단백질 전기영동 SDS-PAGE 및 2차원 전기영동

1. 전기영동 단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 하전을 띄므로 이를 기초로 하여 이들 분자를 전기장을 띤 매질(겔)에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법을 전기영동(electrophoresis)라 한다. 단백질의 전기영동은 일반적으로 아크릴아미드(acrylamide)를 비스아크릴아미드로 결합시킨 중합체인 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 가장 많이 사용한다. 이 폴리아크릴아미드 젤의 농도가 증가할수록 구멍의 크기가 작아지므로 분리하고자 하는 단백질의 분자량을 알아서 폴리아크릴아미드 겔의 농도를 정한다. 2. SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 폴리아크릴아미드 젤은 분자체(molecular sieve)의 역할을 하므로 각 단백질은 거의 그들의 질량에 비례하여 이동한다. 그러나 단백질을 이루는 대부분의 아미노산이 띄는 전하량의 정도가 다르기 때문에 단위 질량당 전하의 정도가 달라지고, 단백질 분자의 모양도 다양하여 그들의 이동속도를 예상하는 것은 간단하지가 않다. 따라서 단백질의 순도의 분석 및 분자량의 결정을 위한 전기영동은 음이온 세제인 sodium dodecyl sulfate(SDS)와 디설피드 결합(S-S bond)을 끊는 2-메르캅토에탄올을 단백질 용질에 첨가해 줌으로써 가능하다. ① 각 단백질이 가지고 있는 전하량과 분자의 모양이 다양함. ② SDS는 단백질에 결합하여 원래의 전하에 관계없이 단백질 분자량에 비례하는 양만큼 음전하를 가짐. ③ SDS의 결합으로 단백질의 고유한 3차 구조를 잃고 linear 상태로 바뀜으로 순전히 분자량에 따라 분리가 됨. 이와 같이 SDS를 이용한 전기영동은 질량(분자량)의 크기에 따라 큰 폴리펩티드는 늦게 이동하고 작은 폴리펩티드는 빨리 이동되는 영동상을 볼 수 있는 것이다. 그러므로 단백질의 분리과정을 확인해 볼 수 있을 뿐만 아니라, 이들 단백질의 이동도가 각 분자량의 대수값에 비례하므로 분자량을 이미 알고 있는 표식단백질과 비교하여 분자량을 산출해 낼 수 있다. 3. 2차원 SDS-PAGE 비슷한 분자량의 다른 단백질은 1차원 SDS-PAGE만으로는 효과적으로 분리될 수 없다. 2차원 SDS-PAGE는 고분리능을 기지고 있는데 이것은 특정 단백질이 가지는 고유의 등전점에 따라 분리를 한 후(IEF: isoelectric focusing), 분자량에 따라(SDS-PAGE) 또 분리하는 것이다. ① 1차 전기영동 IEF는 pI(등전점)가 다양한 양쪽성 용매를 함유하는 구멍이 큰 matrix에서 이루어 진다. 전기장에서 양쪽성 용매는 pH 구배를 형성하여, 전하량에 따라 이동하는 단백질이 전기장에서 net charge가 0이 되는 곳에서 정지하게 된다. ② 2차 전기영동 전하량에 의해 분리된 gel을 다시 SDS-PAGE를 시행하여 전하량에 의해 분리된 단백질을 또다시 분자량에 의해 분리하는 것이다.