분자생물학 DNA chip

[행이~]

DNA Chip


DNA chip 이란?

DNA chip은 기존의 분자 생물학적 지식에 현대에 엄청난 발전을 한 기계 및 전자공학의 기술을 접목해서 만들어 졌다. 기계 자동화와 전자 제어 기술 등을 이용하여 적게는 수백개부터 많게는 수백만개의 DNA를 아주 작은 공간에 직접 넣을 수 있게 만든 것이다. 이러한 DNA chip이 대체 할 수 있는 대표적인 유전공학 기법으로는 Southern과 Northern biot. 돌연변이 검색 그리고 DNA sequencing 등이 있다. 이와 같은 방법들과 가장 큰 차이점은 동시에 최소한 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색 할 수 있다는 것이다.또 하나 다른 점은 Sourthern 이나 northern blot.의 경우 유전 물질을 붙이는 매개체로 nitrocellulose 막을 사용하는 반면에 DNA chip에서는 유리와 같은 고형체를 사용한다는 것이다. 그럼으로써 DNA chip은 아주 적은 양의 유전 물질을 고밀도로 붙일 수 있게 되었고 동시에 많은 수를 검색 할 수 있다는 것이다. DNAS chip은 붙이는 유전 물질의 크기에 따라 cDNA chip과 oligonucleotide chip으로 나눌 수 있다. 이들 DNA chip의 이름에서도 알 수 있듯이 cDNA chip에는 최소한 500bp 이상의 유전자(full-length open leading frame 또는 EST)가 붙여져 있고, oligonucleotide chip에는 약 15-25개의 염기들로 이루어진 oligonucleotide가 붙여져 있다. 다음에서 지금 까지 개발된 대표적인 DNA chip의 종류와 제작 방법들을 간단히 알아 봤다.

※ DNA chip의 종류

§DNA chip 제작 방법에 의한 분류
DNA chip은 제작 방법에 따라 크게 4 가지로 나눌 수 있다. 이들의 특징은 다음과 같다.



§Microarray chip.

Microarray chip은 1995년 미국 stanford 대학의 생화학과에서 만들어 졌으며약 2-3천개의 유전자가 약 1 cm2 안에 붙어 있다.처음에는 유전자 발현 측정 목적으로 cDNA를 붙여 놓은 chip을 만들었기 때문에 cDNA microarray chip이라 불렸지만 지금은 돌연변이를 검색할 수 있도록 oligonucleotide를 같은 방법으로 붙인 chip도 개발되었다.
그러면 어떻게 cDNA microarray chip을 만드는지 yeast를 예로 해서 알아보면, 먼저 yeast의 모든 염기서열이 밝혀졌기 때문에 이것으로부터 모든 가능한 유전자(open leading frame)들의 위치를 파악한다. 각각 확인된 유전자들의 시작과 끝 부분에 PCR을 하기 위해 필요한 연기들인 primer를 컴퓨터에 의해 찾아낸다. 즉 6,100 개의 모든 yeast 유전자를 PCR 하기 위해서는 12,200개의 다른 primer들이 필요한 것이다. 이들 primer들은 서로 비슷한 결합 온도(annealing temperature)를 가지고 있어서 동시에 여러 유전자를 PCR 할 수 있어야 한다. 이렇게 설정된 primer들은 stanford 대학에서 만든 96-well oligonucleotide synthersizer로 합성 되게 된다. 이 기계를 사용하면 96개의 다른 oligonucleotide를 20 nmole의 크기로 합성 할 수 있는 것이다. 이렇게 만들어진 primer들을 이용하여 yeast의 genomic DNA로부터 유전자를 증폭시킨다. 대부분의 yeast 유전자들은 intron을 가지고 있지 않기 때문에 바로 genomic DNA로부터 증폭된 DNA들은 하나의 완벽한 유전자이다. PCR을 한 후 성공 여부는 agarose gel에서 검사하고 증폭된 유전자를들은 ethanol을 ld용하여 침전시킨다. 이렇게 증폭된 yeast의 유전자들은 역시 stanford 대학에서 자체 제작한 microarrayer라는 기계에 의해 보통 현미경 실험에 자주 쓰이는 glass slide에 심어지는 것이다.
각각의 glass slide들은 poly-L-lysine으로 처리되어 있기 때문에 유전자들과 결합 할 수 있다. DNA microarrayer는 크게 세 부분으로 나눌 수 있다.
첫 번째가 수십개의 glass slide들을 놓는 곳이고 두 번째가 PCR 된 유전자를 담고 있는 96-well plate를 놓는 곳이다. 마지막으로 DNA를 glass slide에 옮겨 주는 역할을 하는 pin이 붙어 있는 robotic printhead이다. 이 pin이 DNA를 965-well plate로부터 담아서 glass slide로 컴퓨터가 지정한 장소에 심는 것이다. 이와 같은 연속적인 방법을 통해서 수 천개의 yeast 유전자를 가진 cDNA microarrsy chip을 만들 수 있는 것이다.
이렇게 개발된 cDNA microarray chip은 두 가지 다른 환경에서 발현되는 독특한 유전자를 분석하는데 엄청난 도움이 된다. 수천개 이상의 유전자 발현 변이를 단 한번의 실험으로 검색 할 수 있는 것이다. 실험 과정을 살펴보면 먼저 두 개의 다른 환경에서 얻은 세포들로부터 mRNA를 추출한다. 이들 mRNA를 역전사(reverse transcription) 시킬 때 각각 다른 색깔의 형광 물질을 띤 염기를 집어넣어 빨간 색(Cy5)이나 녹색(Cy3)을 띤 cDNA를 합성한다. 이와 같이 합성된 두 개의 cDNA를 똑 같은 양으로 섞어서 하나의 cDNA microarray chip에 결합시킨다. 결합이 안된 유전자들을 씻어낸 chip은 Laser fluorecence scanner에 의해 읽혀진다. 각각 유전자의 형광 정도는 그 유전자의 발현 정도를 알려주는 것으로 이들 정보는 컴퓨터에 의하여 분석되어 진다. 이렇게 cDNA microarray chip을 이용한 한번의 실험으로 한 환경에만 발현하는 유전자를 찾을 수 있을 뿐만 아니라 발현 정도까지도 알 수 있다.
이와 같은 방법은 인간의 새로운 암 유발 유전자를 찾을 때나 진단에도 널리 사용 할 수 있다. 미국에서 진행되고 있는 CGAP(cancer genome anatomy project)에서도 이 cDNA microarray chip 기술을 사용하여 암 관련 유전자들의 발현 정보를 모으고 있다. 암 세포에만 특별하게 발현되는 유전자는 이 암이 생성되는데 이 유전자가 어떠한 역할을 담당했다는 것을 의미하며 이들은 그 암의 진단을 했을 때도 많은 도움을 줄 것이다. 이와 같은 암 연구 이외에도 각각 다른 장기로부터 얻은 세포들의 유전자 발현 정도를 알아냄으로서 생명의 신비를 좀더 분명하게 밝힐 수 있을 것이다. 이 청사진을 이용하면 이때까지 볼 수 없었던 유전자간의 복잡한 연결 고리들을 한결 쉽게 풀 수 있을 것이다.

§Inkjet DNA chip.

inkjet 원리를 이용하여 DNA chip을 만드는 방법은 위에서 설명한 microarray chip과 거의 비슷하다. 다만 pin 대신에 컴퓨터 inkjet printer에서 쓰이는 것과 같은 원리의 cartridge를 사용한다는 것이 다르다. 각각의 cartridge 안에는 유전자가 들어 있어서 전기적인 힘으로서 유전자를 고형체 위에 뿌리게 되어 있다. 지금까지 뿌리는 방법에 따라서 thermal, solenoid 그리고 piezoelectric의 3 가지 방법이 있다. 이 기술들의 장점은 유전자를 전기적으로 chip 표면에 닿지 않고 뿌릴수 있기 때문에 정량의 유전자가 붙어 있는 많은 수의 chip을 생산 할 수 있다는 점이다.
하지만 아직까지는 많은 종류의 다른 유전자를 가진 DNA chip을 생산하기 위해서 필요한 cartridge 안의 유전물질 교환과 같은 기술적인 문제가 조금 있다. 그러나 이들 기술적인 문제들을 해결하는데는 많은 시간이 걸리지 않을 것이다.


§Affymetrix oligonucleotide chip.

미국의 실리콘 밸리에 있는 Affymetrix라는 회사는 컴퓨터 산업계에서 컴퓨터 chip을 만들기 위해서 쓰는 photolithography라는 기술을 사용하여 수만개의 다른 염기(nucleotide)들을 하나의 유리 위에 직접 합성하는데 성공하였다. 아마도 이 기술은 20세기를 대표하는 컴퓨터 산업과 21세기를 대표할 생명공학 산업의 절묘한 결합이라 할 수 있다. Affymetrix는 이 기술을 사용하여 초기에 1.28 cm2 안에 65,000개의 다른 oligonucleotide를 가진 chip을 만들었고 지금은 400,000개의 다른 oligonucleotide를 가진 chip을 만들 수 있게 되었다. 각각의 oligonucleotide들은 15-25개의 염기로 이루어져 있다.
oligonucleotide가 합성되는 유리의 표면은 각각의 염기들이 합성 할 수 있게 보조체가 붙어 있다. 하지만 이들 보조체는 평소에 빛에 민감한 화학 물질로 덮여 있어 염기들이 합성 할 수 없다. 이러한 성질을 이용하여 특별히 설계된 photomask를 위에 놓고 빛을 쏘이면 구멍이 나 있는 곳으로 빛이 들어가 그곳에 있는 보조체의 화학 물질들을 제거한다. 이렇게 화학물질이 제거된 보조체들을 가진 chip을 한가지 염기가 있는 곳에 넣으면 모든 활성화된 보조체들에 염기가 가서 합성된다. 물론 염기들도 빛에 민감한 화학 물질로 덮혀 있어 한 개씩밖에 합성이 안된다. 이러한 chip을 씻은 다음 다시 다르게 설계된 photomask를 이용하여 빛을 쏘아 주면 그곳에 있는 보조체나 염기들이 활성화되어 다음 염기들과 합성 할 수 있게 되는 것이다. 이와 같은 반복적인 과정을 통하여 65,00개의 다른 25mer와 25개의 염기를 가진 oligonucleotide를 약 100 cycle 안에 합성 할 수 있다.
앞에서 설명한 cDNA microarray chip과 이 oligonucleotide chip의 다른 점은 chip에 완전한 유전자(full-length ORF) 대신에 25mer를 심은 것이다.이와 같은 차이점 때문에 유전자 발현을 검색하는데 쓰이는 oligonucleotide chip을 만들 때 유전자의 어떤 부분을 선택하여 합성할 것인가가 아주 중요하다. 평균 20개의 25mer들이 하나의 유전자를 대표하여 선택된다. 또한 각각의 annealing temperature가 서로 비슷해야 한다. 가장 중요한 것은 이들 25mer들이 전체 genome에서 유일해야 한다는 것이다. 만약 중복되어 있다면 결과를 해석할 수 없게 되기 때문이다. 이와 같은 조건 때문에 전체 genome의 염기 서열이 밝혀진 생물의 chip을 만드는 것이 가장 수월하다.
oligonucleotide chip도 cDNA microarray chip과 비슷한 과정을 거쳐 다르게 발현되는 수천개의 유전자를 동시에 검색한다. 다만 한 유전자를 대표하는 20개 25mer의 밝기 정도가 그 유전자의 발현 정도를 대표하는 것이 다르다. 이 chip을 이용하여 1:300,000의 빈도로 발현하는 유전자도 검색할 수 있다. 이 oligonucleotide chip도 cDNA microarray chip과 마찬가지로 한 환경에만 발현하는 유전자를 찾을 수 있을 뿐만 아니라 발현 정도까지도 알 수 있다. 또한 Affymetrix oligonucleotide chip은 하나의 염기 서열만 틀려도 결합을 하지 않는 성질을 이용하여 한 염기에 생긴 돌연 변이(point mutation)까지도 찾아 낼 수 있다. 많은 암이나 유전병들이 특정 유전자에 생긴 작은 돌연 변이에 의해서 유발되기 때문에, 이것을 이용하여 지금까지 밝혀진 암 관련 유전자를 가진 DNA을 만든다면 한번의 실험으로 아주 쉽게 돌연 변이를 찾을 수 있다. 지금 Affymetrix사에서는 앞에서 설명한 유전자 발현 검색용 chip 뿐만 아니라 암 관련 유전자인 p53와 BRCA1을 가진 chip, AIDS의 원인인 HIV의 종류도 알 수 있는 chip, 그리고 SNP(single nucleotide polymorphism)측정용 chip 등을 생산해 내고 있다.

§Electronic array DNA chip

DNA가 음전하를 띠는 성질을 이용하여 chip의 표면에 있는 특정 위치에 양전하를 넣어서 그 위치를에 원하는 유전자를 붙게 만드는 방법이다. 이와 같은 원리를 이용한 chio이 미국의 Nanogen에서 개발 되었고 지금은 10,000개의 유전자를 이러한 방법으로 붙일 수 있는 chip이 개발되어 있다. 이 기술의 장점은 이와 같은 electronic addressing 뿐만 아니라 전기를 이용하여 target DNA를 원하는 특정 위치에 끌어드림으로서 결합 시간을 단축시킬 수 있다. 아직까지 이 DNA chip의 검색은 형광 물질을 이용하고 있지만 Clinical Micro Sensors라는 회사에서는 아주 획기적으로 검색과정도 전기 신호로서 측정하는 기술을 개발하였다. 그럼으로써 고가의 scanner 대신 손으로 들고 다닐 수 있는 저가의 측정 장비를 사용하게 만들었다. 이러한 DNA chip은 앞으로 더욱더 폭 넓게 여러 가지 영역에서 쓰여지리라 예상된다.

§ DNA chip의 활용 분야.

유전자 발현을 검색하는 데에는 cDNA chip 이나 oligonucleotide chip이 기존의 방법들보다도 훨씬 뛰어나다. 일단은 많은 수의 유전자를 한번에 검색한다는 데에 그 의미가 있는 것이다. 앞에서 밝힌 것과 같이 oligonucleotide chip은 또한 돌연변이 검색에도 사용될 수 있다. 그럼으로써 이 두가지이 DNA chip들은 돌연변이 검색, 병의 진단 또는 유전자 발현 청사진을 만드는데 많은 기여를 할 수 있을 것이다. 기능을 아래와 같이 요약 해 보았다