Re:Re:알려주세요..

: PCR : : 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105∼108배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다. : : 중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험 : : 1) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭 : : 2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning : : 3) DNA sequencing : : 4) 돌연변이 검사 : : 5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출 : : 6) 유전자의 footprinting : : 7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis) : : 중합효소 연쇄반응의 의학적 응용 : : 1) HLA형의 결정 : : 2) 법의학: 특정인의 유전자 검출 : : 3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등 : : 4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등 : : 5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등 : : 중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 세 단계로 이루어진다. : : 1) DNA의 변성(denaturation) 90℃∼96℃로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다. : : 2) Primer의 결합(annealing) 50℃∼65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다. : : 표 1. Primer 길이와 조성에 따른 annealing 온도 Primer 길이(base) : GC 조성에 따른 annealing 온도 : : 6 : 7 : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : 13 : 14 : 15 : 16 : 17 : 18 : : 16 : 39 : 41 : 43 : 45 : 47 : 49 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : : : : 17 : 43 : 45 : 47 : 49 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : : : 18 : 45 : 47 : 49 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : : 19 : 47 : 49 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : : 20 : 49 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : : 21 : 51 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : : 22 : 53 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : : 23 : 55 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : : 24 : 57 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : : 25 : 59 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : : 26 : 61 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : 85 : : 27 : 63 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : 85 : 87 : : 28 : 65 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : 85 : 87 : 89 : : 29 : 67 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : 85 : 87 : 89 : 91 : : 30 : 69 : 71 : 73 : 75 : 77 : 79 : 81 : 83 : 85 : 87 : 89 : 91 : 93 : : : : 3) DNA의 합성(polymerization) : : 70℃∼74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다. : : 위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다. : : : : A. Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭 : : 실험방법 : : 1. 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다. : : Template DNA(100 ng/ ml) : 1 ml : : Upstream primer(12.5 pmole/ml) : 1 ml : : Downstream primer(12.5 pmole/ml) : 1 ml : : dNTP(dA, dC, dG, dT 10 mM-each) : 1 ml : : 10x PCR 완충용액 : 5 ml : : 증류수 : 40 ml : : Taq DNA polymerase(1 unit/ml) : 1 ml : : : 10x PCR 완충용액(100 mM Tris-Cl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15∼20 mM magnesium chloride, 0.01% gelatin 또는 bovine serum albumin[BSA])은 효소에 딸려오는 것을 사용하면 되지만, MgCl2의 농도를 변화시킬 필요가 있는 경우에는 Mg-free 완충용액을 사용해야 한다. : : 여러명의 다른 환자 혈액에서 분리한 template를 같은 primer로 증폭하려 할 때에는 template를 제외한 다른 성분을 한꺼번에 섞은 PCR mix를 만들어서 쓰면 좋다. : : 위 반응은 단지 예일 뿐이며 모든 성분은 PCR 반응마다 여러번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다. 각 조성마다 고려해야 할 점과 주의사항을 아래에 따로 정리하였다. : : 최근에 나오는 PCR 기계에 맞는 PCR 시험관은 크기가 작고 얇아서 열 전도가 잘 되도록 된 것이다. 작아서 다루기는 어렵고 비싸지만 반응이 잘 일어나기 때문에 많이 쓰인다. : : 중합효소 연쇄반응은 대단히 민감한 반응이다. 위의 여러가지 시약들이 조금이라도 다른 물질에 오염되거나 더러운 tip을 쓰는 경우 false positive 반응이 나오는 확률이 아주 높으므로 반드시 깨끗한 시약을 조금씩 덜어서 쓰도록 하고 오염이 의심되면 버려야 한다. : : 2. 혼합한 시료를 PCR 기계에 넣고 다음과 같은 프로그램으로 PCR을 시작한다. : Denature : Annealing : Polymerization : Cycle 수 : : Cycle 1 : 94 ℃ 5 min : 60 ℃ 30 sec : 72 ℃ 30 sec : 1 : : Cycle 2 : 94 ℃ 30 sec : 60 ℃ 30 sec : 72 ℃ 30 sec : 30 : : Cycle 3 : 94 ℃ 30 sec : 60 ℃ 30 sec : 72 ℃ 10 min : 1 : : : : 위 반응은 단지 예일 뿐이며 annealing 온도와 각 시간은 PCR 반응마다 여러번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다. : : 옛날에는 혼합액 위에 증발을 방지하기 위해서 mineral oil을 얹어야 했지만, 최근의 많은 기계와 시험관은 이런 과정이 필요없도록 뚜껑 쪽에서도 가열하게 되어있다. : : 3. 반응이 끝나면 10∼20 ml 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응산물을 확인한다. : : 반응산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel보다 사용하기 편리한 agarose gel을 더 많이 이용한다. 그러나, 100 bp 이하의 반응산물을 확인해야 할 경우에는 agarose gel 상에서 구별이 어려운 경우가 있으므로 acrylamide gel(12%)을 사용하면 더 분명하게 확인할 수 있다. : : PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점 : : 1. Template DNA : : 선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.Chromosomal DNA인 경우 1 mg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg∼100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다. : : 2. Primer : : Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아(구 한국생공) 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.Primer의 양은 0.1~0.5 mM로 시행한다. : : 3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate) : : 시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20∼200 mM 정도를 사용한다. : : 4. 10x PCR 완충용액 : : 1) Magnesium : : 다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다. : : A, Primer가 template DNA에 결합하는 능력 : : B. Template 및 PCR 산물의 변성온도 : : C. Product specificity : : D. dNTP와의 결합 : : E. Taq DNA polymerase의 활동성 : : F. Primer-dimer artefact의 형성 : : a) 반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다. : : b) 위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다. : : c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM(때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다. : : 2) KCl : : Primer가 target DNA에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase의 반응율을 높여준다. : : 3) Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA) : : Taq DNA polymerase를 안정화한다. : : 5. Taq DNA polymerase : : Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70℃∼74℃이며 95℃에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다.DNA 합성의 오차율은 1.1x10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0x10-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능(3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다.한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다. : : B. PCR의 응용 : : 중합효소 연쇄반응을 처음 고안해 낸 Kary Mullis가 이 방법의 발표 후 17년만인 지난 1992년 노벨 화학상 수상자로 선정되었는데, 선정 사유는 특정 DNA의 증폭 방법을 고안함으로써 과학발전의 획기적인 계기가 되었다는 것이었다. 이를 구체적으로 설명하자면 연구하고 싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능하게 되었다고 할 수 있으며, PCR 방법을 응용하면 새로운 여러가지 기술개발이 가능해졌다는 이야기가 된다. 새로 개발된 실험방법이 소개되는 Nucleic acid research와 같은 잡지에는 PCR을 응용한 새로운 실험방법이 매회 거의 빠짐없이 발표되고 있다. 많이 사용되는 방법 중에는 RT-PCR(reverse transcriptase PCR), SSCP(single strand conformation polymorphism), RACE (rapid amplification of cDNA ends), ISPCR(in situ PCR), DDRT-PCR(differential display reverse transcriptase PCR) 등이 있는데, 본 장에서는 간단한 원리만 소개하기로 하겠다. : : 1) RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) : : 특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며 (2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. : : 2) SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) : : 어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DNA의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로 DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에 의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다. 이와 같은 원리를 바탕으로 1989년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP는 유전자의 돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.최초의 SSCP 방법은 genomic DNA를 적당한 제한효소로 절단하고 alkali로 denaturation시킨 후 non-denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동한 다음 이를 nylon membrane에 transfer하여 fragment DNA를 옮겨 놓은 후 방사성 동위원소로 표지된(radiolabeled) RNA 혹은 DNA probe를 이용하여 autoradiography를 실시함으로써 X-ray film에 나타나는 정상 유전자와 변이된 유전자와의 전개거리의 차이를 확인하여 돌연변이를 검색하였다. 그러나 그 후 PCR 산물을 SSCP로 분석하는 방법이 소개되었고, 이 방법이 대중화됨에 따라 요즘은 PCR-SSCP라는 용어로 많이 불리어지고 있다. 최근까지는 PCR-SSCP를 할 경우 PCR 산물에 직접 동위원소를 표지하여 autoradiography를 통해 결과를 얻는 방법이 많이 이용되었으나 최근에는 silver staining으로 polyacrylamide gel을 검색하는 방법이 소개되어 현재 이 방법이 유용하게 이용되고 있다. Silver staining 방법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 훨씬 더 빠른 시간에 PCR 산물을 분석할 수 있는 장점이 있으며 민감도(sensitivity)에는 방사성 동위원소를 이용한 방법과 별 차이가 없으므로 더욱 편리하고 안전하게 실험을 진행할 수가 있게 되었다. : : 3) RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : : cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 방법이 현재 가장 일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전한 cDNA를 얻어낼 수 있다. 그러나 이런 과정은 대단히 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한 initiation codon부터 termination codon까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한 경우에도 cDNA의 5'과 3'-끝의 non-coding region 일부는 library screening에서 얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE에서는 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5'-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다. : : 4) ISPCR (In Situ Polymerase Chain Reaction) : : PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다. : : 현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. : : 5) DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcriptase PCR) : : 일반적으로 고등동물에서는 약 100,000가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며 각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis, 세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는 유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다. 특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은 subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR을 이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다.DDRT-PCR이란 서로 다른 세포로부터 RNA를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아내기 위하여 T 염기 10개와 비특정염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 이 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide를 primer로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. : : *연세의료원 분자생물학대학원 에 있는 자료에요 : 도움이 되실런지...... 그럼 이만... 아이쿠 이런 정말 감사 드립니다. 전 이렇게 자세히 정보를 주실지 정말 몰랐어요.. 이 카페에 들기 정말 잘 했다하는 생각이 절로 드네요... 휴 다 읽어보니라고 고생 좀 했어요.. 헤헤헤헤 은영님 정말 정말 감사드려요... 어떻게 감사를 드려야 할지... 정말 감사드립니다....정말 몸 둘바를 모르겠습니다...