인삼의 구증구포에 의한 Ginsenoside의 성분변화 및

동의생리병리학회지 제 22권 6호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6):1557∼1561, 2008 - 1557 - 인삼의 구증구포에 의한 Ginsenoside의 성분변화 및 BACE-1 억제효과 김도완․김유진․이연진․민진우․김세영․양덕춘* 경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행 Conversion of Ginsenosides by 9 Repetitive Steamings and Dryings Process of Korean Ginseng Root and Its Inhibition of BACE-1 Activity Do Wan Kim, Yu Jin Kim, Yun Jin Lee, Jin Woo Min, Se Young Kim, Deok Chun Yang* Korean Ginseng Center for Most Valuable Products & Ginseng Genetic Resource Bank, Kyung Hee University Red ginseng possibly has new ingredients converted during steaming and dry process from fresh ginseng. Kujeungkupo method which means 9 repetitive steamings and dryings process was used for the production of red ginseng from 6-year old ginseng roots. Saponin was extracted from each red ginseng produced at the 1st, 3rd, 5th, 7th, and 9th during the steaming and drying treatment, and we analyzed saponin content with TLC. Minor saponins, such as ginsenoside-Rg3, -Rh2, compound K, and F2, increased as the process time of steaming and drying, but major saponins (ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1) were decreased. Major saponins were yet observed almost at the 1st process, then degraded as the increasing time of steaming and drying process. Especially, ginsenoside-Re and -Rg were observed as considerable amount after the 1st treatment, but there were no trace of them after the 9th treatment. Ginsenoside-Rg1, -Rb2, and -Rb1 were also reduced remarkedly by 96.6%, 96%, and 92.3%, respectively. Minor saponins were increased significantly, especially for ginsenoside-Rg3 and ginsenoside-F2. These results suggest that Kujeungkupo method is the very useful method for the production of minor ginsenoside-Rg3 and -Rh2. 󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏 Key words : korean ginseng, Kujeungkupo, steaming and drying, minor saponin, ginsenoside-Rg3 * 교신저자 : 양덕춘, 경기도 용인시 기흥구 서천동 경희대학교 생명과학대학 ․E-mail : <A href="mailto:dcyang@khu.ac.kr">dcyang@khu.ac.kr</A>, ․Tel : 031-201-2688 ․접수 : 2008/09/24 ․수정 : 2008/10/26 ․채택 : 2008/11/24 서 론 인삼의 뿌리에는 전분을 비롯한 탄수화물이 60-70% 함유되 어 있고, 주요 약리 성분으로 알려진 사포닌(saponin)이 4-10% 정도로 다량 함유되어 있다. 사포닌 성분은 주로 식물에 광범위 하게 분포되어 있는데, 인삼에 함유되어 있는 것은 담마란 (dammarane)계 사포닌으로서 인삼(Panax)속 식물에만 특이적으 로 존재한다1). 인삼 사포닌은 최근까지 약 40 여종 정도의 구조 가 밝혀져 있으며2), 뇌기능항진 효능3), 항암활성4), 면역기능 조 절작용5), 항당뇨작용7), 간 기능 항진효능8), 혈압조절기능10), 항산 화활성 및 노화억제효과11)가 보고되었다. 홍삼은 수삼을 증숙한 후 건조하여 제조한 것으로 이러한 증숙과정에서 수삼이나 백삼 과는 다른 성분이 생성된다고 알려져 있다12). 약리학적 측면에서 인삼과 홍삼의 연구는 사포닌에 대하여 중점적으로 이루어져 ginsenoside -Rb1, -Rc, -Rd, -Rf, -Rg1, -Re 등의 주요 사포닌이 인체에 미치는 약리작용과 가열처리에 의해 변화된 성분 ginsenoside-Rg3, -Rg5, -Rh1, -Rh2, compound K (C-K), F2 등의 사포닌의 약리효능을 구명함으로서 인삼과 홍삼 은 같은 식물을 기원으로 하였지만, 전혀 다른 약리효능 및 약리 작용을 가진다고 보고 되어있다13). 현대 사회에서 치매는 더 이상 노인성 질병이 아닌 것으로 알려졌다. 최근에는 젊은 사람들에게도 노인성 치매가 유발되고 있으며 또한 노령화, 고령화 사회가 지속되면서 오래도록 건강한 삶을 영의하기 위한 자기개발, 건강 등에 많은 시간과 경제력을 투자 하는 것으로 보여진다. 베타아밀로이드 단백질(Aβ)이 알츠 하이머발병의 주요 원인물질인 것으로 구명되면서 Aβ생성에 가 장 중요한 작용을 하는 효소인 ϐ-secretase(BACE-1) 작용을 저해 김도완․김유진․이연진․민진우․김세영․양덕춘 - 1558 - 하는 물질을 개발하려는 연구가 많이 이루어지고 있다14). BACE-1 효소는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는 노인반 (senile plaques)을 구성하는 Aβ단백질의 생성을 유도하는 효소 로서 1999년 처음으로 그 구조가 동정되었다15). 구증구포방법은 생지황을 아홉 번 찌고 아홉 번 건조하여 만든 숙지황이 가장 대표적이며 증포처리가 증가함에 따라서 악 성빈혈 치료효능이 증가한다고 하였는데, 4번 증포한 숙지황 보 다 8번 이상 증포한 숙지황에서 효과가 높았다고 하였다16). 최근 이러한 구증구포방법으로 인삼을 가공처리하여 홍삼을 제조하고 이를 새로운 명칭을 사용하여 판매되고 있으며, 아직 정확한 과 학적 근거자료가 없음에도 불구하고 그 약리효능이 매우 뛰어난 것처럼 묘사되고 있어 이에 대한 연구가 요구되고 있다. 따라서 본 연구는 일반 홍삼을 제조하는데 사용되는 방법을 9회 반복하여 증포의 처리횟수에 따른 ginsenoside의 변환 및 BACE-1 활성억제 효과을 조사하고자 수행하였다. 재료 및 방법 1. 공시재료 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 경희대 인삼유전자원소 재은행에서 분양받았으며 경기도 재배포장에서 채굴된 6년근 인 삼을 사용하였다. 각 인삼 시료는 6뿌리씩 5개 그룹으로 분류하 였으며, 각각의 그룹은 무게차이가 ±10%를 초과하지 않도록 부 피와 무게(개당 200 g±10%)가 비슷한 인삼을 선별하여 고르게 분류하였다. 2. 인삼의 구증구포처리 세척용 솔을 이용하여 표면의 흙을 흐르는 수돗물로 깨끗이 수세한 후 압력이 걸리지 않도록 97℃～99℃로 조정한 autoclave 를 이용하여 2.5시간 증숙하여 상온으로 냉각한 후 70℃의 열풍 건조기에서 24시간 건조한 후 50℃로 낮추어 약 72시간 건조하 였다. 이러한 작업은 총 9번 반복하였으며, 반복 시 홀수(1, 3, 5, 7, 9) 처리구에서 건조된 시료를 채취하여 최종 시료로서 사용하 였다. 3. 인삼 ginsenosides 추출 및 성분분석 Shibata 등1)의 조사포닌 추출방법을 응용하여 구증구포 처 리된 시료를 분쇄하여 100 mesh의 표준체(standard sieves)를 통 과한 검체 약 5 g을 측정하여 250 ml의 환류용 플라스크에 담았 다. 80% MeOH을 첨가하고 80℃의 수조에서 1시간 환류추출한 후 김등17)의 방법에 의하여 농축․건조하였다. HPLC(NS-3000i, Futecs, Korea)를 이용한 사포닌 분석은 acetonitrile(ACN)(A), water(B)을 사용하였고 column은 Supelco사의 역상 C18을 사용 하였으며, detector는 UV detector(203 nm)를 사용하였다. 표준 품은 경희대 인삼유전자원소재은행에서 분리․정제된 것을 사용 하였다. 4. 항치매(BACE-1 저해 활성 검정) BACE-1(recombinant human BACE-1) assay kit는 PanVera Co.(USA)에서 구입한 후 기질은 냉장보관하고 효소는 –70℃ 저 온냉동고에 보관하였으며, 50 mM sodium acetate buffer(pH 4.5)는 상온에 보관한 후 검정에 사용하였다. 저해 활성 측정용 ELISA는 Synergy HT TRF(Bio-Tek Co., USA)를 사용하였다. BACE-1 효소 저해 활성은 kit에서 제시한 manual을 변형한 Jeon 등18)의 방법으로 측정하였다. 10 ml buffer(50 mM sodium acetate, pH 4.5), 10 ml BACE-1 (1.0 u/ml), 10 ml substrate assay buffer에 녹인 10 ml 시료액을 잘 혼합하고 25℃ 에서 60 분간 암조건에서 반응시킨다. 시료의 최종 반응액 중 농도는 100 mg/ml로 하였다. MeOH 용매로 1000 mg/ml 1차 시료액을 만 들고, 100 mg/ml 또는 10 mg/ml의 시료액은 assay buffer(50 mM sodium acetate, pH 4.0)를 이용하여 희석하였다. 희석된 시 료액을 형광 reader는 excitation 파장을 530 nm로 하고 emission 파장을 590 nm로 하여 측정하였다18). 결 과 1. 구증구포(九蒸九曝)처리에 의한 홍삼의 사포닌 변환 구증구포 방법을 이용하여 홍삼제조시 증포의 처리횟수가 증가함에 따라서 단계적인 사포닌의 성분변화를 조사하였다. 인 삼시료를 구증구포하면서 1차, 3차, 5차, 7차, 9차 증포한 홍삼으 로부터 사포닌을 BuOH추출하고 chloroform 65, MeOH 35, DDW 10 비율의 용매로 TLC분석을 실시하였다(Fig. 1). 그 결과 증포처리 횟수가 증가함에 따라서 major 사포닌인 ginsenoside-Rb1과 -Rd가 점차 감소하는 것을 관찰할 수 있었고 이에 비하여 minor 사포닌인 ginsenoside-Rg3, -Rh2, F2 및 compound K 등이 증가하였다. Major 사포닌을 HPLC UV detector에서 C18 column으로 이용하여 1차, 3차, 5차, 7차, 9차 로 증포한 홍삼을 순서대로 HPLC분석을 실시하였다(Fig. 2). 1차 에서는 아직 많은 major 사포닌 함량이 남아있는 것을 볼 수 있 고(Fig. 2-1st-A, B), 또한 미량이지만 F2, compound K, ginsenoside-Rg3와 -Rh2 등이 약하게 검출되었다(Fig. 2-1st-C). 그러나 3차, 5차, 7차, 9차로 증포처리 회수가 증가함에 따라서 major 사포닌인 ginsenoside-Rf, -Rb1, -Rc, -Rb2, -Rd 등은 현저 하게 감소되었으나 9번 증포시까지도 일부 존재하였으며(Fig. 2B), 이에 반하여 minor 사포닌인 ginsenoside-Rg3, -Rh2, compound K, F2 등은 증포처리 회수에 따라서 그 함량이 현저 히 증가하였다(Fig. 2C). 특히, ginsenoside-Re와 -Rg1의 경우에 는 1차 증포처리 한 홍삼에서는 다량 존재하였지만, 9차 증포 이 후에는 HPLC 분석을 통해서는 그 존재를 거의 확인할 수 없었 다(Fig. 2A). 2. 구증구포처리에 의한 major와 minor ginsenoside의 변환율 증포처리 횟수에 따른 ginsenoside 농도를 mg/g 단위로 환 산하였을 비교한 결과 major 사포닌의 감소가 확연하였으며, 이 에 반하여 minor 사포닌은 증포처리 횟수가 증가함에 따라서 급 격히 증가하는 것으로 나타났다. 특히 major 사포닌인 ginsenoside-Rg1은 구증구포처리하였을 경우에 완전히 소실되어 인삼의 구증구포에 의한 Ginsenoside의 성분변화 및 BACE-1 억제효과 - 1559 - 가장 많이 변환되었으며, ginsenoside-Re도 거의 그 함량이 측정 되지 않았다. Ginsenoside-Rb2가 96%, ginsenoside-Rb1도 92.4% 각각 큰 폭으로 감소되었다(Fig. 3). 그러나 minor 사포닌은 증포 수가 증가함에 따라서 현저히 증가하였는데, 특히 ginsenoside-Rg3가 2.6 mg/g으로 가장 많이 생성되었으며, 그 다음으로 -F2가 2.18 mg/g으로 생성되었다(Fig. 4). 구증구포처 리에 의한 인삼과 홍삼의 성분을 비교해 본 결과 색상과 효소의 활성도 차이 및 주요사포닌의 함량 차이 등에서 갈색 또는 홍갈 색을 가지며 비활성화 된 효소 및 ginsenoside -Rg3, -Rh2, compound K, F2 등이 형성됨을 알 수 있다(Fig. 4). A B Fig. 1. TLC analysis of saponin conversion in red ginseng by repetitive steaming and drying process. S; standard, A : major saponins. B : minor saponins. 1 s t 3 r d 5 t h 7 t h 9 t h A B C Fig. 2. Ginsenoside conversion in red ginseng produced by repetitive steaming and drying process. A : Decrease of major saponins(Rg1, Re), B : Decrease of major saponins(Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rd), C; Increase of minor saponins(Rg3, Rh2, C-K, F2). Fig. 3. Conversion of major saponins in red ginseng by repetitive steaming and drying process. Fig. 4. Conversion of minor saponins in red ginseng produced by repetitive steaming and drying process. 3. 항치매(BACE-1 저해 활성 검정) 구증구포처리에 따른 홍삼의 BACE-1 효소 저해 활성 검정 결과 1차, 3차, 5차, 7차 증포 처리까지는 지속적인 BACE-1의 저 해 활성이 증가 하였으나 9차에서는 현저하게 감소하였다(Fig. 5). 따라서 항치매 효과 면에서 7차까지 증포하는 것이 가장 효 율적인 것으로 나타났지만 가장 높게 나타난 7차에서도 52%의 저해율을 나타내어 아주 높은 항치매 효과가 있다고 보여지지는 않는다. 0 10 20 30 40 50 60 1 s t 3 r d 5 t h 7 t h 9 t h 증 포 횟 수 Density (%) BACE-1 저해능 BACE-1 저해능 추세선 No. of steaming and drying Fig. 5. Analysis of BACE-1 enzyme blocking of red ginseng by repetitive steaming and drying process. 고 찰 홍삼을 증포에 의해 가공할 때 단계적인 변화, 즉 열에 의해 어떠한 변화를 가지고 오는지, 그리고 그 변화는 몇 번의 증포에 서 가장 좋은 약리성분을 가지는지에 대하여 연구를 수행하였다. 홍삼 제조 시 구증구포처리는 그 회수가 증가함에 따라서 최근 주요한 약리성분으로 각광을 받고 있는 ginsenoside-Rg3, -Rh2, F2, compound K 등이 다량 형성 된다는 사실을 확인하였다. 수 삼을 증포하여 홍삼제작시 major 사포닌의 감소나 minor 사포닌 의 증가를 비교하기 위해서 고 등19)은 백삼과 홍삼의 사포닌 성 분을 조사한 결과 가열처리에 의해서 major 사포닌이 분해되고 minor 사포닌 생성이 증가되는 것을 확인한 바 있다. 본 연구에 서도 ginsenoside-Rb1과 -Rd는 증포 처리 횟수가 증가할수록 현 저하게 파괴되었으나, minor 인 ginsenoside-Rg3와 F2는 눈에 띄 김도완․김유진․이연진․민진우․김세영․양덕춘 - 1560 - 게 증가하였고 ginsenoside-Rh2 및 compoun K도 TLC상에서 형 성된 것을 확인하였다. 좀 더 정확하게 HPLC를 이용하여 분석한 결과, ginsenoside-Rg1, Re 등은 1차에서 다량 존재하지만 9차 증 포 이후 100% 분해되어 HPLC 상에서 그 존재는 확인되지 않은 것을 알 수 있었다. 지속적인 증포에 의해 3차, 5차, 7차, 9차로 올 라갈수록 major 사포닌이 현저하게 감소하며 미량 사포닌이 현저 하게 증가하는 것을 보아, 구증구포의 홍삼을 제조할 경우 증포 횟수에 따라 사포닌 함량에 영향이 많다는 것을 알 수 있다. 인삼사포닌들은 가수분해, 산처리 또는 가열처리를 할 경우 구조가 변형되면서 생리적인 활성이 증가함으로서 의약품 개발 에 대한 가능성도 제시되고 있는데, 홍삼류 특유성분으로 PD계 사포닌인 ginsenoside-Rg3성분은 다양한 약리활성을 가지고 있 다고 보고되어 있으며, 특히 암세포의 정상세포 내로 침윤과 혈 관신생의 억제로 암세포의 전이를 억제하고 혈관의 평활근 확장 작용으로 혈압을 저하시키는 기능이 있다고 한다20-22). 그러나 이 들 성분은 홍삼에 극히 미량으로 들어 있기 때문에 이들의 함량 을 증대시키면 인삼의 부가가치가 증대될 것으로 판단된다. 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD)의 대표적인 병리학 적 특징인 노인반을 구성하는 주요성분은 베타아밀로이드(Aβ) 단백질로서 Aβ 생성에 가장 중요한 작용을 하는 효소인 β -secretase(BACE-1) 저해 활성을 검토한 결과, 구증구포의 단계적 인 항치매 효과는 최대 7차까지는 증가하였으나 9차에서는 큰 폭으로 감소하는 것을 확인하였다. 즉 인삼보다는 홍삼이 더 우 수한 항치매 효과가 있는 것으로 보인다. 또한 홍삼이 지속적인 증포에 의해 치매를 유발하는 BACE-1 저해 활성이 증가 한다는 것을 확인하였다. 이는 인삼의 가열에 의해 이화학적인 성분 (acidic-polysaccharide, penolic acids, 향기성분. amino acid, amino-sugar, proteins)등이 합성 또는 변화에 의해 복합 작용하 여 항치매 효과가 상승하는 것으로 판단된다. 하지만 BACE-1 저 해 활성이 가장 높게 나타난 7차에서도 평균값이 52%정도로서 아주 뛰어난 항치매 효과가 있다고 보기는 어렵다고 판단된다. 결 론 구증구포 홍삼 제조 시 증포횟수에 따라 홍삼의 주요 성분 인 사포닌의 약리성분에 대한 변환을 조사하였다. 6년근 인삼을 재료로 하여 구증구포 처리하면서 1차, 3차, 5차, 7차, 9차에 각각 증포한 홍삼으로부터 사포닌을 추출하고 TLC분석을 실시한 결 과 증포 처리회수가 증가함에 따라서 major 사포닌 (ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1)이 감소하였고 minor 사포닌(ginsenoside-Rg3, -Rh2, C-K, F2)이 증가되었다. 이 러한 사포닌 변환을 정확히 판별하기 위해서 total ginsenoside 7 종 표준물질을 사용하여 HPLC조건을 확립한 후 분석한 결과, 1 차 처리한 홍삼에서는 아직 많은 major 사포닌 함량이 존재하였 다. 그러나 증포처리 횟수가 증가함에 따라 major 사포닌이 현저 하게 감소하였으며, minor 사포닌이 현저하게 증가하였다. 특히, ginsenoside-Rg1, ginsenoside-Re의 경우에는 1차 증포 처리한 홍삼에서는 다량 존재하였지만 9차 증포 이후에는 HPLC 분석을 통해서는 그 존재를 확인할 수 없었다. 또한 major 사포닌인 ginsenoside-Rb2가 96%, ginsenoside-Rb1이 92.4% 각각 큰 폭으 로 감소되었다. 그러나 minor 사포닌은 증포회수가 증가함에 따 라서 현저히 증가하였는데, 그 중 ginsenoside-Rg3는 2.6 mg/g 으로 가장 많이 생성되었으며, 그 다음으로 -F2가 2.18 mg/g 생 성되었다. BACE-1 효소는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되 는 노인반을 구성하는 ϐ-amyloid 단백질의 생성을 유도하는 효 소로서 BACE-1 저해 활성은 1차, 3차, 5차, 7차의 증포를 처리한 홍삼에서는 저해 활성이 증가하였으나, 9차 증포 홍삼에서는 큰 폭으로 저해 활성이 감소하였다. 인삼을 홍삼으로 구증구포 가공 할 때 생성되고 감소되는 이러한 약리성분의 변화를 검토한 결 과 구증구포의 홍삼가공시 BACE-1 저해 활성 등을 위한 재료로 는 7차까지가 적합한 것으로 나타났다. 감사의 글 본 연구는 21세기 프론티어연구개발사업 자생식물이용기술 개발사업(code #PF06222-00)의 지원으로 수행된 것으로, 연구비 지원에 감사드립니다. 참고문헌 1. Shibata, S., Tanaka, T., Ando, T., Sado, M., Tsushima, S., Ohsawa, T. Chemical studies on oriental plant drugs (XIV). Protopanaxadiol a genuine sapogenin of ginseng saponin. Chem Pharm Bull. 14: 595-600, 1966. 2. 박채규, 전병선, 양재원. 고려인삼의 화학성분. 식품산업과 영 양. 8: 10-23, 2003. 3. Sato, T., Kojima, S., Toda, S., Arich, S. Effects of ginseng saponin on experimental gastric ulcer (1). Yakuyouyakuriz zasshi. 20: 715-722, 1980. 4. Kumar, A. Chemopreventive action of ginseng on DMBA-induced papilloma genesis in the skin of mice. Proc 6th Int'l Ginseng Symp Korea Ginseng Tobacco Research Institute. pp 66-73, 1980. 5. 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