기본필독코스 1단계 PCR 개념 및 원리

[이창운]

PCR 개념 및 원리

정의 : The polymerase chain reation (PCR) is a technique for the in vitro amplification of sfecific DNA sequencesby by the simultaneous primer extension of complementary strands of DNA.

History : 1971년 원리가 발견됨 (JBC, Korona)
1987년 Mullis에 의해 PCR이라는 이름이 붙여짐
Heat-stable DNA polymerase의 발견으로 급속히 기술발전됨
(Taq DNA polymerase.)

원리 :

(1) 그림 1 : primer extension 반응원리
   5' 3'방향으로 상보가닥 합성 (DNA pol.이 적용)
   single-strand DNA가 template로 적용
(2) 그림 2 : PCR 원리 도식화 한 것.

* 요구되는 것 - primer pair (주형에 상보적 서열을 가진 단일가닥 DNA로 보통 18-26mer 사이의 길이를 가짐 (서로 반대방향), dNTP (DNA 합성 component), template, buffer (Mg2+ 포함)

Ⅱ. PCR의 응용 범위

유전자 cloning

mutation detection - SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism),
DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis),
Sequencing

gene typing - AFLP (amplified fragment length polymorphic DNA),
RAPD (random amplified polymorphic DNA),
STR (short tendem repeat)

sequencing

detection of bacterial and viral infections

sex determination

molecular evolution

Plasmid DNA purification

(Wizard PLUS SV Miniprep DNA purification Kit)

1. Plasmid의 정의

Plasmid는 chromosomal DNA와는 별도로 박테리아 세포 내에서 발견되는 작은 DNA로chromosomal DNA와 비교해 볼 때 크기는 상당히 작고 (4-100Kb) 스스로 복제가 가능하다. 자연계에서 plasmid는 항생물질, 중금속, mutagen, bacteriophage등에 대한 내성 유전자를 운반하거나 제한 효소, unusual amino acid를 생산하기도 하며, 복잡한 유기화합물을 분해하는 유전자를 가지고 있는 경우도 있다. 일부 plasmid는 접합과정(conjugation)을 통해 다른 박테리아 세포로 옮겨갈 수 있다. 따라서 인위적으로 plasmid를 다른 박테리아 세포에 감염시킬 수 있고, 이를 이용하여 유전 형질을 쉽게 변환 시킬 수 있으며. 순수하게 분리 정제하기도 쉽기 때문에 plasmid는 현대 분자생물학에서 가장 널리 사용되는 유용한 도구가 되고 있다. 분자생물학에서 cloning vector로 사용되는 plasmid는 replicator, selectable marker, cloning site의 3가지 공통요소를 가지고 있다. replicator는 DNA복제가 시작되는 부위이고 <일반적으로 origin of replication(ori)이라 함>. selectable marker는 대개 항생물질에 대한 내성을 나타내는 유전자를 encode하는 부분이며, plasmid가 전이된 세포를 selection할 수 있게 해준다. Cloning site는 plasmid의 복제 능력 등에 영향을 주지 않으면서 외부 DNA를 삽입시키기 위한 제한효소 절단 부위이다.

2. Plasmid DNA의 분리

형질전환 균주가 가지고 있는 plasmid에 존재하는 내성 유전자에 상응하는 항생물질이 들어간 선택배지에서 균주를 배양하면 plasmid를 가지고 있는 형질 전환 균주는 항생물질이 존재하는 배지에서 살아남는다. 형질전환 균주를 액체 배지 상에서 적당한 세포 수를 배양한 후 회수해서 plasmid를 얻을 수 있다. 세포를 끓이거나(Boiling method), alkali를 처리할 경우 (Alkaline lysis) 세포가 용해되면서 세포 내에 존재하는 plasmid가 세포 밖으로 나오게 된다. 이러한 처리를 거친 후 원심분리를 통해 세포 잔여물을 plasmid가 다량으로 녹아있는 수용액을 얻을 수 있다. 이 수용액에 ethanol이나 isopropanol을 처리하면 salt 존재 하에서 DNA가 침전되며 침전 된 DNA를 적당한 완충용액에 녹임으로써 plasmid DNA를 분리 할 수 있다.

3. Plasmid DNA 정제 Plasmid DNA를 정제하는 방법은 plasmid DNA가 가지고 있는 상대적으로 작은 크기와 closed circular구조, 그리고 net negative charge의 특징을 이용하고 있다.

1). CsCl - Ethidium bromide gradient equilibrium centrifubation
(Large Prep.)
이 방법은 CsCl gradient 하에서 linear DNA와 plasmid와 같은 closed circular DNA에 결합하는 ethidium bromide 양의 차이를 이용한다. Ethidium bromide는 DNA의 base 사이에 intercalation 되어 double helix DNA를 relaxed form으로 unwinding 시킨다.
Super-twisted plasmid는 Ethidium bromide가 intercalation 됨에 의해 relaxed form으로 되었다가 다시 반대 방향으로 supertwisted 된다. 이에 따라 더 이상의 ethidium bromide intercalation은 억제된다. 반면 linear나 nicked DNA는 이러한 제한이 없기 때문에 supertwisted plasmid 보다 더 많은 양의 ethidium bromide가 intercalation 된다. 결과적으로 super-twisted 된 plasmid DNA는 linear DNA에 비해 밀도가 증가하게 되어 CsCl gradient 하에서 아래쪽에 모이게 된다. single stranded DNA는 double stranded DNA에 비해 Cs+가 더 많이 결합하며, rthidium bromide가 조금밖에 intercaltion 되지않기 때문에 무거운 상태로 남아 있다. 따라서 centrifuge의 바닥에 가라앉게 된다.
CsCl-ethidium bromide gradient equilibrium centrifugation은 plasmid를 대량으로 정제하기 위한 목적으로 오랫동안 사용되어 오고 있으나 mutagen인 ethidium bromide를 사용하며, 비용과 시간이 많이 든다는 단점이 있다. 간단히 방법을 설명하면 정제하고자 하는 DNA 시료를 CsCl/ethidium bromide와 mixing하여 equlilbrium에 도달할 때까지 centrifugation 한 후 plasmid band를 주사기로 회수하고 butanol extraction으로 ethidium bromide를 제거하고, CsCl의 dialysis로 제거한 후 ethanol precipitation 시켜 plasmid DNA를 얻는다.

2) Kit를 이용하는 방법
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system 사용

3) PEG에 의한 침전법
Polyethylen glycol(PEG) precipitation은 고순도의 plasmid DNA를 빠르고 편리하게 정제 할 수 있는 방법이다. 이 방법의 편리한 점은, 과정 중 어느 단계에서도 plasmid DNA 손실 없이 중단 할 수 있다는 점이다. 또한 ultracentrifuge이나 ethidium bromide와 같은 mutagen을 사용할 필요가 없다. 정제하고자 하는 plasmid 시료내의 오염된 RNA나 chromosomal DNA는 RNase, NaOH/SDS, Potassium acetate 처리에 의해 제거되며, plasmid DNA는 이 상층액으로 부터 추출되며 PEG에 의해 침전된다. 이 방법은 순수한 plasmid가 필요시 사용된다.

4. 자외선 흡광도에 의한 DNA 농도 측정
핵산, nucleotide, nucleoside는 자외선을 강하게 흡수하는데, 이는 purine, pyrimidine 염기의 공명 구조 때문이다. 개개인의 염기들은 각기 특징적인 자외선 흡수 spectrum을 가지며 핵산의 총 흡광도는 염기들의 총 흡광도와 같다고 생각할 수 있으므로 260㎚에서의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 산출한다. 한편 단백질은 280㎚에서 강하게 흡광 함으로 280㎚에서의 흡광도를 측정하여 A280/A260비를 측정함에 의해 DNA의 순도를 추정할 수 있다.

260㎚에서 double strand DNA 의 농도는 OD 260값이 1.0일 때 50㎕/ml이다.
A260/A280이 1.8-2.0인 경우 순도가 높은 DNA로 볼 수 있다.