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시료 채취 → 검화 → 진동 추출 → HPLC법 |
비타민D
비타민D에는 식물에서 유래하는 비타민D2(ergocalciferol)과 동물에서 유래하는 비타민D3(chole-caciferol)가 있다.
분석법은 비타민A와 마찬가지로 양자를 동시에 검화하고 추출하여 HPLC로 측정한다. 단, 동물의 비타민D 필요량이 적음에 따라 저함량 수준의 측정이 필요하기 때문에 HPLC에 의한 분취(分取) 정제조작이 필요한 경우가 많다.
시료 채취 → 검화 → 진동 추출 → HPLC 분취법(分取法)으로 정제 → HPLC법 |
※5 비탁법(比濁法) : 탁한 정도를 흡광도에 의해 비교하여 측정하는 방법
※6 산도측정법 : 생성된 젖산 량을 적정에 의해 측정하는 방법이다. 단, 첨가하는 미생물이 유산균인 경우에 한해서 적용할 수 있다.
비타민E
비타민E는 천연에서 α-, β-, γ-, δ-토코페롤(tocopherol)과 α-, β-, γ-, δ-토코트리에놀(tocotrienol)의 8종류가 있다. α-토코페롤의 비타민E 활성이 가장 강하다. 비타민A와 마찬가지로 검화 추출하고, HPLC로 분리, 측정한다.
시료 채취 → 검화 → 진동 추출 → HPLC법 |
비타민K
비타민K에는 식물에서 유래한 K1(필로퀴논[phylloquinone]), 미생물이 생산하는 K2(메나퀴논[mena-quinone]) 및 합성품인 K3(메나디온[menadione])이 있다. 비타민K1과 K2는 HPLC로 동시 분석이 가능하다.
비타민K는 알칼리에 대해서 불안정하기 때문에 다른 지용성 비타민 분석에서 채용하고 있는 검화 조작은 행하지 않는다. 유기용매로 시료에서 추출한 후 필요에 따라서 칼럼 크로마토그래피 등으로 정제하여 HPLC로 측정한다.
HPLC 분석에 있어서는 자외선 검출기나 비타민K를 포스트 칼럼에서 환원형으로 변화시켜 형광 검출기로 측정하는 방법 등이 있다. K3의 염류는 K1이나 K2와는 성질이 다르기 때문에 수용액으로 추출하여 HPLC로 측정한다.
시료 채취 → 가온 → 진동 추출 → 정제 → HPLC법 |
카로테노이드 (carotenoid)
카로텐(caroten)으로 대표되는 카로테노이드 색소는 지용성이다. 비타민A의 역할을 하는 α-, β-, γ-카로텐 외에 라이코핀(lycopene), 루테인(lutein), 아스타크산틴(astaxanthin) 등이 있으며, 근년에 들어 그 기능성이 주목 받고 있다.
분석법은 비타민A와 마찬가지로 검화, 추출하여 HPLC로 측정하는 방법과 알칼리에 불안정한 물질(아스타크산틴 등)에 대해서는 유기용매로 추출하여 HPLC로 측정하는 방법이 있다.
사료 채취 → 검화 → 진동 추출 → HPLC법 |
2. 수용성 비타민의 분석
비타민B1 (thiamin) • B2 (riboflavin)
천연물 중의 비타민B1은 대부분 3종류의 인산에스테르형으로 존재한다. 기타 염산티아민, 초산티아민 등이 사료 첨가물로써 인정되어 있다.
분석의 개요는 염산으로 가열 추출한 뒤에 효소 처리를 행하여 인산형 티아민을 유리 티아민으로 변환하여 HPLC를 사용해 측정한다.
또, 비타민B2는 천연물 중에서는 유리형인 리보플라빈뿐만 아니라 2종의 보조효소 형태로 존재한다.
분석법은 비타민B1과 동일하며, 염산으로 가열 추출한 후 효소 처리를 행하여 유리형인 리보플라빈으로 변환하여 HPLC를 이용해 측정한다.
비타민B1
시료 채취 → 산(酸)추출 → 효소 분해 → 정제 → HPLC법 |
비타민B2
시료 채취 → 산(酸)추출 → 효소 분해 → HPLC법 |
비타민C
비타민C는 아스코르빈산(ascorbic acid)이라고도 불리며, 널리 자연계에 존재하며, 식품에서는 항산화제로 이용된다.
비타민C는 환원형인 아스코르빈산과 산화형인 디하이드로아스코르빈산의 2가지 형태가 존재하며, 후자는 체내에서 환원효소에 의해 신속히 환원형으로 변환되기 때문에 두 성분은 동등한 생물학적 효력을 가지고 있으며 양자의 합계량을 총 아스코르빈산으로 정량하는 것이 일반적이다.
HPLC를 이용한 측정 방법에서는 아스코르빈산을 다하이드로아스코르빈산으로 변환한 후에 유도체화하여 가시 영역에서 측정하는 방법이 널리 이용되고 있다.
시료 채취 → 추출 → 산화 → 유도체화 → HPLC법 |
나이아신(Niacin) (니코틴산, 니코틴산아마이드) – 비타민B3
나이아신이란 일반적으로는 B군 비타민에 속하는 니코틴산과 니코틴산아마이드 및 이들의 뉴클레오타이드류※7의 총칭이다. 산화환원효소※8의 보효소이며, 체내에서 가장 다량으로 존재하는 비타민이다.
미생물 정량법에서는 니코틴산과 니코틴산아마이드에 대응하는 유산균(Lactobacillus plantarum ATCC 8014)가 일반적으로 사용된다. 2종류의 유리형에 대응하는 균주를 사용함으로써 나이아신을 총량으로 구한다. 나이아신은 산에 안정하기 때문에 유리형으로 변환하는 데는 산분해가 유효하다.
시료 채취 → 추출 → pH 조정 → 미생물 정량법 |
비타민B6
비타민B6에는 피리독신(pyridoxine), 피리독살 및 피리독사민(pyridoxal) 및 피리독사민(pyridoxamine) 3종류의 유리형과 인산기가 결합한 에스테르형 3종류, 총 6종류의 기본형이 알려져 있다. 동물성 식품에는 피리독살5’-인산과 피리독사민5’-인산이 많이 함유되어 있으며, 식물성 식품에는 피리독신이 많이 함유되어 있다.
미생물 정량법에서는 피리독신, 피리독살, 피리독사민에 거의 동등한 정도로 대응하는 효모(Saccharo-myces cerevisiae ATCC 9080)를 사용하는 방법이 일반적이다. 3종류의 유리형에 대응하는 균주를 사용함으로써 총 비타민B6의 양을 구한다. 에스테르형으로 존재하는 것이 많기 때문에 전처리에서 산을 이용해 가수분해하여 에스테르형을 유리형으로 변환할 필요가 있다.
시료 채취 → 추출 → pH 조정 → 미생물 정량법 |
엽산 (葉酸) (folic acid, 비타민B9 [비타민M이라고도 부름])
엽산이란 좁은 의미로는 프테로일글루탐산(pteroylglutamic acid : PteGlu)만을 의미하지만 일반적으로는 환원형 엽산인 디하이드로체(DHF), 테트라하이드로체(THF)와 이들의 폴리γ-글루타민산체를 포함한 총 엽산을 나타내는 경우가 많다.
엽산은 동물성 식품에서는 닭이나 소의 간, 식물성 식품에서는 멜로키아, 시금치 등에 많이 함유되어 있다. 정상적인 조혈(造血) 작용을 유지하기 위해 필요하며, 핵산(DNA, RNA)의 합성에도 관여하고 있다.
미생물 정량법에서는 엽산 화합물의 대부분에 활성을 나타내는 유산균(Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469)를 이용한다. 그러나 폴리γ-글루타민산체에서는 활성을 나타내지 않기 때문에 콘쥬가제(conjugase) 처리에 의해 폴리γ-글루타민산체를 분해하여 모노글루타민산체로 변환할 필요가 있다.
※7 뉴클레오타이드類 : 니코틴아마이드아데닌뉴클레오타이드(NDA), 니코틴아마이드아데닌아데닌디뉴클레오타이드酸(NADP) 등을 나타낸다.
※8 산화환원효소 : 산화환원 반응의 반응 속도를 촉진하는 효소.
시료 채취 → pH 조정 → 추출 → pH 조정 → 효소반응 → 분취 → pH 조정 → 미생물 정량법 |
바이오틴 (Biotin, 비타민B7)
바이오틴은 생체 내의 지방산 대사, 당 대사 또는 분지쇄(分枝鎖) 아미노산※9의 대사에 관계하는 비타민이며, 바이오틴효소의 보효소이다.
미생물 정량법에서는 유산균(Lactobacillus plantarum ATCC 8014)가 일반적으로 사용된다. 이 균주는 유리형인 바이오틴과 바이오틴D-설폭사이드(sulfoxide)에만 활성을 나타내기 때문에 산분해에 의해 결합형을 유리형으로 변환시킬 필요가 있다.
시료 채취 → 추출 → pH 조정 → 분취 → pH 조정 → 미생물 적정법 |
판토텐산 (Pantothenic acid, 비타민B5)
판토텐산은 코엔자임(CoA)의 구성 성분으로 당이나 지질의 대사에 관여하고 있는 비타민이며, 에너지 생산이나 스트레스에 대한 저항성을 부여하는데 필요하다.
시료 채취 → pH 조정 → 추출 → pH 조정 → 효소반응 → 분취 → pH 조정 → 미생물 적정법 |
비타민B12
비타민B12에는 시아노코발라민(cyanocobalamin), 하이드록소코발라민(hydroxocobalamin), 설파이드코발라민, 메틸코발라민, 아데노실코발라민 등의 유사한 종류가 있다.
비타민B12는 동물성 식품에 함유되어 있으며, 특히 축육, 어패류, 유제품에 많다. 식물성 식품에는 거의 함유되어 있지 않지만 해조류나 제조 과정에서 미생물이 관여하는 된장, 청국장(일본의 나토[納豆])과 같은 발효식품에는 함유되어 있다.
미생물 정량법에서는 유산균(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 7830)이 일반적으로 사용된다. 이 균주는 각 코발라민 유연체(類緣體)에 대한 활성이 다르기 때문에 각 유연체를 시아노(cyano)형으로 변화시켜 놓을 필요가 있다. 또, 핵산에도 활성을 나타내므로 열알칼리 처리에 의해 비타민B12를 분해시켜 놓은 것으로 샘플 블랭크(blank)를 측정하여 보정할 필요가 있다.
시료 채취 → 추출 → 분취(分取) → pH 조정 → 미생물 정량법 |
콜린 (choline, 비타민과 같은 작용 물질)
콜린은 돼지 담즙(쓸개즙)에서 항지방간 인자로써 단리(單離)된 화합물로 1849년 A. Strecker가 돼지의 담즙으로부터 단리하여 명명하였다. 주로 담즙(그리스어로 chole)에서 보인다고 하는 그의 생각에서 콜린(choline)으로 되었다.
포스파디딜콜린(phosphatidylcholine)(레시틴) 같은 인산지질의 구성 성분으로 되는 이외에 아세틸콜린으로써 신경 전달에 관계하고 있다.
분석법은 염화콜린을 질산-물(1:3)로 추출하여 라이네케(Reinecke)염메탄올 용액을 반응시켜 콜린라이네케염의 결정을 생성시키고 이 결정을 아세톤에 용해시켜 흡광도를 측정한다.
시료 채취 → 추출 → 반응 → 아세톤 용해 → 흡광도의 측정 |
※9 분지쇄(分枝鎖) 아미노산 : 바린, 로이신, 이소로이신 등 측쇄(側鎖)가 분지되어 있는 아미노산이다. BCAA라고도 부른다.
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