 합성하는 기작을 가지고 있는데 이런 화합물은 주로 proline, glycine, betaine, polyols, sugar등으로 체내에 축적함으로서 고농도의 염류에 견디는 것으로 알려져 있다.

● Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성되는데, 첫단계는 choline dehydrogenase(CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다.

● 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아크로박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2종을 획득하였으며(Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector가 식물 에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시 켰으며, 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하엿고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환체임을 확인할 수 있었다.

● 인삼에 Bet A, Bet B gend의 도입은 단일배발생방법에 의해서 이미 각각의 유전자 도입에 의하여 형질전환체를 획득하였으나 형질전환체의 발생빈도가 매우 낮았다.

인삼 Sall gene의 cloning 및 운반체재조합
● NaCl의 농도를 0.5%로 10일간 처리한 인삼모상근에서 일차 확인된 3'(2'),5'- bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)을 Arabidopsis에서 나타난 primer를 이 용하여 염기서열을 분석하였으며 Arabidopsis와는 90%의 homology를 가지고 있었 으며, 아미노산 서열을 비교한 결과 84.4%의 homology를 가지고 있었다.

● 인삼에서 cloning한 3'(2'),5'- bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene) 유전자에 발현정도를 높일수 있는 강력한 promoter를 재조합하여 다시 인삼에 형질전환시켜 염류내성을 증진시키고자 식물형질전환용 vector를 재조합 하였다.

● 인삼 발현용 promoter는35S-35S-AMV promoter를 사용하고 있는 terminator는 Tnos를 사용하였으며 식물세포형질전환용 pRD400 binary vector를 사용하여 kanamycin 내성유전자(NPT II gene)와 Sall gene를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall을 선발하였고, 인삼의 형질전환에 바로 사용할 수 있도록 조립하였다.

제 5 장 연구개발결과의 활용계획
  본 연구에서 얻은 결과, 즉 염류 stress 내성 인삼계통의 선발연구는 포장에서 염류 stress 내성으로 판명된 계통은 육종 절차에 따라 계통의 특성 구명, 생산력 검정 및 지역적응력 시험 등을 계속 실시하여 품종화에 활용할 계획이다. 염류관련 유전자에 의한 형질전화체 선발연구는 인삼신품종 육성에 활용할 것이며, 인삼조직 세포로부터 체세포배 및 어린식물체를 분화시키는 기술은 인삼계통의 대량증식에 직접 활용할 계획이다.

SUMMARY
제 1 장 Title of the study
  Selectio and mass propagation of superior ginseng lines tolerand to environmental stress

제 2 장 Objectives and importance of the study
  Korean ginseng(Panax ginseng C.A.Meyer) is one of the economical crop in our country. The products and consumption of ginseng have increased both in and out of the country. And Korean ginseng is a perennial medicinal herb that grows under shade. Thus it should be cultivated under arfificial shade protecting direct sunlight, which requires much labor. It grows slowly for3-5 years in a place until root harvest so that it is subijected to various natural disasters such as root diseases like root rot, drought, and adverse soil environments unfavorable for pland growth. Especially, it is very difficult to obtain stable porduction of qualified gineseng roots because of variable stresses in soil environments.

  In environment stresses, soil condition is the most importand factor, among which nutrients, especially inorganic materials such as N, P, K, Ca, Mg, Fe, etc., influence greatly on the gineseng growth. And also salt stress in one of the most serious factors limiting the productivity of agricultural crops. However, present ginseng field soils in Korea contain somuch amount of such inorganic materials that a varie쇼 of remarkable disorders were noted in many ginseng plantations, resulting in decrease of qualitative gineseng production. Therefore, it is required to search for genetic resources and genes tolerant to salt stress for the development of ginseng cultivars.

  Selection of stress-tolerant gineng lines can be studied with ease through in vitro culture and field conditions controlled with high concentrations of inorganic nutrients because of vasy manipulation of stress conditions. In addition, it is possible to screen stress-related genes by observing genes expressing in the conditions with selected degrees of stress, which in turn can be used for gene transformation. Development of ginsend cultivars with proper transgenes and their mass propagation can not be done without plant regeneration, although ginseng lines containing favorable genes would be successfully selected, which gives a rationale of our study.

제 3 장 Research area and contents
  Research area and contents are outlined as follows;

Selection of ginseng superior lines tolerant to salt stress through in vitro and field tests
● In vitro selection of gineseng lines tolerant to salt stress

● Field test of gineseng lines tolerant to salt stress

Transformation of ginseng with salt-related genes and in vitro culture
● Trandformation and construction of binary vector with Sal 1 gene for transformationof ginseng

● Transformationof of ginseng with ferritin light heavy chain gene

● Transformationof of ginseng with betain aldehyde dehydrogenase gene

● Cloning and recombination of Sall gene from ginseng

제 4 장 Results and proposal for applications
  This study was conducted for the selection of ginseng lines tolerant to salt stress, ginseng transformation using salt-related genes, and in vitro propagation through somatic embryogenesis. The results are summarized ad follows;

4.1 Selection of gineseng lines tolerant to salt stress
In vitro selection
● The zygotic embryos of ginseng lines bred in Korea Gineseng & Tobacco Research Institute were cultured on the MS medium with 2.5 folds of inorganic salts for the selection of ginseng lines tolerant to salt stress. In 1998, 7 lines among 39 ginseng lines examined, such as 79302, 86038, 82096, 86053, 860050, 82722, and 85074 lines showed sensitive to the salt stress. In 1999, 4 lines among 63 ginseng lines were found to be highly tolerant to the salt stress.

field selection
● Seedlings of ginseng lines bred in Korea Ginseng & Tobacco Research Institute were transplanted in the field controlled with over 0.2 dS/m of EC for the selection of ginseng lines tolerant to the salt stress. Therefore, 3 lines at two-year old, 4 lines at 3-year old, and 5 lines at 4-year old were found to be tolerant to the salt stress. Especially, KG101 and 86038 lines showed tolerant to the salt stress both in in vitro and in field.

4.2 Transformation of ginseng with salt-related genes and in vitro culture
Transformation and construction of binary vector with Sal 1 gene for transformation of ginseng
● Ginseng seeds contain extremely immature embryos just after havest, and stratified in humidified sand to mature. To introduce salt-related gene, Sal1, to ginseng, embryo just before germination after stratification used for transformation. Single somatic embryos were formed on the phytohormone free MS media contained with 5% sucrose and antibiotics

● Single somatic embryos of ginseng formed on the media without any phytohormone at special stage of zygotic cotyledon(just before germination) developed normal plantlets like zygotic embryo. However, Transformation rate using single somatic embryo method was very low, because of culture without any hormone.

● Because of low transformation using single somatic embryo methods on the antibiotics contained media without any hormone, it is need to produce a lots of transgenic single embryo using the secondary embryo formation technology from single embryo transforned with low frequency.

● When the cotyledon explants of immature ginseng zygotic embryos were cultured on MS medium lacking growth regulators, somatic embryos formed directly near the basal excised regions of cotyledon surfaces. Most of these somatic embryos developed in a multiple state, fused to each other and to the parent cotyledon explants.

● When the cotyledon explants were pretreated with 1.0M sucrose ofr 24-72h. the frequency of single-embryo formation was markedly enhanced.

● When somatic transgenic single embryo of Panax ginseng were treated with 1mg/L GA and chilling of -2 ~ 4℃, greening and germinating of somatic embryos were rapidly induced.

Transformation of ginseng with ferritin light heavy chain gene
● The chimeric ferritin light heavy chain gene(FLHC), 35S/35S/AMV/FLHC/Tons, has been constructed. This chimeric gene was introduced into the binary vector pRD400 containing kanamycin resistant gene for ginseng transformation.

● This binary vector with FLHC gene was thereafter mobilized into Agrobacterium tumefaciens strain MP90 harboring disarmed Ti-plasmid using tri-parental mating method.

● The resulting strains were used to transform ginseng using the single embryo and secondary embryo formation technology. Tansgenic shoots of ginseng were formed from secondary embryo on the media with GA 10mg/L. These shoots were well developed the root and stem, grew 7cm length height, and transferred to the soil mixed with sand and soil(1:1).

Transformation of ginseng with betain aldehyde dehydrogenase gene
● Salt-resistant plants synthesize compounds for maintaining osmotic pressure. Especially, proline glycine, betaine, polyols, and sugar were accumulated in cell for salt resistance.

● Betaine was synthesized from choline in 2 step. In each step, choline dehydrogenase(CDH) from bet A gene and betaine aldehyde dehydrogenase(BADH) from bet B gene were performed.

● 2 Agrobactgerium conjugants were acquired with bet A and bet B gene ( A. tumefaciens MP90/pBet A, A. tumefaciens MP90/pBet B). To confirm‎ the transformation of the binary vector tobacco was transformed and the tobacco transformant can grow on media containing high concentration of kanamycin. The transformant was confirmed by PCR band.

● The transformants of ginseng with bet A, bet B genes were acquired but the transformation rate was very low.

Cloning and recombination of Sall gene from ginseng
● From ginseng hairy root cDNA treated with 0.5% NaCl for 10days, 3'(2)', 5'-bisphosphate nucleotidase gene(sal I) was cloned and sequenced. This gene sequence showed 90% homology with sal I in Arabidopsis and the amino acid sequence 84.4%

● The binary vector for ginseng transformation was constructed with Sal 1 gene derived from ginseng and vector with high level expression‎ in the plant to increase the expression‎ level of salt resistnace.

● This binary vector of pRD400 contained 35S-35S-AMV promoter and Tnos terminator was used for expression‎ and transformation of ginseng. By tri-parental mating method, we selected conjugant, A. tumefaciens MP90/Sal I containing kanamycin-resistant gene.

제 5 장 Suggested Applications of Results
  Ginseng lines selected in this study will be continuously examined for productivity and quality eval‎uation. And then superior lines among them will be developed as new ginseng varieties with salt tolerance in the ginseng breeding program of Korea Ginseng & Tobacco Research Institute. Techniques of inducing somatic embryos from transformed ginseng tissues will be applied to the advanced biotechnoloty for the mass production of ginseng superior lines.

제 1 장 서 론
  고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 재배인삼이 발달하기 이전에는 오히려 야생인삼(산삼)을 가리켰고 한국과 중국을 비롯한 동양에서 수 천년동안 보혈강장제로 이용해온 신약영초로서 민간의사들에 의한 경험으로 개발되어 약용으로 이용되면서 야생인삼은 점진적으로 고갈되기 시작하였고 이에 자연스럽게 인공재배가 발달되었다. 인삼재배에 관한 기록은 연대의 정확한 표기는 없지만 1900년대에 들어와서 임간재배에서 밭으로 내려와 기업적인 인공재배법이 발달되었으며 반음지성 식물인 인삼의 재배를 위하여 해가림 시설에 직사광선 투입을 막기 위해 해 지는 방향으로 두둑방향을 잡았고, 체형을 중시하여 직파재배에서 이식재배로 전환하기 위한 육묘기술 개발을 위하여 심산의 퇴적낙엽과 쌀겨, 유박, 고랫재, 초목회등을 혼합 독창적인 복합 유기질 비료인 약토를 만들고, 약토와 원야토를 배합, 상토를 조제한 양직묘포 재배방법을 개발하여 품종분화없이 혼계상태로 재배되어왔다.
  현재 재배되고 있는 인삼의 잎과 줄기 그리고 뿌리를 자세히 관찰하여 보면 여러 가지 모양의 많은 유전자형을 가지고 있는 혼계상태로서 개체간의 형질변이가 대단히 심한것둁? 알 수 있다(최광태 등,1982; 최광태 1983; 최광태' 1988). 인삼식물에 나타나는 형질의 차이는 그것이 갖는 선천적인 유전자의 차이와 환경의 차이에 의하여 일어나므로 집단내의 변이를 모두 유전적이라고 할 수는 없다. 그중 환경적인 차이에 의하여 나타나는 환경변이는 우수 품종을 육성하는데 있어서 중요한 문제가 되는 것으로, 아무리 유전적으로 우수한 형질을 가졌어도 유전적인 형질을 발휘할 수 있는 적합한 재배조건을 결정해주지 않으면 소용이 없을 것이다. 특히 인삼은 다른 작물과 달리 해가림 구조하에서 재배하므로 재식위치, 수광량, 강우량, 온도, 바람의 강도, 토양의 비옥도, 수분함량, 통기성, 토양의 경도, 산도, 염류농도 등의 환경적 요인에 따라 형태적, 생태적, 생리적 형질의 변이가 심하지만 신품종육성에 장기간이 소요되는 인삼에서의 유전적 변이는 다양한 것이며, 품종의 분화가 이루어지지 않은 혼계상태의 인삼집단에서 유용한 유전자형을 선발하여 우수품종으로 육성할 수 있는 가능성은 충분하다. 그러나 인삼은 4-6년후에 수확하는 다년생 작물로서, 목적으로 하는 것이 뿌리이기 때문에 생육 초기에 지상부형질을 통하여 인삼이 좋고 나쁨을 직접 판별할 수 없고, 또 지하부 형질, 즉 뿌리를 조사하기 위하여 재배 도중에 인삼을 채굴한다는 것은 매우 어려운 일이므로 육종재료로서는 대단히 불편한 작물이다.
  재래 혼계종 인삼의 육종 목표로서는 1)뿌리 형태가 양호한 다수성 품종 육성, 2)병해충에 저항성이 강한 품종육성, 3)환경 stress내성 품종육성 등을 들 수 있는데, 이중 환경 stress, 특히 염류함량이 많은 토양에 잘 견디는 인삼품종을 육성하는 것은 대단히 시급한 실정이라 할 수 있다.
  인삼생육에 적정광량은 자연광량의 3-20^사이(김명수 등, 1984; Kuribayashi 등, 1971; 이종철 등, 1982)의 낮은 조건이고 그 보다 높은 조건이면 근중이 감소하고 엽록소가 분해되어( 미澤洋一 1975) 조기낙엽이 되고 뿌리 비대가 불량해진다. 그러므로 인삼재배에서 해가림재배를 한다. 해가림재배하에서는 동화량이 적으므로 양분의 요구도가 일반 양지식물의 량보다 적다. 인삼이 2년생시부터 6년생시 까지 4년간 흡수하는 질소는 300평당 10.24kg, 인삼은 2.31kg, 칼륨은 10.86kg인 것으로 보고(이종화 등, 1978; 미澤洋一, 1975)하였고, 이 등(1980)은 질소 18.7kg, 인산 5.6kg, 칼륨은 19.4kg, CaO는 9.3kg, MgO는 3.9Kg인 것으로 보고한 것으로 보아 타 일반 작물양분 요구량이 적다. 그러나 '85년도 송 등(1984)의 예정지 토양조사에서 토양의 양분함량이 적정치 보다 높은 포지 비율은 pH가 25.9%, 유기물이 9.8%, P2O5가 52.9%, K는 26.6%, Ca 26%, Mg가 4.7%였다. 이들 성분과 토양의 NH4-N과 NO3-N이 높을 때 토양의 염류농도:전기전도도(EC)가 증가한다(남기열, 1992; 송기준 등, 1985; Vasil 등, 1981). EC가 적정범위 보다 높은 인삼 이식에정지 포지비율이 33.2%였다. 일본의 경우(大미미미, 1970)는 인삼재배에 기비와 추비로 시용하는 성분량은 생육에 필요한 적정양분량 보다 질소는 2.5배, 인산은 1.2배, 칼륨은 20배정도로 많은 량을 시용하고 있다고 하였다. 이는 일반작물 재배습성으로 시비한 결과로 해석되고 인삼생육에는 소량의 양분만 필요함을 의미하고 있다. 우리나라는 화학비료 사용이 용이하게 된 1960년대 후반부터 일반 밭토양에 시비한 질소, 인산, 칼륨, 난분해성 마그네숨의 시용은토양에 이들 성분이 축적되어 결과적으로 인삼의 생육적정 성분함량보다 높다. 일본도 마찬가지인 결과를 보이고 있다. 그러나 미국의 인삼포 토양은 우리나라 토양과는 반대로 토양중 P2O5, K, Mg와 정상관을 보이고 있다(Khwaja 등, 1984). 이는 미국은 인삼재배지는 미경지를 활용하는 것으로 보여 적정포지 구득이 용이한 것 같다. 토양중 NO3-N이 높을 때 결주율이 높아졌고(이종화 등 1982), NH4-N이 높을 때 인삼이 조기에 낙엽되고 수량이 감소(박훈 등, 1983)와 적변삼 발생량이 많아지고(김명수 등, 1984; 오승환 등, 1979) 인삼의 호흡량과 증산량이 저하되어(김명수 등, 1984) 토양중 근부병균의 밀도가 높아진다(오승환 등, 1979). 토양의 염류농도가 0.1mmohs/cm이상부터는 그 값이 증가할수록 인삼잎의 황화현상이 증가(남기열, 1991)하고 뿌리 결주가 증가하고 수량이 감소하고(목성균 등, 1984) 페포지가 증가(남기열, 1991)하였다. 남등(1991)에 의하면 황병발생지와 폐포지는 K/Mg비가 높고, EC의 증가에는 수용성 양이온중에서는Ca++, 음이온 중에서는 NO3-가 가장 큰 영향을 주었다. 토양에 염류의 집적으로 인한 EC증가는 지상부 생육보다 지하부 생육 감소가 더 크고 잎과 뿌리중의 N, P, K 및 Mn함량이 증가되고 Mg함량에는 별 영향을 주지 않았다. EC가 0.3mmhos/cm이상이면 생육장해 현상이 뚜렸하고 뿌리중 인삼의 유효성분인 사포닌함량이 크게 감소하였고(남기열, 1991) 조기낙엽의 증가는(박훈 등, 1983) 홍삼제조시에 내공과 내백삼이 증가되어(이종화, 1977) 인삼의 품질마저도 나쁘게 하는 결과를 초래하므로 토양의 환경 stress, 특히 염류장해 환경에 견디는 내염성 유전자원의 선발과 품종개량이 대단히 중요하다. 그러나 인삼은 생육이 느리고 한 세대가 4년으로서 장시간이 소요되므로 염류내성 인삼개발을 포장에서 직접 수행하기에는 문제가 많기 때문에 기내배양을 통하여 단시간내에 선발할 수 있는 기술개발이 절실한 실정이다. 그리고 염류내성 유전자 탐색을 기존의 방법을 적용하게 되면 장기간이 소요되나 새로운 유전자를 찾거나 이미 알려진 유전자를 조작하여 형질전환시키면 단시간에 염류 stress 내성인삼을 육성할 수 있으므로 이들에 관한 기술개발 또한 대단히 중요하다.
  인삼은 종자를 통하여 번식할 수 있으나 체종하는데 3-4년이 소요됨과 동시에 1회 채종량이 대단히 적은 작물로서 타식물에 비하여 우수품종 육성에 장구한 세월이 필요하며, 또한 우수품종을 육성하였다고 하더라도 동일한 유전자형을 지닌 개체수 증식에도 상당한 시일이 요구되므로 이러한 불편하고 어려운 점을 해결하기 위하여 인삼의 조직배양기술이 개발 확립되어 단시일내에 homologous gene을 지닌 개체수를 대량으로 증식할 수 있는 기반이 구축되어야 할 것이다. 인삼의 조직배양은 1968년 Butenko(1967,1968)가 인삼의 잎, 줄기, 화기, 뿌리 등의 조직의 callus에서 식물체를 유기한 한 것을 시작으로 Chang(1978, 1980), Harn(1983), Lu(1981), Vasil(1986) 등에 의하여 callus 유기에 대한 연구결과가 보고된 바 있으며, 최근에는 callus로부터 기관을 재분화시키는 연구들이 많이 수행되고 있으나, 아직가지 체계적으로 되어 있지 않으며, 특히 뿌리의 분화 및 비대생장이 원할이 이루어지지 않아 유묘의 대량생산에 큰 문제점으로 대두되고 있는 실정이다.
  최근 식물유전공학기법의 발달로 유전자조작에 의한 많은 유전자들이 cloning되었으며, cloning된 유전자를 다시 강력한 promotor로 재조합후 식물세포에 형질전환시킴으로서 새로운 식물체를 개발하고 있다. 염류관련 유전자는 Huraki(1993), Jolley(1996), York(1985), Hiraga(1996) 등에 의하여 methicillin resistant gene, dihydrolipoamide dehydrogenase, angiotansin I-converting enzyme gene 등이 개발되었으며, 이미 genebank에 수백편의 관련 논문들이 보고되고 있다.
  염류관련유전자중에서 중금속 등에 대항하는 방법으로 metallotheionein, ferritin등의 단백질을 합성하여 이들 단백질을 통하여 일부 중금속과 결합, 저장 및 운반하여 무독화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Laulhere 등, 1988; Price 등, 1983). 식물에서도 최근 ferritin이 정체, 특성화되어 주로 철의 저장 및 운반, 그리고 중금속의 정화기능이 보고되어 있다. 산화절(F2+, F3+)과 높은 결합특이성을 보이는 ferritin은 많은 양의 철과 결합하여 철을 필요로 하는 기관에 운반하여 재공급하는 기능과 세포에 여러 대사작용에 필수적인 metal-binding protein (cytochromes, nitrogenase, ribonucleotide reductase, hemoglobin)등에 co- factor로 철을 공급하는 생리, 활성적인 측면과 세포내의 고도한 산화철에 의해 발생되는 OH-, O2- 등과 같은 radical 독성을 무독화 하는데 중요한 기능을 수행한다(Price 등, 1983; Zhou 등, 1981). 또한, firritin은 Fe3+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Be2+, Al3+ 등의 중금속 등과도 in vivo와 in vitro에서도 결합할 수 있어 이들 중금속 이온들의 무도화제로서의 역할을 수행할 수 있을 것으로 제안되고 있다(Zhou 등, 1981; 송기준 등, 1984)
  이상의 많은 문제점을 해결하여 염류농도가 높은 우리나라 인삼재배지에서 품질이 양호한 고려인삼을 안정적으로 생산하고자 고염류 토양에서 정상적인 생육을 할 수 있는 염류내성 인삼계통의 선발, 육성, 유전자탐색 및 기내증식기술개발 연구를 수행하였던 바 이에 그 결과를 보고한다.

제 2 장 국내외 기술개발 현황
2.1 국내 기술개발 현황
  국내에서는 시설원예 분야에서 염류축적에 의한 원예작물의 생산성이 급격히 저하되어 연작에 문제가 되고 있으며, 해안지역과 바다매립지에서는 염류장해가 심각하게 대두되는 등 염류장해의 문제점이 증대되고 있는 실정이다.

  Chae 등 (1988,1989)은 수도의 캘러스에서 NaCl 내성 세포주를 선발하였고, Ryu 등(1991)은 조직배양에 의한 알팔파의 내염성 계통을 선발하였다. 고려인삼에 sucrose를 5%, 2,4-D를 1 mg/1 첨가한 배양기에서 체세포배의 발생이 양호하였으며, 구형의 체세포배를 GA 10-7 M 첨가하여 15℃에서 배양하였을 때 정상적인 배로 발달하였고(최광태, 1988), 인삼의 배를 적출하여 Knudson배지에서 배양하였을 때 유식물체가 양호하게 생장한다고(이만상, 1982) 보고하고 있다. 또한 Sea salt와 NaCl을 농도별로 처리하여 벼의 켈러스유도와 생장을 조사한바 있다(정현숙, 황백, 1982).

  본 연구의 1단계 연구에서는 인삼계통(총 50계통)을 MS 기본배지에서 2.4배의 염류를 처리하여 배배양한 결과, 78135, 81736, 82886, 85090, 풍기황숙 등 5계통이 자경종에 비하여 염류내성을 나타내었다. 총가로티노이드 함량은 미국삼이 고려인삼보다 높았고 엽록소 함량도 같은 경향이었으며 유리당 사포닌 및 전분함량을 3년생 뿌리에서 조사한 결과, 유리당은 종간에 유의차가 없었으며, 총사포닌과 전분함량은 미국삼이 타종보다 높았다. Amylase의 활성은 미국삼>자경종>황숙종 순으로 높았으며, peroxidase와 total dehydrogenase 활성도는 자경종>황숙종>미국삼 순이엇고, glucose-6-phosphate- dehydrogenase 활성도는 고려인삼에서 비교적 높은 경향이었으나 미국삼에서는 활성도가 낮아 측정 할 수 없었다. 식물홀몬 무첨가 NaCl함유 배지에서 인삼 미숙배의 절편을 이용하여 많은 체세포배를 유기하였으며, 인삼조직 세포로부터 somatic embryo를 성공적으로 유도하였다. 인삼자엽으로부터 직접 식물체를 유도할 경우, 배양재료로서 자엽의 성숙시기가 배의 발생율 및 뿌리를 갖는 식물체의 유도에 있어 가장 중요한 요소임을 알 수 있었고, 배지내의 암모늄염은 기내 유식물체의 뿌리생장을 강하게 억제하는 것으로 조사되어, 뿌리의 생육을 정상적으로 하기 위하여는 암묘늄염의 농도를 감소시켜야 자엽형배의 후숙을 통하여 인삼의 뿌리와 줄기를 갖춘 유식물체를 재분화시킬 수 있었다.

  염류관련 유전자를 이용한 식물의 형질전환체 개발 연구는 국내에서는 아지까지 활발하지 못하며 또한 지금까지 뚜렷한 결과가 도출되지 않고 있는 실정이다.

2.2 국외 기술개발 현황
  국외에서는 오래전부터 염류내성 농작물의 육종에 많은 관심을 가지고 심도있는 연구가 수행되어왔다. 처음에는 조직배양에 의하여 염류내성을 싫험하였으며, 최근에는 염류내성 실험을 위해서 whole-plant 반응을 검정하는 염류내성 선발을 하여야만 된다는 보고가 지배적이다. 소맥의 품종들을 이용한 염류내성 선발 기내실험으로서는 수경재배 방법을 선발 tool로 이용한 실험(Gorham et al., 1984)을 비롯하여 in vitro 배양기술을 염류내성 선발실험에 성공적으로 도입한 연구(Maddock et al., 1983), 소맥배배양 실험(Diaz De Leon et al., 1995)등 많은 연구가 진행되고 있다.

  선진 미국이나 일본 등에서는 환경 stress 저항성 계통을 육성 보급하고 잇고, 종묘의 대량생산을 위한 기업체적 연구가 진행되고 있다.

  담배(Samsun)의 현탁배양세포에서 NaCl의 농도를 높여 NaCl-tolerant cell line을 얻었던 바, 최대 tolerant 농도는 8.8 g/l 이었고 이들 line으로부터 재분화된 식물체를 얻었다.(Nabore, 1975, 1980). UV 조사로 돌연변이를 시켜 Na+ dependant variant인 두 line을 얻어서 parant cell이 죽는 33-64 mM Na+ 에서도 생장시킨 바있다(Zhou Jia-Ping, 1981) 조직배양에 의한 내염성 알팔파 및 담배계통을 육성하여 내염의 생화학적 기작을 구명(Groughan et al., 1978; Devine et al., 1976; bouten et al., 1983)하였고, 조직배양에 의한 대량번식 체계를 확립하여 식물종묘 공장화에 주력하고 있는 실정이며, 또한 일본에서는 조직배양기술을 하이테크 농업의 선도기술로 활용하고 있다(Hasimoto et al., 1993).

  환경조절공학의 일환으로 광독립영양배양 및 CO2 등 배양환경 개선에 의한 건실묘 생산을 주도(Deng et al., 1994, Kozai et al., 1988, 1993; Kvaalen, 1991)하고 있으며, 강제 통기 방식에 의한 무균적 배양시스템 모델을 개발(Aoki et al., 1992)하여 실용화 단계에 이르고 있다. 귀리 및 벼의 내염성 캘러스로부터 재분화된 식물체는 내염성을 나타내고, 그 다음 세대에서도 내염성을 보유함이 보고되었다(Nabors et al., 1975, 1980).

  인삼에 대한 연구는 세계최초로 인삼조직에서 기관발생 및 체세포발생에 성공하였고(Butenko, 1968), 인삼의 원형질체배양을 통하여 체세포배를 유기하였으며(Arya, 1991), 인삼의 뿌리 캘러스로부터 체세포배를 유도하였다(Chang, 1980).

  최근의 식물의 내염성 관련 연구로는 PCR에 의해서 methicillin-resistant gene이 cloning 되었고(Huraki, 1993), Dihydrolipoamide dehydrogenase gene이 Haloferax volcanii에서 clonning을 성공하였다(Jolly, 1996). 그밖에 angiotensin I-converting enzyme gene(Hiraga, 1996)이 cloning 되었고, salt tolerance를 위한 PP2 protein phosphatase gene이 yeast cell에서 cloning 되었다(Posas, 1995).

  또한 Ferritin에 대한 기작 및 작용 등이 밝혀졌으며(Price, 1983), Maize, pea 및 soy bean의 종자로부터 ferritin이 분리되어 특성이 검정되었고(Laulhere, 1988; Sczekan, 1989), Maize, pea 및 soy bean의 seed로부터 ferritin이 분리되어 특성이 검정되었으며(Laulhere, 1988; Sczekan, 1989), Arabidopsis로부터 metallothionein 유전자가 cloning되어 functional homology를 보고(Zou, 1988)하였다. 그리고 2000년에 보고된 주요한 내용을 보면 NaCl stress와 peroxidase 활성과의 관계(Lin et al., 2000), 염류내성 품종과 잎 apoplast 내의 Na+ 농도와의 관계(Muehling et al., 2000), SOS(salt overly sensitive) 유전자와 Na+, K+ 농도와 의 관계(Shi et al., 2000), DnaK 1 유전자와 salt stress와의 관계(Hibino et al., 2000), stress와 proline 함량과의 관계 (Gleeson et al., 2000), osmotic stress와 ABA와의 상호작용(Maskin et al., 2000)등으로서 salt stress와 식물과의 상호작용 연구에 많은 비중을 두고 있다는 것이 입증되고 있는 실정이다.

제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과
3.1 연구개발 수행내용 및 방법
3.1.1 염류stress 내성 인삼 계통선발
(1) 기내선발
  염류내성 인삼 계통의 기내선발을 위하여 개갑 및 저온처리를 한 102계통의 배를 MS 기본배지에서 N, P, K, Mg, Ca, Na, Fe를 2.5배로 조절한 고염류 고체 aga배지 에 10개씩, 10반복 치상하여 '98' '99년도에 실시하였다. 염류내성 계통선발 기준은 배 가 갈변, 고사하지 않고 녹색잎을 유지하면서 건전하게 생육한 개체율이 높은 계통을 선발하였다.

(2) 포장선발
(2)-1.2년생 시험1 : 예정지 염류처리 시험
  예정지 관리가 완료된 대전시험포에 토양의 EC를 높이기 위하여 1999년 12월에 분쇄한 경기화학 복합비료(N-P-K;11-10-10과 Mg;3%, B;0.3%)를 칸(L 1.8m × W 0.9m × D 0.2m)당 283.3g씩 24칸에 대하여 전층시비하였다. 2000년 5월 12일의 토양 EC5는 0.23ds/cm로서 염류농도가 인삼 이식한계선인 0.2ds/cm 보다 높아서 선발포지에 합당한 수준이었다. 2000년 3월 24일에 천풍을 대비로하여 16개 계통을 구당면적 0.5칸, 구당 30 본(6행,5열)을 난괴법 3반복으로 이식하였다. 공시계통은 86044, 80194, 86024, 78149, 85042, 78308, 81763, 86067, 82041, 78092, 83793, 78206, 81712, 83743, 천풍, 86038 계통 으로서 2년생 출아율은 5월 31일에 조사하였다.

(2)-2.2년생 포장선발 시험2 : 고염류 퇴비 처리 시험
  2000년 4월 12일에 약토에 고농도 염류 수용액을 처리하고 약토와 혼합하고 4월 15일에 토양 작토층 20cm와 혼합하고 1999년 이전까지 배배양 미실시 계통 30개를 구당 1열 10 행, 3반복으로 이식하였다. 2000년 5월 2일에 조사한 토양 EC5는 0.47ds/cm였다. 공시한 계통은 다음과 같다. 78008, 78222, 79144, 79306, 80819, 81983, 82002, 82025, 82033, 82043, 82072, 82097, 82098, 82104, 82105, 82111(황), 82887(황), 83742, 83743, 83793, 84718, 85031, 85099, 85109, 85721, 85735, 86011, 86024, 86038, 86063 이다. 다음 표는 약 토에 염류 첨가 내역을 표시하였다. 이때 사용한 토양(토증 20cm, 가비중 1.1) 성분 증가 목표치와 첨가화합물과 첨가량을 나타내었다.

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(2)-3.3년생 포지 처리 및 생육조사
  예정지 관리가 완료된 대전시험표에 토양의 EC를 높이기 위하여 1998년 12월 15일에 분쇄한 경기화학 복합비료(N-P-K;11-10-10과 Mg;3%, B;0.3%)를 칸(L 1.8m × W 0.9m × D 0.2m)당 283.3g씩 24칸에 대하여 전층시비하였다. '99년 3월에 기내 선발한 내염성 계통을 이식하였다. 화학비료 처리건의 토양 pH는 5.8이었고, EC5는 0.07ds/cm 였다 '99년 7월 27일의 토양 EC5와 pH는 화학비료 무처리구가 표토 0.13ds/m, 4.80, 심 토는 0.09ds/m, 4.81이었고 처리구는 표토 0.35ds/m, 5.77이었고 심토는 0.23ds/m, 5.29 였다. 지상부 생존율 및 황병발생율을 3년시 '99년 7월 29일에 실시하였다. 2000년 5월 12일의 토양 EC5는 0.57ds/cm였다

(2)-4.4년생 포지 처리 및 생육조사
  토양염류함량 조절 : 한국인삼연초연구원 음성시험장 인삼시험포에 1997년 11월 5일에 경기화학제품, 원예용복비 (N-P-K;11-10-10과 Mg;3%, B;0.3%) 204g을 칸(1.8m× 0.9m)당 토양깊이 20cm에 전층시비하였다. 1998년도 3월 24일에 기내 선발한 염류 stress 내성 계통을 구당면적 0.5칸씩하여 구당 30본(6행 5열)씩 난괴법 3반복으로 이식 하였다. 5월 8일의 토양 EC5는 0.2 ds/m였다. 199년 7월 2일에 MgSO4· 7H2O(Mg;14%)를 포지면적 칸당 193g을 물 20리터에 녹여서 인삼밭 두둑에 관주하였 다. 이 량은 토양의 Mg함량이 0.5me/100g에 해당하고 토양 수분은 6.2%에 해당하는 량이다. 3년생 당시인 1999년 7월 28일에 토양 EC5와 pH는 Mg용액 무처리구 표토는 0.54ds/m, 4.2, 심토는 0.17ds/m, 4.43이었고, 처리구는 표토 0.81ds/m, 4.23, 심토는 0.32ds/m, 4.5였다. 2000년 5월 24일 토양 EC5는 0.46였다. 염류 stress 지표인 황병발생 율은 3년생시 '99년 7월 2일과 7월 28일에, 지상부 생존율은 7월 2일에 실시하였다.

(2)-5.1999년도 채굴한 4년생 포지 처리 및 생육조사
  997년도 봄에 한국인삼연초연구원 대전시험포에 묘삼을 난괴법 3반복으로 이식하여 '99년 5월 8일에 생육조사를 실시하였다. '98년도 5월 20일에 조사한 공시토양의 EC5는 평균0.13 ds/m로서 염류내성계통 선발용 목표치 0.2dS/m 보다 약간 낮은 상태였다. 1999년 7월 3일에 MgSO4·7H2O(Mg;14%)를 포지면적 칸당 193g을 물 20리터에 녹여 서 인삼밭 두둑에 관주하였다. 이 량은 토양의 Mg함량이 0.5me/100g에 해당하고 토양 수분은 6.2%에 해당하는 량이다. 1999년 7월 27일에 토양 EC5와 pH는 Mg용액 무처리 구 표토는 0.88ds/m, 4.91, 심토는 0.36ds/m, 5.13이었고, 처리구는 표토 0.65ds/m, 4.59, 심토는 0.34ds/m, 4.59였다. 염류 stress 지표인 황병발생율과 지상부 생존율은 '99년 7 월 5일에 조사하였고, 지하부는 '99년 9월 27일에 채굴, 조사하였다.

3.1.2 염류 관련 유전자에 의한 인삼의 형질전환 및 기내 증식기술개발
(1) Sall gene의 식물 형질전환용 운반체에 재조합 및 인삼의 형질전환
(1)-1.Sall gene의 식물발현용 운반체에 재조합
● 인삼에서 Sall 유전자를 cloning하는데 시간이 다소 소요되므로 우선 Arabidopsis 에서 cloning한 3'(2'), 5'-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene) 유전자를 이 용하여 인삼을 형질전환시키고자 형질전환용 vector재조합 하였다.

● 인삼 발현용 promoter는 35S-35S-AMV promoter를 사용하고 terminator는 Tnos 를 사용하였다 (cassette vector)

(1)-2.Sall gene의 식물형질전환용 binary vector에 재조합 및 Agrobacterium에 도입
● 식물세포형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하였다.

● 최종적으로 재조합된 binary vector는 kanamycin내성유전자(NPT II gene)와 Sall gene를 함유하고 있는 유전자로 구성되었다.

● 재조합된 운반체는 인삼형질전환에 사용하기 위해서 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP 90을 사용하였다.

● 아그로 박테리움에 도입 방법은 tri-parental mating 방법에 의하여 수행하였으며 AB배지 및 kanamycin함유 배지에서 conjugant인 Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall을 선발하였으며, 인삼의 형질전환에 바로 사용할 수 있도록 조립하였 다.

(1)-3.Sall gene에 의한 인삼의 형질전환
● Arabidopsis에서 분리한 Sall gene에 의하여 인삼을 형질전환시키기 위해서 수확직 후 인삼(Panax gineseng C.A. Meyer) 종자를 모래에 약 3개월간 충적처리하여 개 갑시킨 후 다시 4℃의 냉장고에 옮겨 저온처리하여 휴면 타파시켰다. 인삼접합자배 의 장축이 약 6mm이상으로 충분히 성숙하였을 때 형질전환을 위한 배양자료로 사 용하였다. 인삼종자를 약 70% 에틸 알코올에 약 1분간 침지시킨 다음 2% 차아염 소산 나트륨으로 약 30분간 멸균시킨 다음 멸균된 증류수로 수세하였다.

● 형질 전활할 배양 자료는 인삼접합자배의 자엽을 사용하였고 체세포배유도를 위해 서는 식물홀몬을 첨가하지 않은 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지에 5% sucrose를 첨가한 고체 배지를 사용하였다. 형질 전환을 위해서는 Sall유전자를 함 유하고 있는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall)을 인삼 자엽 과 MS 액체배지에서 24시간 공동 배양한 다음 인삼 자엽을 멸균된 필터 페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 다음 생장조절체가 첨가되지 않고 5% 설탕이 첨가된 MS기본배지에 3일간 전 배양하였다.

● 전배양후 선발 배지로서 MS기본 배지에 250 mg/1 세포탁심과 100 mg/1 가나마 이신을 첨가한 고체배지에 인삼자엽을 옮겼다. 약 14일 간격으로 계대배양한 후에 인산자엽으로부터 형질전환된 체세포배의 발생률을 조사하였다. 형질 전환되었다 고 추정되는 체세포배의 자엽일부 또는 초기 생장시 정상적인 식물체로 전환되지 않을 것 같은 체세포배는 다시 이로부터 이차배를 유도하였다. 효과적인 이차배의 유도를 위해서는 배양재료를 원형질 분리 전 처리하는 방법이 있는데, 즉 1목의 고농도 설탕 용액에 약 24시간 동안 담가 둔 다음 1/2 희석 설탕액으로 서서히 회 복시킨 다음 체세포배유도시와 같은 MS기본배지에 배양하였다. 이로부터 얻어진 다수의 체세포배를 발아시키기 위해서 지베렐린 1mg/1, 또는 -2∼4℃에서 저온처 리하여 발아시켰다. 발아된 체세포배로부터 식물체의 생장을 촉진시키기 위해서 1/2, 또는 1/3 MA 배지에 옮겼다.

● 형질전환된 인삼식물체에서 NPT II 유전자의 존재여부를 확인하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 DNA추출방법은 Edwards 등 (1991)의 바이법에 준하여 수행하였으며 PCR조건은 96℃에서 2분간 predenaturation 한후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 하여 36cycle을 반응시켰으며 이어서 72℃에서 15분간 post-extension 시켰다. 이때 사용한 primer의 염기서열은 5'-GTG-GAG-ACG-CTA-TTC-GGC-TA-3'와 5'-CCA-CCA-TGA-TAT-TCG-GCA-AG-3'을 사용하였다. Sall gene이 도입된 인삼 형질전환체를 PCR에 의한 Sall genes, 그리고 VirG gene을 확인하였다.

(2) 염류관련유전자에 의한 인삼의 형질전환 및 기내증식기술
(2)-1.Ferritin light heavy chain유전자에 의한 인삼의 형질전환
● 중금속 유전자가 도입된 인삼 형질전환체를 기내에서 우선 대량으로 증식하기 위 해서 단일배 발생에 의한 형질전환, 그리고 다시 이차배발생을 통한 embryo를 대 량증식, 또한 embryo 발생을 위한 1M의 mannitol처리를 하였다. 중금속 유전자가 도입된 형질전환체로부터 PCR, Southern 및 Northen 반응을 통하여 형질전환여부 를 재 확인하였다. 중금속 유전자가 도입된 형질전환 인삼식물체를 토양에 옮겨 순화시키기 위해서는 접합자배와 같은 정상적인 발달을 해야하고, 뿌리 및 줄기가 균형되게 자라야 한다. 따라서 형질전환체로 확인된 식물체의 정상적인 식물체로 의 생장을 유도하기 위해 배지의 종류 및 조성을 달리하여 최적의 배양조건을 조 사하였다.

● 중금속 유전자가 도입된 형질전환체로부터 형질전환여부가 확인된 인삼 식물체를 토양에 옮겨 순화시키기 위해서는 접합자배와 같은 정상적인 발육을 해야하고, 뿌 리 및 줄기가 균형되게 자라야 한다. 따라서 형질전환체로 확인된 식물체의 정상 적인 식물체로의 생장을 유도하기 위해 배지의 종류 및 조성을 달리하여 최적의 배양조건을 조사하였다. 형질전환 인삼유식물체의 광독립영양을 촉진시킬 수 있도 록 설탕이 제거된 배지, 토양의 급작스런 습도에 적응하기 위해, 토양에 이식전에 기내에서 수분스트레스를 주거나, 배양병의 공기 투과율을 조사하였다.

(2)-2.Betaine aldehyde dehydrogenase 유전자에 이한 인삼의 형질전환
● Betaine은 choline dehydrogenase(CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다. 본실 험은 Bet A, Bet B 유전자를 아그로박테리움에 도입하여 제조합된 binary vector 가 식물에서 발현 및 형질전환되는지 여부를 조사하기 위해서 담배에 형질전환을 시켰다. Bet A 및 Bet B 유전자에 의하여 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였으며 PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사하였다. 이때 PCR를 위해서 N P T II (5' - G A G - G C T -A T T - G G G - C T A - T G - A C T - G -3', 5' - T A T C - G G G - A G C - A G C - G G C - G A T - A C C - G T A -3' 700 BP), BetA(5' - G A G - T T T - G A T - A T T - C C G - C T G - G T G - C 3', 5'-GGG-TGA-TGC-GAA-TTG-CGT-CG-3',457BP)및BetB (5'-GGC-AAT-ATC-TGA-CCG-AGC-ATC-C-3',5'-GTT-AGT-TTG-CGG-AT ATC-GAA-AAC-G-3' 335BP) primer를 사용하였다.

● 확인된 연초조직은 토양에 이식하여 재배하였으며 정상적으로 생육이 가능하며 개 화되는지 여부를 확인하였다. 연초에서 Bet A, Bet B 유전자의 전사가 확인되었 음으로 본 실험의 목적인 인삼에 형질전환을 유도하였다. 인삼의 형질전환은 Bet A, Bet B gene이 함유된 Agrobacterium과 발아직전의 인삼의 자엽과 동시배양 후 선발배지로서 MS기본배지에 250 mg/1 세포탁심과 100 mg/1 가나마이신을 첨 가한 고체배지에 인삼자엽을 옮겼다. 특히 선발배지에는 식물호르몬을 첨가하지 않고 대신 mannitol의 농도를 1M 처리하여 배양하였다. 배양 7일 후 에는 다시 mannitol이 함유되지 않은 선발배지로 계대배양한 후 체세포에의 발생여부를 조사 하였으며 생육상태를 조사하였다. 항생제 배지에서 유도된 인삼 체세보배는 형질 전환여부를 확인하기 위해서 다시 Bet A, Bet B 유전자를 PCR에 의해서 확인하 였다

(3) 인삼 Sall gene의 cloning 및 운반체 재조합
(3)-1.PCR에 의한 인삼염류관련 유전자의 cloning 및 sequencing
● 동일 세포주에서부터 유래된 인삼모상근에 NaCl의 농도를 0.1%로 10일간 처리하 여 수확한 후 ultraspec II에 의해서 RNA를 추출하였다. Fresh tissue의 약 100 mg을 막자사발에서 liquid N2를 넣고 파쇄하여 E.T에 파쇄된 sample을 넣고 ultraspec RNA 1㎖을 첨가하였다. Vortex 1분하고 얼음속에 5분가 방치하여 nucleoprotein complex를 만들어 chioroform 0.2ml을 넣고 15분 동안 vortex하고 얼음속에서 5분간 방치하였다. Homogenate를 12,000 rpm, 4℃에서 15분동안 원심 분리하였다. 상등액(약800 μl정도)을 새로운 E.T에 옮기고 0.5 vol.의 isopropanol 을 넣어 mix한 후 상기액에 0.05 volume(40μl)의 RNA tack resin(넣기전에 resin 을 완전히 suspend)을 넣고 30초동안 vortex하였다. 1분동안 원심분리하여 상등액 을 버리고 pellet을 75% ethanol(25% DEPC water containing 0.2% DEPC) 1ml에 녹여 washing하고(30초 vortex/ 30초 spin), 다시 이과정을 1회 더 반복한 후 washing을 하고 pellet을 말렸다. Pellet을 0.1 volume(100μl/Ultraspec RNA 1ml) 의 DEPC-treated water에 녹여 RNA를 resin으로부터 분리하고 30분동안 vortex 한후 1분 동안 원심분리하고 상등액을 1회 더 원심분리하여 상등액을 total RNA 로 사용하였다.

● cDNA합성 kit를 이용하여 각각 염류 처리 및 미처리된 인삼모상근에서 cDNA를 합성하였다. 합성은 기산과학의 RCR mix를 사용하였다.

● Cloning 된 인삼 Sall gene의 PCR product는 gel에서 gene clean에 의하여 분리한 후 50ng를 이용하여 동일한 primer를 1.6pM 이용하여 ABI 자동 염기서열 분석장 치에 의하여 sequencing하고 아미노산의 서열을 확인하였다.

(3)-2.Cloning 된 인삼 Sall gene의 식물형질전환용 binary bector에 재조합
● Sequencing이 재확인된 인삼 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase gene (Sall gene) 을 인삼형질전환용 binary vector에 재조합하였으며 방법은 Aravidopsis 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase gene (Sall gene)을 이용하여 binary vector를 만든 방법을 그대로 원용하여 사용하였다.

3.2 연구개발 결과 및 고찰
3.2.1 염류 stress 내성 인삼 계통선발
(1) 기내선발
  염류에 민감한 계통들은 고염류 배지를 이용한 배배양시 배신장이 안되거나 생유이 부진 하여 잎이 갈변하는 경우가 많다. 1988년, 1999년도에 실시한 인삼 계통들의 배배양 결과 는 다음과 같다. 1998년도에 공시한 계통 39개중에서 79302, 86038, 82096, 86053 계통은 경장이 3cm이상으로서 엽색이 정상인 율이 다소 높고 동시에 chlorosis 개체 발생율도 낮 아 타게통 보다는 염류 stress에 내성이 강한 계통이었고, 86050, 82722, 85074 계통도 경 생육이 크고 엽색이 정상인 율도 높아 염류stress에 약간 강한 계통인 것으로 나타났다. 82005, 82106, 80814 계통은 다소 민감성이었고, 86018등 21대 계통은 고염류 배지상에서 배신장이 전혀 안되어 염류에 민감한 계통인 것으로 판명되었다. (Table 1).

  1999년도에 공시한 계통 63개 중에서, 다416, 84718, 86003, 82994은 정상경색(녹색경)율 이 70% 이상이면서 경장이 15mm이상으로서 염류 stress에 강한 계통인 것으로 나타났 고, 82115, 78206, 천풍(KG101)은 정상경색율이 50% 이상이고 경장이 15mm이상으로서 염류stress내성계통으로 판단되었다(Table 2). 계통번호 83793, 82019, 85042, 81723, 78215, 80194, 83795, 78149, 86062, 85035, 78219, 79023, 82083, 78309, 82084, 86005, 85064, 82068, 80205, 78204는 녹색경율이 50%이상, 경장이 5mm이상 및 녹색경율이 30%이상둁, 경장이 15mm이상인 다소 염류내성계통인 것으로 판단되었다. 1997sdus 12월에 품종으로 신고한 KG101(천풍)은 염류내성으로, KG102(연풍)은 염류에 민감성으로 나타났다.

  농작물의 염류 stress 내성 품종 선발은 처음에는 callus 조직세포를 이용하여 기내 선발 하였으나 생리적인 현상에 지나지 않아 최근에는 배배양에 의한 whole-plant 반응을 검정 하여 염류 stress 내성 품종을 선발, 육성하는 방법으로 변천하였다. Diaz De Leon et a l.(1995)은 소맥의 품종들을 이용하여 기내에서 염류 stress 내성을 검정하여 저항성 품종 을 선발, 육성 한 바 있으며, 본 연구에서 선발한 인삼계통들도 이와 비슷한 방법으로 선 발한 것으로서 금후 포장시험과 연계하여 재검정 한 후 최종 선발하여야 할 것으로 생각 된다.

  BU9200010050337-page -37 ~ 38 스캔할 것

(2) 포장선발
  염류 stress 내성 지표로서 인삼 잎에 나타나는 chlorosis 현상을 들 수 있는데, 일반적으 로 2년생시에는 잘 나타나지 않으며 3년생이상의 고년생에서 현저한 차이를 관찰 할 수가 있다. 2000년도 대전 3년생포의 2년생시 황병발생율(Table 3)은 82106, 85080, 86038 계통 은 4-6%로 자경종 3%와 비슷한 수준이었고, 결주율은 82106, 85080 계통이 자경종 85% 와 비슷한 수준이었다. 기내실험('96,'97,'98,'99년도)에서 계통별 염류반응은 82106('96,'98), 85080('98)은 보통이었고, 86038('98)은 강한 계통이었다.

  BU9200010050337-page -39 스캔할 것

  2000년도에 음성 4년생 포지의 3년생 당시 황병발생율(Table 4)은 82068, 82115, KG106 계통은 7월 2일에 11-15% 7월 28일에 54-47%로 자경종 보다 낮았다. 황병발생율과 생존 율, 근부율을 종합하여 볼 때, 염류내성 계통(황병발생율 50% 이하, 생존율 45% 이상)은 82068, KG106, 86031, 82887의 4계통이었다.

  기내실험('96,'97,'98,'99년도)에서 계통별 염류반응은 82068('99)은 약간 강하였고, KG106('97)은 강하였으며 이들 계통들은 포장시험에서도 염류 stress에 강한 것으로 나타 나 금후 계속해서 주도면밀하게 관찰한 후 우수한 계통으로 육성될 가능성이 높은 것으로 생각된다.

  BU9200010050337-page -40 스캔할 것

  1999년도에 수확한 4년생 포장에서 4년생시의 황병발생율을 보면 857365, 82098, KG101, KG108, 82886 계통들은 0-8.5%로 자경종 35.7%보다 현저히 낮았고, 결주율도 자경종 72%보다 낮았다(Table 5). 황병발생율과 생존율, 근부율을 종합하여 볼 때 염류내성 계 통(황병발생율 20% 이하, 생존율 50% 이상, 근부율 15% 이하)은 85735, KG101, KG108, 농자경, 황숙종의 5계통이었다. 기내실험('96,'97,'98,'99년도)에서 계통별 염류반응은 KG101(천풍, '96,'99)은 '96년도에 약하였고 '99년도에 아주 강하였으며 KG108('97)은 약한 계통이었다. 농자경('98)은 보통이었고 황숙종('96)은 약한 계통이었다.

  BU9200010050337-page -42 스캔할 것

  기내실험과 포장선발간에 계통간 반응이 상이한 계통이 많았다. 그러나 KG106, 86038은 기내와 포장에서 공히 염류stress내성인 것으로 나타났다.

3.2.2 염류관련 유전자에 의한 인삼의 형질전환 및 기내증식기술 개발
(1) Sall gene의 식물 형질전환용 운반체에 재조합 및 형질전환
(1)-1.Arabidopsis Sall gene의 식물발현용 운반체에 재조합
  염류내성 유전자로 알려진 Arabidopsis에서 분리한 3'(2'), 5-bis-phosphate nucleotidase gene (Sall gene)을 인삼에 형질전환시키기 위해서 식물형질전환용 binary vector에 재조합하였다. 우선 식물발현용 promoter (35S-35S-? promoter)가 함유된 카 셋트 백타 524Xba에 도입하기 위해서 제한효소 site Ncl1위치를 primer제작에 의해서 mutation시켰다. Primer는 sence로 당초 5'-GAT-TTA-CAA-TGG-ACG-TTC-GC-3' 인 것을 5'-GAT-TTA-CCA-TGG-ACC-TTC-GE-3'으로 변경하여 사용하였다 (CCA-TGG=Nco1 인식 site).

  상기 primer에 의해서 유도된 Sall gene은 식물발현용 백타(524Xbal)에서 재조합되어 확인되었으며, E. coli에 도입하여 증식하였다. Primer mutation애 의해서 유도된 Sall gene을 PCR로 추출하여 가장 적게 나온 PCR product를 다시 template로 사용하여 PCR한 후 절단하여 ligation시켰다(Fig. 1).

  BU9200010050337-page -44 스캔할 것

(1)-2.Arabidopsis Sall gene의 식물형질전환용 binary vector에 재조합 및 Agrobacterium 에 도입
  식물형질전환용 binary vector인 pRD400에 다시 재조합하기 위해서 상기 식물발현 용 vector에 재조합된 Sall gene를 Xba1dmfh 절단하여 pRD400(Fig. 2-A)에 ligation하여 E. coli에 형질전환시킨 후 X-gal 및 IPTG가 함유된 선택배지에서 white colony를 선발하였다. 형성된 colony를 다시 50 μg/ml kanamycin이 함유된 배지에서 배양후 다시 plasmid를 추출하여 Xbal으로 절단하여 Sall gene를 확인하였 다.(Fig. 2-B). 약 11kb의 pRD400 binary vector와 Sall gene와 promoter 및 terminator가 도입된 약 2kb product를 확인할 수 있었다.(Fig. 2-B). Ligation이 확 인된 binary vector를 disarmed Ti-plasmid를 함유한 Agrobacterium tumefaciens MP90에 도입하기 위해서 tri-parental mating 방법에 의해서 Agrobacterium tumefaciens MP90에 Sall gene를 함유한 binary vector를 도입하였다.

  BU9200010050337-page -45 스캔할 것

(1)-3.Arabidopsis Sall gene에 의한 인삼의 형질전환
  Sall gene를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall을 이용하여 인 삼자엽으로부터 형질전환을 유도하였다. 인삼자엽을 식물홀몬을 첨가하지 않은 배지 에서 체세포배를 발생시킨 대조구에서는 약 90% 배양 재료에서 체세보배가 발생되 었으며 주로 자엽의 기부에서 형성되었으나(Fig. 3-A), Agrobacterium과 공동 배양 후 식물홀몬 무첨가 선발배지(항생제 kanamycin 100μg/ml)에서는 형성빈도가 매우 감소되어 다만 10%미만의 자엽에서 형질전환 인삼체세포배가 발생되었다.(Fig. 3-B). 그러나 Agrobacterium 과 공동배양 후 1.0 mg/1 2.4-D와 0.5 mg/l kinetin을 첨가한 배지에 옮겨줄 경우 74%의 형질전환율을 보였다.(Fig. 3-C). 그러나 대조구 의 자엽에서는 자엽한개당 체세포배의 수가 약 10-20개정도 발생되었으며 단일배상 태로 형성되었으나(Fig. 3-A), 식물호르몬 무첨가배지에서 선발한 형질전환처리구에 서는 자엽당 1.9개의 체세포배가 발생되었다.(Table 6, Fig. 3-B). 반면 식물호르몬 첨가 배지에서 형질전환된 처리구에서는 30-50개정도의 embryo가 형성되었으나 단 일배상태가 아니고 pre-embryo상태로 형성되었다(Fig. 3-C)

  BU9200010050337-page -46 스캔할 것

  식물호르몬 무첨가배지에서 유도된 형질전환 체세포배중 80%가 정상적인 자엽단계 로 발생되지만 같은 배지에서는 더 이상 생장이 진행되지 않았기 때문에 발아 및 식 물체로의 생장을 위해 GA3가 10mg/l가 첨가된 MS 배지에 옮겨주었다. 그 결과 체 세포배가 GA3 대부분 녹화된 후 유식물체로 발달하였다(Fig. 4-A). 그러나 유식물체 중 50%가 상배축이 정상적으로 생장하지 못하였다. 한편 식물호르몬이 첨가된 선발 배지에서 유도된 형질전환 체세포배의 경우에는 거의 정상적인 유식물체로 생장하지 못하고 callus화 되는 경향을 보였다.(Fig. 4-B). 그러나 식물호르몬 무첨가 선발배지 에서 유도된 체세포배는 비록 형질전환 빈도는 낮았지만 정상적인 shoot를 형성하였 으며(Fig. 4-C), 형성된 일부 형질전환 식물체의 일부분을 취하여 Sall 유전자의 존 재 유무를 확인 한 결과 Sall(Fig. 5-lane 8-9) 유전자가 들어 있음을 확인할 수 있 었다.

  BU9200010050337-page -47 ~ 49 스캔할 것

  인삼 접합자배의 자엽과 마찬가지로 형질전환 인삼 체세포배 자엽을 절취하여 호르 몬 무첨가 배지에 다시 배양하면 자엽표면으로부터 높은 비율 (86%)의 체세포배가 이차적으로 발생됨이 확인되었다(Fig. 6-A, Table. 7). 이들 대부분 정상적인 모양의 체세포배의 구조를 지니고 발달되었다. 또한 이차배를 정상식물체의 발아유도시와 같은 조건인 1/2 MS 배지에 옮겨 줄 경우 정상적인 식물체로 자랄 수 있었다(Fig. 6-B). 또한 형성된 shoot중에서는 역시 매우 많은 수가 단일배상태로( Fig. 6-C)유 지되기 때문에 뿌리의 형성이 가능할 것으로 생각되었다. 이러한 점은 형질전환율이 적을지라도 일단 형질전환식물체로부터 다수의 이차배를 발생시킬 수 있기 때문에 인삼 형질전환 식물체으 기내대량증식이 가능하다. 특히 호르몬 무첨가배지에서 식 물체의 분화는 배양도중 변이체의 발생을 현저히 줄일 수 있다. 따라서 이 방법을 보다 개선시키면 보다 높은 빈도의 정상적인 형질전환 식물체를 증식시킬 수 있을 것으로 사료된다.

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  형질전환 인삼유식물체의 토양적응실험을 하고 있는바 형성된 부리가 정상적으로 생 장이 되어 인삼형태의 주근을 계속 유지할지, 또한 지상부가 없어지고 이듬해에 다 시 새로운 잠아가 형성되어 지상부가 생장이 될지, 3-4년 생장후 종자결실이 정상적 으로 이루어질 지, 특히 Sall gene에 의하여 인삼이 염류내성을 가질 지는 계속 검 토를 하여야 할 것으로 생각된다.

  BU9200010050337-page -51 스캔할 것

(2) Ferritin light heavy chain유전자에 의한 인삼의 형질전환
(2)-1.Ferritin light heavy chain유전자의 형질전환용 운반체 재조합
  인삼에서 염류관련 유전자를 cloning하는데 시간이 다소 소요되므로 기존에 보고된 염류관련유전자중에서 인삼에 도입하기 위하여 우선 ferritin light heavy chain유전 자를 이용하여 인삼을 형질전환시키고자 형질전환용 vector를 재조합 하였다. 사용 한 ferritin light heavy chain은 식물 발현용 promoter 35S promoter를 사용하고 terminator는 Tnos를 사용하였으며 식물세포형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하여 최종적으로 kanamycin내성유전자(NPT II gene)와 tadploe ferritin light heavy chain gene 및 hman ferritin light chain gene를 함 유하고 있는 binary vector를 재조합하였다. Binary vector의 아그로 박테리움에 도 입은 tri-parental mating 방법에 의하여 수행하여 AB배지 및 kanamycin함유 배지 에서 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/FLHC 을 선발하였다.

(2)-2.Ferritin light heavy chain유전자에 의한 임사의 형질전환
  상기실험에서 선발된 ferritin light heavy chain 유전자 함유 Agrobacterirum tumefaciens MP90/FLHC를 이용하여 인삼을 형질전환시키고자 1년차에 이미 형 질전환을 수행하여 형질전환유식물체를유도하였으나 토양활착이 매우 어려움을 알 수 있었다. 따라서 형질전환방법을 다소 변형하여 대량으로 인삼 형질전환체를 유 도하여 다시 토양활착시험을 하고자 하였다.

  우선 ferritin light heavy chain gene이 도입된 식물형질전환용 binary vector를 이용하여 작년에 개발한 형질전환방법을 변형하여 많은 embryo를 유도하였으며 유도된 embryo들은 GA 10mg/L가 첨가된 배지에 지상부를 유도하였다.(Fig. 7).

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  Ferritin light heavy chain gene 형질전환 embryo를 대량으로 유도하기 위해서 우선 작년 7-8월에 종자채취하여 11월 까지 3-4개우러간 개갑처리된 종자를 형질 전환용 재료로 사용하였으며, GA 10mg/L가 첨가된 배지에서 1주일간 배배양하여 자엽이 약 5mm정도 크기가 되었을 때 채취하여 다시 식물 호르몬 무첨가 MS 배 지에 ,kanamycin 100mg/L와 250 mg/l 세포탁심을 첨가하여 ferritin light heavy chain gene이 도입된 식물형질전환용 binary vector를 함유한 Agrobacterium을 이 용하여 동시배양에 의해서 인삼형질전환을 유도하였다. 약 2달 후 형성된 체세포 배로부터 발아를 유도하기 위해서 MS배지에 10 mg/l GA3가 첨가된 배지에 옮겼 다. 형질전환체식물체의 정상적인 생장을 유도하기 위해 배지의 종류 및 조성을 달리하여(MS, 1/2MS, 1/3MS, 1/5MS, MS-NH4NO3) 최적의 배양조건을 조사하였 던 바, 비교적 1/3MS배지에서 뿌리의 생장과 지상부의 생장이 균일하게 생장하는 경향을 보여, 발아된 식물체들 1/3 MS배지를 담은 100ml 삼각 플라스크에 옮겨 식물체의 생장과 뿌리의 발육을 유도하여, 뿌리와 줄기가 잘 발달된 약 7cm의 유 식물체(Fig. 8-A)를 대량으로 증식하여(Fig. 8-B), 모래와 흙이 1:1로 혼합된 토양 에 옮겼다. 특히 형질전환 인삼유식물체의 광독립영양을 촉진시킬수 있도록 설탕 이 제거된 배지, 토양의 급작스런 습도에 적응하기 위해, 토양에 이식전에 기내에 서 뚜껑을 열어 수분에 대한 스트레스를 준 후 토양에 이식하였다(Fig. 8-C). 그 러나 토양에 이식된 식물체는 생존상태가 매우 불량하여 계속적인 실험이 요구되 며, 특히 종자에서 유도된 기내 배배양인삼 유식물체를 이용하여 토양 적응조사를 할 필요가 있다고 사료된다.

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(3) Betaine aldehyde dehydrogenase 유전자에 의한 인삼의 형질전환
(3)-1.인삼의 형질전환
  염류내성 식물은 염류농도의 변화에 따라 세포내의 삼투압을 유지하기 위한 화합물 을 합성하는 기작을 가지고 있는데 이런 화합물은 주로 proline, glycine, betaine, polyols, sugar등으로 체내에 축적함으로서 고농도의 염류에 견디는 것으로 알려져 있다. Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성된다. 그 첫단계는 choline dehydrogenase(CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산 물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다.

  본실험은 ferritin light heavy chain유전자를 binary vector에 도입하는 방법과 동일 하게 하여 Bet A, Bet B 유전자를 아그로박테리우에 도입하여 새로운 conjugants 2종을 획득하였으며(Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet A, Agrobacterium fumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질 전환되는지 여부를 조사하기 위해서 담배에 형질전환을 시켰다. Bet A 및 Bet B 유전자에 의하여 형질전환된 담배에서는 고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능 하였으며 PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물 체 모두 band가 형성되어 형질전환체임을 확인할 수 있었다.(Fig. 9). 이때 PCR를 위해서NPT II(5'-GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TG-ACT-G-3', 5'-ATC-GGG-AGC-GGC-GAT-ACC-GTA-3',700BP),Bet A(5'-GAG-TTT-GAT-ATT-CCG-CTG-GTG-C-3', 5'-GGG-TGA-TGC-GAA-TTG-CGT-CG-3' 457BP) 및 Bet B (5'-GGC-AAT-ATC-TGA-CCG-AGC-ATC-C-3', 5'-GTT-AGT-TTG-CGG-ATC-GAA-AAC-G-3' 335BP) primer를 사용하였다.

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  그러나 형성된 유식물체에 동시배양시 사용한 Agrobacterium 이 감염되어 밴드가 형성될 수 있기 Eoansd에 Agrobacterium 감염(오염)시 나타난 VirG(primer 5'-TTA-TCT-GAG-TGA-AGT-CGT-CTC-AGG-3', 5'-CGT-CGC-CTG-AGA-TTA-AGT-GTC-3' 965BP) 유전자를 확인하였던 바 형질전환체에서는 전혀 밴드가 형성되지 않고 Agrobacterium에서만 형성됨을 확인 할 수 있어 Bet A, 및 Bet B gene이 담배에 형질전환되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 10).

  Bet A 및 Bet B gene이 도입되었더라도 전사가 되지 않으면 형질전환체로 사용이 불가능하므로 전사 여부를 확인하기 위해서 RT-PCR에 의해서 도입된 유전자의 전사여부를 확인하였다. 형질전환 담배에서 RNA isolation kit를 이용하여 total RNA를 추출한 후 RT-PCR에 의하여 cDNA합성후 PCR 한 후 확인하였다. 이때 cDNA합성조건은 우선 반응액은 reverse transcriptase RNasine DTT로 하였으며 42 ℃에서 45분 반응시켜 cDNA를 합성하였고 PCR 조건은 Taq polymerase를 이 용하여 최초 96℃에서 2분간 predenaturation후 96℃에서 30초, 60℃에서 30초, 7 2℃에서 2분간으로 40회 cycle를 반응시킨후에 최종적으로 72℃에서 15분간 post-extension시켜 PCR를 종료하였다. cDNA합성 및 PCR반응동안에 처음부터 NPT II, Bet A 및 Bet B primer를 반응액에 첨가하여 바로 사용하였다. RT-PCR 완료된 후에는 1.2% agarose상에서 running후에 EtBr에 의해 염색하여 UV하에서 밴드의 형성여부를 확인하였다. 형질전환체에서는 모두 밴드가 형성되었으나 대조 구에서는 전혀 밴드가 형성되지 않아 형질전환체는 정상적으로 RNA를 합성하고 있음을 확인하였다(Fig 11).

  담배에서 형질전환이 확인된 유식물체를 토양에 이식하여 생장을 조사한 결과 Bet-B가 도입된 형질전환체는 생장이 잘 안되었으나 (Fig. 12-A left), Bet-B가 도 입된 형질전환체는 정상적으로 생장하는 모습(Fig. 12-A right)을 보였으며, 특히 Bet-A의 경우에는 정상적으로 개화결실이 되었다(Fig. 12-B,C). Bet-B의 경우 생 장에 이상을 가져오는지에 대해서는 추후 계속적으로 조사할 계획이다.

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  일단 담배에서 형질전환이 확인되어 다시 인삼에 형질전환을 유도하고자 전년도에 개발한 인삼 형질전환 system을 약간 변형하여 이용하였다. 즉 발아직전에 있는 인 삼자엽을 멸균된 필터페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 다음 생장조절제가 첨 가되지 않고 5% 설탕이 첨가된 MS기본배지에 3일간 전 배양하였다. 전배양후 선 발배지로서 MS기본배지에 250 mg/l 세포탁심과 100mg/l 가나마이신을 첨가한 고 체배지에 인삼자엽을 옮겼다. 약 14일 간격으로 2번 계대배양한 후에 약 12%의 인 삼자엽에서 형질전환체세포배가 발생되었으며 나머지 형질전환되지 않은 자엽은 황 색 또는 적갈색을 띠며 괴사되었다(Fig. 13).

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  항생제 배지에서 유도된 체세포배는 형질전환여부를 확인하기 위해서 다시 Bet A 및 Bet B 유전자를 PCR에 의해서 확인하였던 바, 역시 형질전환체에서는 모두 Bet A 및 Bet B유전자가 확인되었으나 대조구에서는 전혀 밴드가 형성되지 않아 인삼에서도 동일 유전자에 의해서 형질전환이 되었음을 확인할 수 있었다.(Fig. 14). Bet A 및 Bet B 유전자에 의하여 형질전환된 인삼 체세포배로부터 shoot,를 형성하기 위해서 GA3 10 mg.l를 첨가한 1/2MS배지에 접종한 결과 shoot가 형성되 는 것을 확인할 수 있었으나(Fig. 15). 기형의 shoot가 많이 관찰되었다.

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(4) 인삼 Sall gene의 cloning 및 운반체 재조합
(4)-1.인삼염류관련 유전자 cDNA 합성
  동일 세포주에서부터 유래된 인삼모상근에 NaCl의 농도를 0.1%로 10일간 처리하여 수확한 후 Ultra spec II에 의해서 RNA를 추출하여 cDNA 합성 kit에 의해서 각각 염류 처리 및 미처리된 인삼모상근유래 cDNA를 합성하였다.

(4)-2.인삼에서 염류관련 유전자의 cloning을 위한 primer의 제작
  nternet상에 보고된 염류관련 유전자중 우선 인삼 모사이근유래 cDNA로부터 PCR를 이용하여 유전자의 탐색을 위해서 염류관련 유전자를 찾아 primer를 제작하 였다. 우선 Arabidopsis thaliana의 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)를 근거로 인삼에서 cloning용 primer를 제작하였으며 특히 full-gene를 cloning하기 위해서 start codon(ATG)이 primer에 삽입되게 하였으며 제작한 primer sequence는 아래와 같다.

● Forward primer 14->36: GAGTTGTTCATCGATGGCTTAC Tm = 60.0

● Revs primer 173->1151:GAATTCTCACTGGTGAAATTCG Tm = 60.0

● PCR product length: 1160, GC = 44%

(4)-3.PCR를 이용한 염류처리 인삼 cDNA 로부터 Sall gene 의 cloning
  NaCl이 처리 및 미처리된 인삼모상근에서 유래된 인삼 cDNA에서 Sall gene를 cloning하기 위해서 제작된 Arabidopsis thaliana의 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)를 근거한 primer를 이용하여 RT-PCR에 의해서 PCR 를 하여 형성되는 band를 확인하였다(Fig. 16).

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  RT-PCR결과 약 1.1kb위치에 PCR product가 형성되었으며(Fig. 16), 형성된 PCR product를 gel에서부터 분리하여 다시 동일 primer를 이용하여 PCR한 결과 매우 선명한 단편을 획득할 수 있었다. 이것은 최조 cloning한 Arabidopsis에서 추출한 Sall gene과 그 크기가 비슷하여 인삼 Sall gene일 가능성이 매우 높을것으로 사료 되어 sequencing를 하여 염류유전자관련여부를 조사하였다. 특히 형성된 PCR product는 NaCl 무처리구에서는 전혀 형성되지 않았으며 NaCl 처리구에서만 PCR product가 나타났다.

(4)-4.Cloning된 인삼 Sall gene의 식물형질전환용 binary vector에 재조합
  Sequencing이 재확인된 인삼 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)을 인삼형질전환용 binary vector에 재조합하였다. 이방법은 Arabidopsis 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)을 이용하여 binary vector를 만 든 방법을 그대로 원용하여 사용하였다. 재조합 binary vector을 disarmed Ti-plasmid를 함유하고 있는 Agrobacterium MP90에 도입하여 PCR에 의해서 확인 하였던 바, NPT II(Fig. 17-lane 2)와 Sall gene를 확인할 수 있었다(Fig. 17-lane 3).

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(4)-5.PCR에 의하여 형성된 Sall gene 관련 PCR product의 sequencing
  PCR product를 gel에서 gene clean에 의하여 회수한 후 다시 50μg PCR 산물에 1.6pM 의 primer를 이용하여 ABI 자동 염기서열분석기에 의하여 sequencing 하 였다. 형성된 PCR product는 sequencing결과 Arabidopsis thaliana 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase (SAL1) mRNA와 90%의 homology를 가지 고 있었다. 따라서 본 인삼 유전자는 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(SAL1)일 가능성이 매우 높아 인삼의 형질전환에 사용코자한다.

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  Oryaz sativa 3'(2'),5-diphosphonucleoside 3'(2') phosphohydro- lase(Length = 1480bp)와 인삼 3'(2')phosphohydrolase cDNA 염기서열은 다음과 같으며 약 65% 의 homology를 가지고 있었다(Fig. 19).

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  또한 Arabidopsis thaliana HAL2-line protein (Ahl) mRNA(Length = 1478)와는 약 일부 절편에서 56%의 homology를 가지고 있었다(Fig. 20).

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  Arabidopsis의 Sall gene를 이용하여 인삼에서 Sall gene를 cloning하여 sequencing한 후에 아미노산 서열을 비교한 결과는 다음과 같으며 84.4%의 homology를 가지고 있었다(Fig. 21).

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제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도
  본 연구에서는 염류농도가 높은 우리나라 인삼재배지에서 품질이 양호한 고려인삼을 안정적으로 생산하고자 기내 및 토양에서 염류내성게통을 선발하였으며 또한 염류내성관련 유전자를 이용하여 인삼을 형질전롼을 유도하였으며 재분화 시스템에 대한 전반적인 연구를 수행하여 다음과 같은 획기적인 결과를 얻었다.
  염류내성 계통(황병발생율 20% 이하, 생존율 50% 이상, 근부율 15% 이하)으로서 82068, KG106, 86031, 82887, 85735, KG101, KG108, 농자경, 황숙종 9계통을 선발하였으며 이들계통은 생산력 검정에 공시할 계획이다.
  인삼의 재분화는 타작물에 비해 매우 힘들뿐만 아니라 정상적인 shoot 가 형성되었다고 하더라고 뿌리의 발육이 되지 않으면 거의 토양활착이 불가능한 편이다. 그동안 인삼의 재분화에는 주로 식물호르몬을 사용하여 왔으나 호르몬의 사용시 정상적이 뿌리의 발육이 잘되지 않고 다배형태의 유식물체가 형성되므로 뿌리의 활착이 매우 어려웠다. 따라서 인삼 단일배의 발생을 통한 형질전환 재분화체를 획득코자 하였다. 단일배의 발생은 식물호르몬 무첨가배지에서 자엽의 상태에 따라 단일배가 형성되는데 단일배의 경우에는 정상적인 뿌리의 발육이 가능하였다. 그러나 식물호르몬을 첨가하지 않았기 때문에 형질전환율이 매우 낮아 새로운 형질전환체 선발기술 필요하였다.
  형질전환단일배의 경우에는 뿌리의 발육이 양호하지만 식물호르몬 무첨가배지에서 독성을 가진 항생제가 첨가된 선발배지를 사용한 인삼 형질전환 시스템에서는 형질전환빈도가 매우 낮아 많은 단일배를 획득할 수 없었다. 따라서 일차적으로 선발배지에서 형성된 형질전환 단일배를 배양하여 체세포배를 만든다음 다시 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 접합자배를 발생시킨 방법고 동일하게 이차배발생을 통해서 증식시킨 결과 매우 많은 량의 형질전환 단일배를 획득할 수 있었다. 그러나 이차배의 경우에는 형질전환된 체세포배의 크기가 적어도 심장형이후에 3mm이상이 되어야 단일배의 발생이 가능하였다. 단일배를 발생할 경우에는 식물호르몬을 첨가하지 않고 발아직전의 자엽을 사용하기 때문에 단일배의 발생이 기부의 바로 윗부분에만 형성되지만 식물호르몬을 첨가할 경우에는 비록 뿌리의 발육이 불량한 다배형태이지만 자엽의 전면에 형성되었다. 또한 plasmolysis를 시켜 자엽을 원형질분리 직전까지 유도한 후 배발생을 할 때에도 식물호르몬을 첨가한것같이 전면에 배가 형성되었지만 모두 단일배의 상태로 생장하였다. 따라서 염류관련 유전자에 의한 인삼 형질전환체의 발생을 위해 인삼 체세포배의 자엽을 1M설탕용액에 1일간 원형질분리 처리후 회복시키고나서 MS기본배지에 배양하였는데 이 경우 거의 모든 자엽에서 고빈도로 배가 발생되었으며 발생된 배가 대부분 접합자배와 같은 단일배로 발생되었다.
  인삼에 염류관련 유전자를 도입하기 위하여 기존에 보고된 염류관련유전자중에서 우선 ferritin light heavy chain유전자를 이용한 binary vector를 재조합 하였다. 사용한 ferritin light heavy chain gene은 식물 발현용 promoter인 35S promoter를 사용하고 terminator는 Tnos를 사용하였으며 식물세포형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하여 최종적으로 kanamycin내성유전자(NPT II gene)와 tadpole ferritin light heavy chain gene 및 human ferritin light chain를 함유하고 있는 binary vector를 재조합하였다. Binary vector의 아그로 박테리움에 도입은 tri-parental mating 방법에 의하여 수행하여 AB배지 및 kanamycin함유 배지에서 disarmed Ti-vector를 가지고 있는 Agrobacterirum tumefaciens MP90/FLHC을 선발하였다. 인삼자엽을 ferritin light heavy chain 유전자를 함유하고 있는 아그로박테리움과 공동배양한 후 체세포배가 유도될 수 있는 MS 기본배지에 약 3일간 전배양한 다음 250 mg/l 세포탁심과 100 mg/l 가나마이신을 첨가한 배지에 옮겨 체세포배를 발생시켰다. 약 12%의 인삼자엽에서 형질전환 체세포배가 발생되었고 이들 형질전환체세포배를 다시 한번 가나마이신이 첨가된 새로운 배지에 옮겨 생존여부를 조사한 결과 약 67%가 정상적으로 생존되었다. 가나마이신에서 생존하는 형질전환되었다고 추정되는 체세포배가 적기 때문에 이들 체세포배로부터 다시 이차배를 유도하여 많은 수의 체세포를 유도하였으며 PCR, Northem blot등에 의해서 형질전환체를 확인하였다.
  NaCl의 농도를 0.5%로 10일간 처리한 인삼모상근에서 일차 확인된 3'(2'),5-bisphosphate nucleotidase gene(Sall gene)을 Arabidopsis에서 나타난 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였으며 Arabidopsis와는 90% homology를 가지고 있었으며, 아미노산 서열을 비교한 결과 84.4%의 homology를 보였다. 인삼에서 cloning한 Sall 유전자에 식물세포내에서 발현정도를 높일 수 있는 강력한 promoter를 재조합하여 다시 인삼에 형질전환시켜 염류내성을 증진시키고자 식물형질전환용 vector를 재조합 하였다. 인삼 발현용 promoter는 35S-35S-AMV promoter를 사용하고 terminator는 Tnos를 사용하였으며, 식물세포형질전환용 pRD400 binary vector를 사용하여 kanamycin내성유전자(NPT II gene)와 Sall gene를 함유하고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall을 선발하였고, 인삼의 형질전환에 바로 사용할 수 있도록 조립하였다. 염류내성관련 유전자인 Sall gene에 의하여 인삼을 형질전환시키기 위해서 인삼종자를 개갑시킨 후 저온처리하여 발아직전의 자엽에 형질전환을 수행하였다. 형질전환체는 식물홀몬을 첨가하지 않은 MS배지에 5% sucrose와 항생제가 첨가된 배지에서 단일배를 선발하였다. 형질전환 체세포단일배를 발아시키기 위해서 지베렐린 1mg/l, 또는 -2~4℃에서 저온처리하여 발아시켰다. 발아된 체세포배로부터 식물체의 생장을 촉진시키기 위해서 1/2, 또는 1/3 MS 배지에 옮겨 재분화체를 획득하였다.
  이상의 연구결과를 보아 본 연구목표를 100%달성한 것으로 판단되며 금후 계속해서 인삼육종연구에 공시되어 양질의 고려인삼생산에 적극 반열될것이며, 최종결과는 고려인삼산업의 발전에 크게 기여할 것으로 기대된다.

제 5 장 연구개발결과의 활용계획
  본 연구에서 선발된 고염류통양환경(EC 0.2ds/m 이상)에서도 정상 생육을 할 수 있는 인삼은 계통화에 이용될 것이며 이는 인삼 품종 육성의 기본이 되어 품종화를 위한 생산력 검정시험, 지역적응시험등에 적극 활용할 예정이다. 염류관련유전자를 이용한 형질전환 기본 기술은 인삼의 분자육종학적 품종개량에 적극 활용할 에정이며 인삼의 조직세포에서 직접 체세포배를 유기하여 어린 식물체로 발달시키는 기본기술개발은 유전자형이 동일한 인삼개체를 단시간내에 대량 증식할 수 있는 가능성을 제시한 것으로서 선발된 염류 stress 내성인삼을 유전자의 변형없이 대량 생산하는 데에 적극 활용될 것이다.
  본 연구에서 얻어진 결과는 아직까지 기본기술개발 및 확립에 지나지 않고 본연구의 최종목표인 염류 stress 내성 인삼게통 선발 및 육성을 위해서는 염류 stress 내성계통의 생산력검정, 지역적응시험, 품질평가시험, 선발계통의 안정성 검토, 염류 stress 내성 조직세포의 식물체 재분화, 재분화 식물체의 후대 검정 및 대량증식 등에 관한 연구를 계속해서 수행할 계획이다.

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