분자유전파트- 임수민, 김수정
Day1
파트장님께서 분자유전기기들 하나하나 설명해주십니다
기기위치들, 분자유전파트에도 세포배양실, 염색체분석실 등 방이 있는데 쭉 돌면서 설명해주십니다.
분자유전 책이랑 실험보고서같은 걸 주시고 그걸 보며 자습하시면 됩니다.
질문은 거의 안하시고 거의 설명해주시는 부분이 많았어요.
HLA-A,B,C,D high resolution
-주로 골수검사, 모두 type이 같아야 수술시 이식 가능
모든 유형이 맞는 경우를 찾는 게 rare, 맞출 수 있는 조건을 찾을 사람이 적어짐-> 보통 1-2가지만 맞아도 이식하는 경우 대부분( 이렇게 이식해도 보통 이상은 없어요 )
장비, 기기들
모든 감염관리의 기본은 손씻기이다.
Centrifuge
속도, 시간조절, 고가의 경우 온도조절가능
온도관련장비는 온도점검기록표를 작성
세포배양기
chromosome culture사용, 온도와 Co2조절시 사용, 보통 두 개 사용하는데, 그 이유는 고장날때를 대비하여 사용한다.
핵산추출
RNA의 경우 4도에서 추출, RNA는 한가닥이기 때문에 더 잘 끊어지기 때문이다.
Exiprep
->핵산추출 prep
dry oven
-> 물 없이 공기로 조절, 60도. chromosome검사시 사용
Ampliprep
-> HPV,HBV,HIV 전용 기기, DNA,RNA추출기기
Tapman
-> Real-time PCR 검사 기기
Ampliprep와 Taqman기기는 둘 다 연결되어있다. 검사실에서 제일 거대한 기기 찾으심 됩니다. 그만큼 중요한 기기에요.
핵산추출방식은 case마다 다르게 사용한다.
Applied Biosystems(PCR system 9700)-> PCR검사 Machine
<Real time PCR>
PCR산물의 증폭과정을 실시간으로 모니터링, 빠른결과, 미량의 DNA로부터 DNA증폭가능, 수요가 많다.
<전기영동>
agarose gel사용, loading dye를 이용해 전기영동의 이동속도를 보는 것
-> sequencing 장비, 3500 Genetic analyzer 사용
<NTM(MOTT) ID test>
-> 마이코박테리아 검출 test
한 번에 많은 균주를 보고자 할 때 유용하게 사용
임상적 의의 1) 결핵균 2) 비결핵항산균
결핵검출?
1) 배양, 2) PCR의 방법이 있다
-> 이 테스트의 원리는 스트렙에 균이 붙는 방식으로 검사하는 방법이다.
교잡반응-세척반응-발색용액을 분주하여 모니터로 균을 읽어내는 방식
Day2
주로 실험검사 진행)
1) Real time PCR의 과정을 보여주신다.
lack에 시약을 넣고 마지막에는 정도관리기호를 넣어줌
Ampliprep의 기기는 마그네틱을 이용한 방법
lack에 배양한 시약을 순서대로 넣고 PCR기기를 돌리는데, 기기에 lack을 꽂는 과정들을 마지막에 해볼수 있게 해주심
2) RNA 추출검사
핵산추출 방법은 세가지가 있는데
1) 마그네틱 이용하는 방법
2)끓여서 추출하는 방법(Boil)
3)column방법(filter에 넣고 걸러줌)
RNA는 4000RPM에서 8min 돌린 상태
RNA를 냉장하는 이유는 RNase활성을 최대한 억제해주기 위함이다.
최대 흡광도
핵산은 260nm
단백질은 280nm이 최대흡광도이다.
핵산 측정하는 기기가 있는데, 그 기기에서 순도는 1.6-1.9가 정상범위이다.
PCR양이 너무 많으면 희석하기도 하는데, 너무 많아도, 적어도 좋지 않다.
3) DNA추출( 이건 실제 검체가지고 해보게 해주십니다 )
Lysis buffer 250μL
sample 200μL
protease 30μL
->한 tube에 모두 mix후 vortex-> spin down-> 가온기 3분(56도)
waste통 밑부분 잡지 않은 채로 DNA검출기계에 넣은 후 100% 메틸 알코올 250μL 분주
총 750μL추출후 기계에 넣어준다.
마지막으로 Wash buffer 750μL를 3번 넣어준 후 Elution buffer를 100μL넣어준 후 전원을 키면 기기가 자동으로 시약을 밑으로 떨어뜨리게 된다.
선생님들이 하시는 거 잘 메모해두었다가 따라하시면 됩니다.
Day3
쪽지시험 보는데, 오픈북이고 충분히 책에서 찾아서 쓸 수 있는 문제입니다. 시간도 넉넉히주셔서 정말 충분히 찾아쓸 수 있었구 첨삭해주십니다.
오전에는 쪽지시험과 자습이 다였구요
오후에는 음압실이라는 곳을 가게 되는데요, 음압실에서는 실제 코로나 검체를 가지고 핵산을 추출하는 작업을 볼 수 있어요. 실제 방호복도 입고 코로나검체 컨테이너에 들어가게됩니당
clean bench에서 선생님들이 코로나검체를 가지고 well에 분주하는 과정을 실제로 구경하게 됩니다.
핵산추출시약 <Advansure Nucleic Acid R Tube kit>
코로나바이러스-> ssRNA virus인대, 외피바이러스이기 때문에 이 외피를 깨주고 안의 핵산을 추출해야 한다. 그 과정을 하는 것이다.
tube의 각 컬럼에는 Lysis buffer, Washing buffer, Elution buffer가 담겨있다.
Elution buffer가 마그네틱 bead에 붙게 되면 핵산을 분리시키고, 마그네틱 rod가 마그네틱 bead만 제거하여 Elution buffer에 순수한 핵산만 남게 된다.
Day4
마지막날에는 염색체검사, 수확검사를 주로 하게 됩니다.
1)염색체수확검사
세포배양을 마친 검체를 가지고 colcemid를 처리하게 되면 염색체 중기에서 염색체들이 멈추게 된다
colcemid 처리 후 30min 후 원심분리 해 cell을 가라앉힌 후 상층액을 제거해 cell을 풀어주고 저장액을 파이펫팅하게 됨(염색체들이 잘 흩어져서 보이게끔 하기 위해서)
한 방울씩 넣는데 한번에 넣어버리면 cell들이 깨질 수 있기 때문에 한방울씩 넣는다.
30분 후 고정액을 처리하는데, 고정액의 비율은 빙초산:메탄올(3:1)
slide를 가지고 습도실로 가게 되는대, 습도실에서는 slide를 도말하게 되는 부분을 보여주심
1) 습도 맞춘 후 slide의 3군데에 차례로 tube속의 cell을 100μL분주한다.
2) 분주 후 slide warmer에 silde를 놓아준다, 이때 라벨링이 중요함
염색체 검사 하는 이유-> 산전진단, 혈우병 등 진단
방법- 김자염색, FISH 등 이용
염색체 검사의 경우 대부분은 중기상태에 염색체들이 모여있는데, 거기서 우리가 원하는 검사들의 프로세스들을 진행하는 과정이 대부분 실행된다.
각 염색체의 특징을 설명해주시고, 종이를 주시면서 각 염색체를 찾아보라고 하십니다.
염색체 찾고 틀린부분은 첨삭해주십니다.
2)염색체검사(염색체배양검사)
질환이 있는 사람들을 검사하는 방법
Heparin tube 사용
말초혈액과 골수를 사용한다. 골수는 상대적으로 비깨끗하고, 이물질, 기름기가 존재한다.
PBS990μL와 RBC sample을 10μL Tube에 분주한다.
WBC를 chamber에 도말해 현미경으로 찾아서 보여주심
골수의 경우 2000rpm에 5min정도 원심분리하여 상층액 분리한다
골수는 플라스틱 통을 한 사람당 3개 배양, 하나는 24h,48, 3번째는 3일 배양, 3일 배양에는 PHA를 넣어준다
말초는 2개의 통 사용, PHA 넣고 3일간 배양
원심분리한 Heparin tube의 상층액의 기름층을 제거해준 후 다시 잘 섞고, 각 플라스틱 통에 넣어준 뒤 세포배양기에 눕혀서 넣으면 검사 완료.