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서 형 주 고려대학교 식품영양학과
82 2013년 기초연구과제총서
Fig. 1. Opuntia humifusa
천년초(Opuntia humifusa )는 충남 아산지역에서 대량 재배되는 선인장으로서, 제주도의 백년
초가 길고 굵은 가시가 많고 1-2 m까지 자라는 반면, 솜털 가시를 가지며 약 30 cm로 자란다.
여름에는 물을 가까이 하여 성장 번식하고, 휴면기인 겨울에는 비닐하우스가 없는 노지에서도 생
존하며, 병충해에 강한 특징을 지니고 있다. 반면, 제주도에서 재배되는 백년초(Opuntia
ficus-indica var saboten )은 선인장 과에 속하는 다년초로서 열대지방이 원산지로, 우리나라에
서는 연평균기온이 높은 제주도에서 군락을 형성하면서 자생하고 있는 귀화식물이다.
손바닥 선인장(천년초) 의 성분분석 결과, 일반성분으로는 수분 9.30%, 조지방 1.35%, 조단백
4.24%, 회분 12.12%, 조섬유 3.79%, 가용성 무질소물 69.20%가 함유되어 있으며, 선인장의 주
성분은 당류 같은 가용성 무질소물이다. 가용성 무질소물이란 섬유를 제외한 전분, 당분, 고무질,
점질물, 펙틴, 색소류를 총칭한다 (이영철, 김홍만, 김영언, 황금희 & 안채경, 1997). 한방에서는
신경성통증 치료와 건위ㆍ자양강장제, 소염·해독제, 급성 유선염 및 이질 치료제 등으로 이용되
고 있다.
Park et al (Park, Lee & Kang, 2005)은 열수에 의한 천년초 줄기 추출물의 항산화 활성 및 사
염화탄소로부터 간손상 예방 효과를 보고 하였고, Lee et al(2004)은 천년초 선인장 추출물의 항산
화 효과 연구에서 천년초의 ethyl acetate 분획물이 α-tocopherol과 비슷한 항산화 활성을 나타낸
다고 보고하였으며, 병원성 식중독 미생물에 대해 천년초 선인장 추출물의 항균 효과가 우수하다고
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 83
하였다. 천년초는 또한 cosmeticeutical한 활성을 포함한 다양한 생리활성이 있으며, 천년초의
cosmeticeutical한 활성에는 anti-oxidant, anti-aging, anti-photoaging등이 있다.
인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학적 반응 과정에서 발
생하는 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 superoxide dismutase, catalase 그리
고 glutathione peroxidase과 같은 enzyme등을 이용하여 자기 방어 기구인 생체 내 제거 기작
에 의해 대부분 소멸되지만, 이러한 ROS가 정상적으로 소거되지 않았을 때, 유리기로 인한 산화
적 스트레스가 생체 내에 가해지면 이들 ROS는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA, 효소
및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 뇌졸중, 파킨슨씨병 등의 뇌질환과 심장질환, 허혈,
동맥경화 등과 같은 성인병과 암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되고 있다(Maxwell, 1995).
Vitamin C, vitamin E, selenium, β-carotene, lycopene, lutein 그리고 다른 carotenoids는
항산화제로서 사용되며, polyphenol, flavonoids 그리고 terpenoids와 같은 식물의 이차대사산물
또한 ROS로부터 보호하는 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Cai, Luo, Sun & Corke, 2004).
Fig. 2. ROS generation
피부는 표피와 진피라고 하는 2 개의 조직 층으로 구성되며 피부표피의 기저 층에는
keratinocytes, melanocytes 그리고 Langerhans 등이 분포되어 있는데, 멜라닌은 melanocystes의
melanosome에서 합성되어 수상돌기를 통하여 표피의 각질화 세포로 이동되어 피부의 색을 나타
내며 이것이 과도하면 색소침착을 유발하게 되어 기미와 주근깨를 형성하고 피부노화를 촉진하게
된다(Chen, Wei & Marshall, 1991). 세포 내 색소침착은 melanogenesis의 각각의 다른 단계에
84 2013년 기초연구과제총서
서 제어가 가능하며, 특히 tyrosinase 억제제와 항산화제는 효소적 및 비효소적 산화반응에 의한
멜라닌 생성과 같은 세포 내 색소침착을 저해하기 위해 사용된다. Arbutin, hydroquinonone,
kojic acid, licorice 추출물 아니면 vitamin C와 같은 물질들은 화장품에 첨가되어 피부톤을 밝
게 하고 hyperpigmented abnormalities를 개선하기 위해서 의약품에 첨가되기도 하는데, 이들의
원리는 대개 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase의 활성을 저해하여 멜라닌생성을 억제하는 것이
다 (Rendon, Berneburg, Arellano & Picardo, 2006).
한편, 피부노화 현상은 여러 가지 구조적, 기능적 변화를 보이는데 내외적인 여러 가지 스트레
스는 피부의 탄력성과 윤택성을 감소시키고, 기미, 주근깨 등 피부 색소를 침착 시키며, 주름이
생기게 하는 등 피부노화 현상을 촉진한다(Voegeli, Meier, Doppler, Strzebecher & Girard,
1996). 피부의 진피 조직 속에는 collagen과 피부의 탄력성에 관련된 elastin이 그물망 구조를 형
성하고 있는데, 이러한 elastin이 elastase에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인
성 피부 노화가 발생한다. Elastase는 피부 탄력성에 관련된 elastin을 분해시켜 collagen과 이루
어진 피부의 진피 조직의 그물망 구조 결합을 끊어 줌으로써 주름 생성의 주원인 효소로 알려져
있다. 그러므로, 피부 노화의 주원인중의 하나인 elastase의 활성을 저하시킴으로써 피부 노화를
억제할 수 있다.
Fig. 3. 피부세포의 구성 Fig. 4. 피부노화의 진행
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 85
단순히 죽은 세포들과 신체의 노폐물만으로 쌓여 있다고 생각되었던 피부각질층은 점차 다양한
성분 및 기능이 있음이 밝혀지고 있으며, 외부환경으로부터의 물리화학적 자극 및 미생물 등으로
부터 생체를 보호하며 체액, 수분의 증발 등을 적절히 조절함으로써 생체의 항상성을 유지시켜 주
고 있다. 그 중 피부를 탄력 있고 부드럽게 해주는 역할을 하는 물질은 주로 각질층에 존재하는
수분에 의해 좌우된다.
피부의 세포외 기질은 피부노화에 따라서 다양한 특징적인 변화가 나타난다. 그 중
glycosaminoglycan(GAGs)와 Hyaluronic acid (HA) 가 중요한 역할을 한다. HA는 glucuronic
acid 와 N-acetyl-glucosamine 이 교대로 배열된 구성단위를 함유하는 물질이다. HA는 포유동
물의 피부, 대동맥, 관절액과 같은 결합 조직의 세포 사이에 널리, 많이 분포되어 있고 나이가 들
면서 점차 감소한다. HA에는 구조적으로 수산기 (-OH)가 많아 친수성이고, 진피 층 내에서 콜라
겐 섬유와 뮤코다당류가 결합된 상태로 수분을 다량 함유한 기질을 형성하는 보습 인자이다. HA
는 자신의 무게의 100~1000배의 수분을 흡수할 수 있을 정도로 보습력이 뛰어난 성분이다(Hsu
& Chiang, 2009).
Fig. 5. Hyaluronic acid
HAS (hyaluronic acid synthase) 는 세포막에 존재하여 glucuronic acid 와 N-acetyl-glucosamine
구성단위들을 교대로 배열하여 β-1,3 결합을 할 수 있도록 매개하여 HA를 합성하는 역할을 하는
효소이다. HAS-1과 HAS-2는 2~4×106 Da 크기의 HA를 생성하고 HAS-3는 0.4~2.5×105 Da
크기의 HA를 형성한다고 알려져 있다. HYAL (hyaluronidase)는 HA의 글리코시드 결합을 가수
분해하는 역할을 하여 HA를 분해하는 효소이다. HAS가 활성화 되면 진피층 내의 보습인자인
HA의 함량이 늘어나 피부 보습력이 증가되므로, 보습 효과 검증에 중요한 효소라고 할 수 있다
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(Averbeck et al., 2006). 또한 CD44는 세포 접착기능이 있는 I형 막관통단백질의 일종이다. 세
포외 영역의 N말단에는 연결단백질과 상동성이 있는 영역이 존재하여 히알론산에 결합한다. 이
영역은 조혈계 세포과립에 존재하는 프로테오글리칸의 하나이며 세르글리신에도 결합한다. 선택적
이어 맞추기에 의해 여러 가지 동형을 형성하며 85~90 kDa의 표준형 CD44(혈액세포에 발현),
200 kDa의 상피형 CD44(상피세포에 발현), 다양한 분자크기를 나타내는 변이형CD44(암세포에
발현) 등이 있다.
다양한 생리활성을 지닌 것으로 알려진 손바닥선인장에 대한 가공식품의 개발 및 연구는 국내에
서 미약한 실정이다. 특히 귀화식물인 백년초에 비해 자생식물인 천년초에 대한 연구는 전무하다.
본 연구팀은 천년초를 이용한 다양한 제품을 개발하기 위하여 선행 연구를 통해 손바닥 선인장에
효소처리를 하여 천년초의 주성분인 펙틴에 의한 점성을 낮추는 결과를 도출해내었다. 이에 본 연
구는 선행연구 결과 선정된 효소를 처리하여 천년초의 미백, 주름개선, 보습 화장품 소재로서의
가능성을 확인하며, 기능성 화장품의 소재화에 있어 가장 중요한 부분인 피부 안전성을 측정하여
효소 처리하여 점도를 낮춘 천년초의 기능성 화장품 소재화를 알아보았으며, 보습 화장품 소재로
서의 가능성을 hairless mouse을 이용한 동물실험을 통하여 확인하며, 기능성 화장품과 미용음료
로의 소재화 가능성을 알아보고자 한다.
2. 연구방법
2.1. 천년초의 항산화 실험
Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) : 천년초의 DPPH 라디칼 소거능 측정은 Quang의 방법
을 이용하였다(Quang, Hashimoto, Nukada, Yamamoto, Tanaka & Asakawa, 2003). Ethanol
에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 0.4 mL와 시료 0.1 mL을 암소에서 10 분간 반응시킨 후 520
nm에서 흡광도(INFINITE M200 Nanoquant,TECAN)를 측정하였다. 천년초의 항산화력은 라디칼
소거능의 중간 활성을 나타내는 농도를 표시하는 IC50 (half maximal inhibitory concentration)으
로 표시하였다. 즉, DPPH 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.
Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) 라디칼 소거능 측정 : 천년초의 ABTS
라디칼 소거능 측정은 Wang와 Almajano의 방법을 이용하였다(Almajano, Carbo, Delgado &
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 87
Gordon, 2007). 7 mM ABTS에 2.45 mM potassium persulfate을 첨가하여 암소에서 실온으
로 12-16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4~1.5가 되도록 증류수로 희석시켰다. 천년초
12.5 L에 희석된 ABTS 라디칼 용액 250 L을 넣어 암소에서 60분간 반응시키고 414 nm에서
흡광도를 측정하였다. IC50 (half maximal inhibitory concentration)으로 표시하였다. 즉,
ABTS 라디칼의 흡광도를 50% 줄여주는 값의 농도를 말한다.
Ferric reducing antioxidant power (FRAP): Total antioxidant power 를 측정하는 방법으
로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridytriazine 복합체가 ferrous tripyridytriazine로
환원되는 것을 이용하여 측정된다. 천년초 6 L 와 FRAP reagent 180 L 를 실온에서 5 분간 방
치시킨 후 593 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
2.2. 천년초의 피부보호 효과 실험
Tyrosinase 억제 실험 : 천년초의 tyrosinase 억제 실험은 Mason & Peterson의 방법을 이용
하여 96-well plate에 시행하였다(Mason & Peterson, 1965). 버섯 유래의 tyrosinase은 167
units/mL이 되도록 phosphate buffer를 이용하여 희석하였으며 천년초를 증류수(D.W)에 다양한
농도가 되도록 희석한 후 37℃에서 5분간 pre-incubation시켰다. 100 μL의 tyrosinase 와 천
년초 20 L 그리고 3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine (L-DOPA) 100 L을 37℃에서 30분간
반응시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
% inhibition = [(A-B)-(C-D)]/(A -B)x100
A: OD at 492 nm with tyrosinase but without test substance;
B: OD at 492 nm without test substance and tyrosinase;
C: OD at 492 nm with test substance and tyrosinase;
D: OD at 492 nm with/ test substance but without tyrosinase.
88 2013년 기초연구과제총서
Elastase 억제 실험 : 천년초의 elastase 억제 실험은 James의 방법을 이용하여 측정하였다(Kraunsoe,
Claridge & Lowe, 1996). 25℃에서 20 분간 기질인 N-succinyl-(Ala)3-p-nitoroanilide이
p-nitroaniline로 되는 것을 억제하는 정도를 알아보는 실험이다. 1 g의 porcine pancreatic
elastase type IV (PPE) 을 1 mL의 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0)에 녹인다. 0.2 M
Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM N -succinyl-(Ala)3-p -nitoroanilide 그리
고 천년초를 섞어주고 기질을 가하여 반응시켜준 후, 410 nm에서 흡광도를 측정하여 나타낸다.
% inhibition = [(A-B)-(C-D)]/(A -B)x100
A: OD at 410 nm with elastase but without test substance;
B: OD at 410 nm without test substance and elastase;
C: OD at 410 nm with test substance and elastase;
D: OD at 410 nm with/ test substance but without elastase.
2.3. HaCaT cell을 이용한 천년초의 보습 효과 실험
Cell culture: Cell은 Human keratinocyte 인 HaCaT Cell line을 사용하였다. 배지는
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) High Glucose (WelGENE, Cat. LM 001-05)
배지에 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (WelGENE, Cat. S 001-07), 3% penicillin
(WelGENE, Cat. LS 202-02) 을 혼합한 후 filtering 하여 사용하였다. 37℃에서 5% CO2와
95% humidity 조건을 항상 유지하도록 하여 100 mm dish에서 배양했으며 70-80%의 confluency
에 도달하면 trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)을 사용하여 1:6-1:10의 비율
로 subculture를 하였다.
UVA 조사 및 시료의 처리: UVB 조사와 시료를 처리 하기 전날 HaCaT Cell을 1.5 x
105Cells/mL의 농도로 100 mm dish 또는 원하는 plate에 배양하였다. 다음 날 시료를 처리하
기 전 phenol red DMEM media를 phenol red free DMEM High Glucose (WelGENE, Cat.
LM 001-10)으로 바꿔주었다. 시료 처리 전 바꾸어 주는 phenol red free DMEM의 경우에는
세포가 최소한의 생체활동만 유지할 수 있도록 FBS를 1%로 처리하였다. 각 농도의 시료를 처리
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 89
한 후 세포가 시료를 충분히 흡수할 수 있도록 30 분 정도 incubator에서 방치하였다. 그 후
Dish cover를 씌운 채로 105 μW 의 세기로 5 분간, 200 mJ/cm2으로 UVA를 조사하였다. 대조
구의 경우에는 UVA를 조사시키지 않았다.
Cell viability의 측정: Cell viability는 MTT staining method(Soo Lee, Jin, Beak, Lee &
Kim, 2003)를 사용하여 측정하였다. 각 농도의 시료를 처리하고 각 well당 240 μL씩 MTT시약
을 분주하였다. CO2incubator내에서 3~4 시간 반응시킨 후 20% SDS 을 240 μL씩 분주한다.
Plate를 다시 CO2incubator에 넣고 다음날까지 배양한다. 그 다음날 540 nm으로 microplate
reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
PCR: HAS (Hyaluronic acid Synthase)와 HYAL (Hyaluronidase) 생성을 측정하기 위해 중
합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하였다. PCR 기술으로 HAS 2-1 (HA synthase, product
length=125), HAS 2-2 (HA synthase, product length=409), HAS 3 (HA synthase,
product length=100), HYAL 3 (Hyaluronidase, product length=518)를 증폭시켜 band를 확
인하였다. 이와 관련된 유전자와 primer sequence는 Table 1에 나타내었다. 시료와 UVB를 처
리한 cell로 부터 RNA는 TRIzol LS reagents (Invitrogen, Calsbad, CA, USA)를 사용하여 분
리하였고, cDNA 합성은 RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Life
Sciences)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 시행하였다. RT-PCR 산물은 1% agarose gel에서
전기영동 하여 확인하였다.
Table 1. Genes and oligonucleotide sequences for PCR
Gene
name
Oligonucleotide sequence
Product size
(bp)
Temperature
HAS 2-1
F: GGGGGAGATGTCCAGATTTT
R: ATGCACTGAACACACCCAAA
125 56.3℃
HAS 2-2
F: TTCTTTATGTGACTCATCTGTCTCACCGG
R: ATTGTTGGCTACCAGTTTATCCAAACG
409 67.9℃
HAS 3
F: TATACCGCGCGCTCCAA
R: GCCACTCCCGGAAGTAAGACT
100 56.3℃
HYAL 3
F: CTCCATGGGCTTAGTGAGGT
R: GTGATCAATGTGACCAGGG
518 56.3℃
β-actin
F: GCTCCTCCTGAGCGCAAG
R: CATCTGCTGGAAGGTGGACA
75 56.3℃
90 2013년 기초연구과제총서
2.4. Hairless mouse 를 이용한 천년초의 보습 효과 실험
시험에 사용한 동물은 건강한 Male SKH-1 hairless mice 5 주령을 ㈜ 중앙실험동물 (Seoul,
Korea)에서 구입하였다. 1 주일 간 사육실에 동물이 적응할 수 있도록 적응기를 갖고 6 주령의
mice를 가지고 실험하였다. 사육실의 사육조건은 온도 23 ± 3℃, 습도 50 ± 10%, 환기회수
15 회/시간, 조도 150∼300 Lux, 명암주기 12 시간 (08:00-20:00)으로 자동 유지되도록 하였
다. Hairless mouse 는 mouse 전용 사육 케이지에서 사육 케이지 당 5 마리씩 사육하였다. 전
시험기간 동안 사료와 음수는 자유롭게 급식시켰다. 본 실험은 고려대학교 동물실험윤리위원회 승
인을 받은 후 (승인번호 KUIACUC-20120926-1) ‘실험동물 관리 및 이용에 관한 지침 (Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC)’에 맞추어 관리하면서 실시하였다.
실험 재료: 천년초 농축액은 천년초 표면의 가시를 제거하고 수세시킨 후, 5 배량의 증류수를
첨가하여 마쇄한 뒤, 마쇄한 천년초의 pH는 4.0-5.0으로 조절하였다. 기질의 0.5%에 해당하는
enzyme (Rapidase TF: Viscozyme L = 1: 3)을 첨가하여 40℃에서 12시간 동안 효소 반응을
시킨 후, 15분간 가열처리 하여 효소를 실활 시켰다. 그리고 즉시 Autoclave (SS-325, Tome
Seiko Co., Tokyo, Japan)에 넣어 121 oC 에서 15분 동안 처리를 하였다. 반응이 끝난 천년초
는 원심분리 (10,000 rpm, 30 min, 40℃)하여 상징액을 17 brix로 감압 농축한 것을 동결 건조
하여 화장품에 사용하였다.
본 연구에 사용된 화장품의 조성은 모두 에센스 타입이며 구성은 Table 2과 같다. 화장품 조성
물의 기본이 되는 베이스 화장품(base formulation, Vehicle)은 증류수에 글리세린 (3.50%), 알
코올(3.00%), carbomer 용액(0.20%), 알란토인(0.10%), 메틸파라벤 (0.12%), 등이 첨가되어 있
고, 이 베이스 화장품에 천년초 추출물을 10%, 5%로 첨가하여 천년초 화장품을 만들었다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 91
Table 2. Composition of cosmetic formulation for moisturizing test in hairless mouse
Cosmetic formulation
Composition (%)
Cheonnyouncho Base
Deioized water 84.44/89.44 90.24
Hydroxyethylcellulose 0.09 0.09
Carbomer 0.2 0.2
Glycerin 0.5 3.5
Butylene glycol 2
Cheonnyuncho(Opuntia humifusa) 10/5
Niacinamide 0.1 0.1
Allantoin 0.1 0.1
Panthenol 0.2 0.2
Ethanol 3 3
Triethanolamine 0.2 0.2
Methylparaben 0.12 0.12
PEG-60 Hydrogenated Caster oil 0.25 0.25
Polyacrylate-13/Polyisobuten/polysorbate-20 0.8 0
Total 100 100
UVB 조사: UVB lamp (280-320nm, Sankyo Denki) 2 개를 검은 아크릴 cage (90 × 25
× 50 cm) 에 설치한 후 실험을 진행함에 따라 점차적으로 조사량을 늘려서 실험하였다. 총 10
주의 실험 기간 동안 한 주에 월, 수, 금 총 3회 UVB 조사를 시행하였다. 맨 첫 주의 조사량인
30 mJ/cm2으로 시작하여, 54, 72, 108, 122, 144 mJ/cm2 의 조사량까지 점차적으로 조사량을
늘려 10주 동안 총 2212 mJ/cm2을 hairless mouse 의 등에 조사하였다.
천년초 추출물의 처치: 천년초의 처치 역시 UVB의 조사와 마찬가지로 총 10 주의 실험 기간
동안 한 주에 월, 수, 금 총 3 회 처치하였다. 천년초 추출물의 적용방법은 먹기와, 바르기, 먹고
동시에 바르기로 서로 다른 방법으로 적용하였다. 적용량을 High dosage와 Low dosage로 나누
어 각군당 5마리씩 총 8군의 천년초 추출물의 처치군을 두었다. 먹는군의 적용량은 0.5%로, low
dosage의 경우 0.1% 로 처치하였다. 먹기의 경우 천년초 농축액을 증류수에 섞어 자유 식이로
92 2013년 기초연구과제총서
하여 주었다. 바르기 군의 경우에는 바르기와 먹고 바르기 high dosage는 천년초 화장품을 0.4
mg/cm2으로, low dosage 의 경우 0.2 mg/cm2으로 처치하였다. 처치 부위는 등 부위 5 cm ×
5 cm 부위에 처치하였다. 처치는 UVB 조사가 끝난 직후 시행하였다.
피부의 육안 관찰 및 피부 주형의 분석: 주름 개선 효과의 판정을 위해 10 주 동안 주름 선을
유발 한 다음 피부를 육안으로 관찰 하였다. 군 별로 mouse의 등 쪽을 디지털 카메라를 이용하여
촬영하고, Digital Microscope 카메라(Dino-Lite, ANMO Electronics Corporation)를 사용하여
촬영하였다. 또한 mouse를 희생시킨 후 Replica (Visioline VL650, Epigem, Korea)를 이용하
여 피부주형을 채취하여 육안으로 관찰하였다.
천년초의 피부장벽 보호능력 측정: 피부장벽의 보호능력을 판정하기 위해 피부의 수분보유량,
경피 수분 손실량, 멜라닌 수치, 홍반, 피부 산성도 수치를 측정하였다. 피부의 수분 보유량의 경
우 Corneometer CM825 (Courage and Khazaka, Electronic GmbH, Germany)를 사용하여
측정하였다. 피부의 경피 수분 손실량의 경우 Tewameter TM 300 (Courage and Khazaka,
Electronic GmbH, Germany)으로, 멜라닌과 홍반 수치를 Mexameter MX 18 (Courage and
Khazaka, Electronic GmbH, Germany), 피부 산성도 수치는 Skin-pHmeter PH905(Courage
and Khazaka, Electronic GmbH, Germany)을 사용하여 측정하였다. 이 모든 기기는 MPA 5
(Courage and Khazaka, Electronic GmbH, Germany) adapter에 연결하여 측정하였다.
Real-time PCR: HASs, HYALs, CD44의 생성량을 측정하기 위해 실시간 정량 PCR 증폭기
법 (Real-time quantitative PCR)을 사용하였다. 피부의 mRNA는 TRIzol reagents
(Invitrogen,USA)를 넣고 Tissue LyserⅡ (QIAGEN, Germany)를 이용하여 분쇄시킨 후 이를
QIAshredder(QIAGEN, Germany)를 이용하여 homogenize 시켜 분리하였다. cDNA 합성은
SuperScript?Ⅲ First Strand Synthesis System (Invitrogen, USA)를 이용하여 제조사의 지침
에 따라 시행하였다.
Real-time PCR에서 사용한 HAS-2, HYAL-1,2 는 TaqMan 방식을 이용하여 실험을 진행하
였다. 프라이머와 TaqMan 탐침은 관찰하고자 하는 인자의 염기서열 내에서 real-time PCR 제
조사의 프로그램 (Primer Express program; Applied Biosytems, Foster, USA)으로 설계하여
Applied Biosystems에서 제작하였으며, HAS-1의 경우 Syber green 방식으로 제작하여 사용하
였다. Housekeeping gene으로는 GAPDH을 사용하였다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 93
실시간 정량 역전사 중합효소 연쇄 반응은 TaqMan Master Mix (Applied Biosystems, USA)
와 primer와 cDNA 를 섞어서 만들었으며, HAS-1의 경우에는 Cyber green master mix를 이
용하여 prime, probe를 섞어서 사용하였다. 이것을 96-well optical reaction plate (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA)에 넣었다. 사용한 thermal cycler parameters는 첫번째
단계로 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 그리고 두 번째 단계로 denaturation을 위해 95℃에서
15초, annealing과 extension을 위해 60℃에서 1분, 이 과정을 50 cycles 반복하였다. 실시간
정량 중합효소 연쇄 반응의 결과는 ABI PRISM Sequence Detection System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하였다.
Table 3. Genes of interests and the interrogated sequences for Real time PCR
gene RefSeq Amplication Length
CD44 NM_001039150.1 83
HAS-2 NM_008216.3 99
HYAL-1 NM_008317.4 104
HYAL-2 NM_010489.2 126
조직병리학적 관찰: Hairless mouse를 과 마취시켜 희생시킨 후 등 쪽 피부를 해부하였다. 피
부 조직을 포름 알데하이드 용액에 넣어 고정한 뒤 다음날 새로운 포름알데하이드 용액으로 교환
하여 충분히 고정시킨 후 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매, 박절하였다.
그 후 피부 조직을 hematoxylin&eosin (H&E) 와 Immunohistochemistry (IHC)을 하여 조
직을 관찰하였다. IHC는 deparaffin 시킨 후 hydration 시켜주고 retinal 과정을 거친 후 조직
내 내인성 과산화 효소의 작용을 억제하기 위하여 과산화 수소에서 5분간 처리하고 배경의 반응을
방지하기 위하여 Protein block과정을 10분간 거쳤다. 이후, Primary antibody 한 시간,
Secondary antibody 30 분간 처리하고 DAB (3,3 diminobenzidine tetrahydrochloride) 용액
에 담근 후 발색시킨 다음 Mayer’s hematoxylin으로 대조 염색하고 봉입하였으며, 각 단계는
Tris-tween 20 buffer로 3번씩 헹구어 주었다. Antibody는 다음과 같은 조건으로 분석하였으며
Secondary antibody는 Dako envision kit (Dakocytomation Ltd.Denmark)를 사용하였다.
94 2013년 기초연구과제총서
Table 4. Antibody information.
Antibody 제조사 Retrieval Host 희석배수 DAB
HABP
Thermo
(USA)
EDTA
Rabbit 1:50 2min
pH 9.0
CD44
Thermo
(USA)
EDTA
Rabbit 1:100 2min
pH 9.0
ELISA 기법을 이용한 Hyaluronic acid 함량 측정: 피부의 Hyaluronic acid함량을 측정하기
위해서 Quantikine? ELISA Hyaluronic acid (R&D Systems, USA) 을 사용하였다. 피부는
protein lysis buffer을 넣고 Tissue LyserⅡ (QIAGEN, Germany) 로 30 Hz로 5분간 분쇄를
2회 반복한 후 1000배 희석 하여 사용하였다. ELISA microplate에 RD1-14용액을 50 uL넣은
후, sample과 standard 용액 50 μL 넣은 후 실온에서 두 시간 동안 반응시켰다. Washing
buffer로 4회 세척해 주었다. 그 다음, 100 μL Hyaluronic acid conjugate 용액을 넣어주고 2
시간 반응시킨 후 다시 washing buffer로 4회 세척해 주었다. 이후 기질 용액 100 μL 넣고 실
온의 암실에서 30분간 반응시킨 후 stop solution 100 μL 을 넣고 20분 이후에 410, 540, 570
nm에서 흡광도를 측정하였다. Kit에 있는 표준물질로 표준곡선을 결정하고, 표준곡선에 근거하여
각 피부 내의 Hyalruronan함량을 측정하였으며, 이 후 BCA kit (Thermo, USA)로 단백질 함량
을 측정하여 보정하였다.
2.5. 피부안전성 실험
실험동물의 사육 조건: 본 시험에 사용한 동물은 건강한 수컷 Hartley guinea pig (350 -
420 g)을 (주) 대한바이오링크 (Eumseong, Korea)에서 구입하였다. 사육실의 사육조건은 온도
23±3℃, 습도 50 ± 10%, 환기회수 15 회/시간, 조도 150∼300 Lux, 명암주기 12 시간
(08:00-20:00)으로 자동 유지되도록 하였다. 전 시험기간 동안 기니픽 사료 (Purina Korea
Co.)와 음수는 자유롭게 급식시켰으며, 기니픽은 스테인레스 스틸 사육케이지 (26×42×18 cm)
에서 사육상자 당 1마리씩 개별 사육하였다 (Fig.11). 본 실험은 고려대학교 동물실험윤리위원회
승인을 받은 후 (승인번호 KUACUC-2010 -106) ‘실험동물 관리 및 이용에 관한 지침 (Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC)’에 맞추어 관리하면서 실시하였다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 95
1차 피부 자극시험 (primary skin irritation test): 1차 피부자극 실험은 Draize 방법(Draize,
Woodard & Calvery, 1944)으로 실시하였으며, 시료의 농도는 화장품 사용 예정량 (1%)의 10
배인 10%로 하여 실시하였다. 실험 시작 24 시간 전에 clipper와 일반 면도기를 이용하여 제모
하여 제모에 의한 피부자극을 안전화 시킨 후 다음날 사용하였다. 제모한 10 마리의 기닉픽을 이
용하여 각 동물의 등 부위를 약 1.5 cm × 1.5 cm 정도의 크기로 척추를 중심으로 4 구획을 만
들었다. 표시된 부위 중 오른쪽 부위를 주사기 바늘을 이용하여 대각선 방향으로 각질층만 손상되
고 진피는 손상되지 않도록 피가 나지 않을 정도의 찰과상을 내어 비찰과 피부 2 개소와 찰과 피
부 2 개소로 나누었다 (Fig. 6). Fig. 6의 A, B 구획은 대조물질 (생리식염수)을, C, D 구획에는
10% 천년초 추출물을 각각 0.5 mL씩 천천히 도포하였다. 도포를 마친 후 시험부위 전체를 거즈
로 덮고, 탄력붕대로 감싼 다음 3M 종이테이프로 가장자리를 잘 고정하였다. 시험물질 도포 24
시간 후 거즈를 제거하고 잔류물이 피부에 영향을 미치지 않도록 미온수로 씻어내었다. 세정을 마
친 다음, 24 시간 간격으로 72 시간까지 관찰하면서 피부반응을 “의약품 등의 독성시험기준”의
“피부자극반응 평가표” (Table 5)에 따라 평가하여, 피부 1차 자극지수 (primary irritation
index, P.I.I.)를 산출하여, 자극성을 Table 6에 따라 판정하였다 (Administration, 2007;
Rush, Bonnette, Douds & Merriman, 1995).
Fig. 6. The evaluation on primary skin irritation of Cheonnyuncho extract.
A, controlsite, intact skin; B, control site, abraded skin; C, treated with Cheonnyuncho
extract, intact skin; D, treated with Cheonnyuncho extract, abraded skin.
96 2013년 기초연구과제총서
Table 5. Score of skin irritation
Skin reaction Score
Erythema and eschar formation
No erythema 0
Very slight erythema (barely perceptible) 1
Well-defined erythema 2
Moderate to severe erythema 3
Severe erythema (beet redness) to slight eschar formation 4
Edema
No edema 0
Very slight edema (barely perceptible) 1
Slight edema (edge of area well defined by definite raising) 2
Moderate edema (raised approximately 1 mm) 3
Severe edema (raised more than 1 mm and extending beyond the area of
exposure)
4
Table 6. Primary irritation index(P.I.I.) according Draze method
Classification P.I.I.
Pratically non-irritation 0.0-0.5
Slight irritation 0.6-2.0
Moderate irritation 2.1-5.0
Severe irritation 5.1-8.0
피부 감작성 시험 (skin sensitization test): 피부 감작성 실험은 Maximization Test법으로
실시하였으며(Magnusson & Kligman, 1969), 각 군당 기니픽 5 마리씩을 사용하여, 음성대조군
(생리 식염수), 양성대조군(DNCB), 및 천년초 처리군으로 나누어 수행하였다. 제모는 1차 피부자
극 시험과 동일한 방법으로 수행하였다. 1차 감작(induction)을 위해, 제모한 기니픽의 등 부위
피부(2×4 cm)에 Fig.7 과 같이 표시한 후 각 부위에 FCA와 천년초, 음성 대조군(생리 식염수)
또는 양성 대조군(DNCB)을 0.1 mL씩 각각 피내로 주사하였다. 1차 및 2차 감작 노출량은 화장
품 사용 예정량1%)의 10 배인 10% 용액을 사용하여 감작시켰다. SLS 전처리는 1차 감작 6 일
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 97
후 시험물질에 의한 감작을 증강하기 위해 10%(w/v) SLS 함유 백색 바세린 0.5 g을 도포한 다
음 24 시간 후 SLS를 미온수로 씻어 내고 2차 감작을 실시하였다. 2차 감작은 1차 감작 1 주 후
시험물질을 피내주사 했던 부위에 시험물질을 포함하는 패취 (patch, 2×4 cm)를 부착하여 48
시간 동안 폐색첩포(occlusive with patch)하여 감작시켰다. 2차 감작 2 주 후 야기 (challenge)
를 실시하였으며, Fig. 7의 야기부위에 부착하여 24 시간 동안 폐색첩포하여 감작을 야기시켰다.
천년초의 야기 농도는 화장품 사용 예정량인 1%로 하였다. 24 시간 야기 후 패취를 제거한 다음
미온수로 피부에 남아 있는 시험물질을 깨끗이 닦아낸 후 72 시간까지 관찰하였다. 양성 대조군인
DNCB는 감작농도는 1.0%, 야기 농도는 0.1%로 적용하였다.
Fig. 7. The evaluation of content allergenicity with maximization test.
①, intradermal injection of 0.1 mL distilled water + Freund’s complete adjuvant emulsion (1:1);
②, intradermal injection of 0.1 mL sample;
③, intradermal injection of 0.1 mL sample + Freund’s complete adjuvant emulsion (1:1).
일반 증상의 관찰 및 체중 측정: 감작기간 중 매일 오전 10 시와 오후 5 시 일반적인 상태를
관찰 기록 하였고, 매주 1 회씩 체중을 측정하였다.
피부의 관찰 및 평가 방법: 야기를 위해 부착했던 폐쇄첩포를 제거한 다음 24 시간, 48 시간
및 72 시간에 “피부감작반응 평가표” (Table 7)에 따라 반응을 평가하였으며, 각 군에서 반응을
보이는 개체로 양성 반응율 (%) [양성동물수/전체동물수×100]을 구하고 피부감작성의 정도를 평
가하였다.
98 2013년 기초연구과제총서
Table 7. Score of senitization and maximization grade1)
Sansitization
score
Erythema reaction state Edema formation
0 No reaction No edema
1 Scattered mild redness Slight edema
2 Moderate and diffuse erythema Moderate edema
3 Severe erythema with scar formation Sever edema
1) Grade I (0~8%), weak sensitizer; Grade II (9~28%), mild sensitizer; Grade Ⅲ (29~64%),
moderate sensitizer; Grade Ⅳ (65~85%), strong sensitizer; Grade Ⅴ (86~100%), extreme
sensitizer
2.6. 화장품 안정성 실험
화장품 안정성 실험은 pH, 침전물, 색도 3 가지를 이용하여 측정하였다. 화장품 조성은
Table.8 와 같으며 Fig. 8같은 성상을 가졌다. 화장품을 25±2℃/절대습도와 40±2℃/70±5%상
대습도의 상태로 저장하면서 1 주일 간격으로 시료를 채취하여 시행하였다. 침전물 측정은 시료를
1 mL씩 채취하여 3,000×g, 30 분간 원심 분리하여 침전물의 양을 측정하였으며, 그 상징액으로
는 색도를 측정하였다. 색도는 Hunter L (Lightness), a (Redness), b (Yellowness) color
system을 가지고 있는 색채 색차계 (Minolta CR-300, Japan)를 사용하였는데, 색도의 색좌표
값은 L=97.06, a=0.06, b=1.84인 표준 백색판 위에 놓고 측정하였다. 천년초 추출액 화장품의
상징액 일부를 채취하여 L, a, b를 측정하였으며 측정값을 통해 △E (total color difference; 총
색차)를 다음과 같이 계산하였다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 99
Δ? ??? ? ? ?? ? ? ? ?? ? ? ? ??
Fig.8. Cheonnyuncho extraction cosmetic.
Table 8. Compositions of cosmetic formulations for safety test
Compositions (%) Vehicle Cheonnyuncho
Deionized water 90.24 89.44
Glycerin 3.50 0.50
Alcohol 3.00 3.00
Polyacrylate-13/Polyisobutene/Polysorbate 20 0.00 0.80
PEG-60 hydrogenated castor oil 0.25 0.25
Butyleneglycol 2.00 0.00
Carbomer 0.20 0.20
Panthenol 0.20 0.20
Triethanol amine 0.20 0.20
Allantoin 0.10 0.10
Niacinamide 0.10 0.10
Methylparaben 0.12 0.12
Hydroxyethylcellulose 0.09 0.09
Cheonnyuncho extract 0.00 5.00
Total 100 100
100 2013년 기초연구과제총서
3. 연구결과
3.1. 천년초의 생리활성
항산화활성: DPPH와 ABTS는 추출액의 항 산화능이 라디칼 소거능에 의한 것일 때 가장 폭
넓게 사용되는 라디칼 소거능 실험방법이다. FRAP은 Total antioxidant power 를 측정하는 방
법으로 재현성이 있어 측정하기 쉬우며 함유되어 있는 항산화제들이 농도에 직선으로 비례하여
FRAP 값을 나타내어 총 항산화 효과를 직접적으로 측정할 수 있는 실험방법이다. 먼저 천년초의
ABTS 라디칼 소거능 결과는 Fig. 9에 나타내었다. 천년초의 ABTS 라디칼 소거능 IC50의 값은
4.74 mg/mL 으로 나타났다 (IC50 of Ascorbic acid: 0.06 mg/mL).
천년초의 DPPH 라디칼 소거능의 IC50의 값은 10 mg/mL 이상으로 나타났다 (IC50 of
Ascorbic acid: 0.04 mg/mL). 마지막으로 Total antioxidant power를 측정하는 FRAP 값은
0.87 mM FeSO47H2O으로 나타났다 (FRAP value of ascorbic acid : 630.5 mM FeSO47H2O).
Fig. 9. IC50 value of Cheonnyuncho Extracton ABTS.
Each bar represents mean±SD. n =3
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 101
Tyrosinase 와 Elastase 저해능: 천년초의 Tyrosinase 와 Elastase 저해능력 실험 결과이다.
먼저, 천년초의 Tyrosinase 저해능력 IC50의 값은 10 mg/mL 보다 더 높은 농도에서 나타나, 천
년초의 피부 미백 활성은 거의 없음을 알 수 있었다 (data not shown). Fig.10 은 천년초의
Elastase 저해능력 결과이다. 천년초의 Elastase 저해능력 IC50의 값은 63.46 mg/mL으로 나타
났다. 이로써 천년초는 Elastase 억제에 약간의 활성이 있음을 알 수 있다.
Fig. 10. Elastase inhibition activity of Cheonnyuncho Extract treated enzyme.
Each bar represents mean±SD. n =3
3.2. HaCat cell을 이용한 천년초의 보습 효과 실험 결과
Cell viability 의 측정: MTT assay는 노란색의 가용성 tetrazolium 염이 살아있는 세포의
미토콘드리아 succina dehydrogenase에 의해 파란색의 불용성 formazan 생성물로 환원되는 원
리를 이용한 실험 방법으로 formaza의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서
측정된 흡광도는 살아있고 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하는 것으로 미토콘드리아 활성
의 지표로 사용되고 있다. Cell viability는 Table. 9. 에 나타내었다. HaCaT cell에 천년초 시료
만 처리한 경우에는 시료를 처리하지 않은 그룹과 비교하여 세포 생존율이 유의적인 차이가 없었
다. 천년초는 HaCaT cell에 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
102 2013년 기초연구과제총서
Table 9. Cell viability
Conc. (μg/mL)
Cell cytotoxicity
(% of normal control)
0 100.0 ± 2.4
10 102.1± 4.8
50 97.3 ± 3.5
100 92.3 ± 1.1
500 93.6 ± 0.6
1000 94.4 ± 1.7
Each contents that represents mean±SD. n=4
HAS 의 발현 변화: Hyaluronic acid (HA)에는 구조적으로 수산기 (-OH)가 많아 친수성이고,
진피 층 내에서 콜라겐 섬유와 뮤코다당류가 결합된 상태로 수분을 다량 함유한 기질을 형성하는
보습 인자이다. HAS는 세포막에 존재하여 HA를 합성하는 역할을 하는 효소이다. HAS 1과 HAS
2는 2~4×106 Da크기의 HA를 생성하고 HAS 3는 0.4~2.5×105 Da크기의 HA를 형성한다고
알려져 있다(Averbeck et al., 2006). Fig. 11 의 B를 보면 HAS 2-1 은 천년초를 처리한 피
부세포가 농도 의존적, 유의적으로 HAS 2-1의 발현이 증가함을 알 수 있다. Fig. 11의 C를 보
면 HAS 2-2 의 경우도 마찬가지로 천년초를 처리한 피부세포의 HAS 2-2의 발현이 농도 의존
적으로 증가함을 알 수 있었다. 또한 Fig. 11. 의 D를 보면 음성 대조군에 비하여 천년초를 처리
한 세포들의 HAS 3의 mRNA 발현이 농도 의존적, 유의적으로 증가함을 알 수 있었고 양성 대조
군으로 사용한 ATRA (all-trans retinoic acid)과 같은 수준으로 HAS 3의 발현 수준이 증가함
을 확인할 수 있다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 103
Fig. 11. mRNA expression of HAS 2-1, HAS 2-2, HAS 3.
Each bar represents mean±SD. n =3
HYAL 의 발현 변화: Hyaluronic acid (HA)는 HA에는 구조적으로 수산기 (-OH)가 많아 친
수성이고, 진피 층 내에서 콜라겐 섬유와 뮤코다당류가 결합된 상태로 수분을 다량 함유한 기질을
형성하는 보습 인자이다. HYAL (hyaluronidase)는 HA의 글리코시드 결합을 가수분해하는 역할
을 하여 HA를 분해하는 효소이다. Fig. 12를 보면 UVB만 조사하고 아무 시료도 처리하지 않은
세포에서는 HYAL의 발현이 300% 증가함을 알 수 있다. 이 결과로 UVB 조사가 HYAL의 발현
을 증가시킨다는 결론을 도출할 수 있다. 천년초와 UVB 모두 처리한 세포에서는 UVB만 처리한
세포에 비하여 HYAL의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있다.
104 2013년 기초연구과제총서
Fig. 12. mRNA expression of HYAL. Each bar represents mean±SD. n =3
3.3. Hairless mouse를 이용한 천년초의 피부 보습 효과
체중 및 식이섭취량: Normal control 군에 비하여 UVB Control group은 마지막 몸무게와
몸무게 증가량이 유의적으로 적음을 확인 할 수 있었다. 이는, UVB treatment 에 의한 스트레스
때문으로 예상된다. 하지만, 시료 처치군의 경우 normal control과 유의적인 차이는 보이지 않았
다. 음용량의 경우 차이가 관찰되지 않았다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 105
Table 10. Body weight, body weight gain and drink volume.
Group
Initial body
weight(g)
Final body
weight(g)
Body Weight
gain (g/day)
Drink volume
(mL/day)
Normal Con 24.52±0.32ns 31.54±0.68ab 7.02±0.63b 6.26±0.30ns
UVB
treated
UVC 24.86±0.65 27.78±0.65a 2.92±1.59a 6.26±0.30
Oral intake
CO-L 24.60±0.70 29.82±1.35b 5.22±1.61ab 6.29±0.35
CO-H 24.74±0.74 31.66±1.15b 6.92±1.11b 6.52±0.30
Topical
applied
CA-L 24.56±0.39 30.62±0.74ab 6.06±0.89b 6.26±0.30
CA-H 24.50±0.57 31.42±0.38b 6.918±0.90b 6.26±0.30
Oral +
applied
COA-L 24.90±0.77 30.4±0.58b 5.50±0.97ab 6.38±0.33
COA-H 24.34±0.89 31.5±1.05b 7.16±1.77b 6.43±0.30
NS; not significant. Value mean±SD. n=5 Means with different superscript letters within a row
are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. UVC; UVB Control, CO-L;
Cheonnyuncho extract oral application treatment low dosage, CO-H; Cheonnyuncho extract oral
application treatment high dosage. CA-L; Cheonnyuncho extract topical application low dosage,
CA-H; Cheonnyuncho extract topical application high dosage, COA-L; Cheonnyuncho extract oral and
topical application treatment low dosage. COA-H; Cheonnyuncho extract oral and topical
application treatment high dosage.
장기무게: 시료의 처치에 따른 이상현상을 확인하기 위하여 장기무게를 측정 해 보았다 (Table
11). 일반적으로 시료에 독성이 생기면, 간이나 비장의 크기가 커지게 된다. 시료를 처치한 군의
간, 심장, 비장, 심장은 통계적으로 유의하지 않는 것으로 나타났으며, 폐의 경우 유의적인 차이는
보였으나, 정상군이나 UVB Control와 비슷한 수준으로 시료의 처치로 인한 장기 무게의 변화가
야기되지 않는 것으로 보인다. 따라서, 시료의 처치가 Hairless mouse에 이상 영향을 미치지 않
는 것으로 사료된다.
106 2013년 기초연구과제총서
Table 11. Organ weight.
Organ
Weight
(g)
NC
UVB treated group
UVC
Oral intake Topical applied Oral + Applied
CO-L CO-H CA-L CA-H COA-L COA-H
Liver 1.4±0.1NS 1.4±0.2 1.5±0.2 1.5±0.2 1.4±0.1 1.4±0.2 1.4±0.1 1.6±0.1
Heart 0.2±0.0NS 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0
Lung 0.2±0.0a 0.2±0.0ab 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a
Spleen 0.1±0.0NS 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0
Kidney 0.5±0.0NS 0.5±0.0 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.0 0.5±0.1 0.5±0.1
NS; not significant. Value mean±SD. Means with different superscript letters with a row are
significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. NC: Normal control; UVC: UVB
Control; CO: Oral administration of Cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
Cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of Cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
혈핵학적 검사: 천년초를 먹이는 군의 독성을 알아보기 위하여, Hairless mouse의 혈액을 채취
하여 혈액학적 검사를 실시하였다.(Table 12) 지표로는 Glutamate Oxaloacetate Transaminase
(GOT), Glutamic pyruvic transaminase(GPT), Lactate dehydrogenase (LDH)로 확인해 보았
다. GOT는 간과 심장에 고농도로 존재하고 세포장애 정도와 비교적 상관성이 좋을 뿐만 아니라
다른 골격의 근육, 신장, 췌장의 임상지표로 사용되는 지표이다. GPT는간세포 이상에 의해서 빠
르게 증가하고 간이나 담관에 질환이 있을 시에 그 지표로 널리 이용된다. LDH는 거의 모든 조
직에 분포되어 있는데, 이 효소의 활성이 증가하는 것은 생체내의 어느 장기에 세포 파괴가 있어
혈중에 유출되는 것인지를 측정하는데 이용된다. 혈액분석 모든 군의 유의적인 차이가 없는 것으
로 보아, 시료의 처치로 인한 독성은 없는 것으로 사료된다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 107
Table12. Blood chemistry
Organ
Weight
(g)
NC
UVB treated group
UVC
Oral intake Topical applied Oral + Applied
CO-L CO-H CA-L CA-H COA-L COA-H
Liver 1.4±0.1NS 1.4±0.2 1.5±0.2 1.5±0.2 1.4±0.1 1.4±0.2 1.4±0.1 1.6±0.1
Heart 0.2±0.0NS 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0
Lung 0.2±0.0a 0.2±0.0ab 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a 0.2±0.0a
Spleen 0.1±0.0NS 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0
Kidney 0.5±0.0NS 0.5±0.0 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.0 0.5±0.1 0.5±0.1
NS; not significant. Value mean±SD. Means with different superscript letters with a row are
significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. NC: Normal control; UVC:
UVB Control; CO: Oral administration of Cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
Cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of Cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
피부의 육안 관찰 및 피부 주형의 분석 결과: 10 주 동안 hairless mouse 를 처치한 후 피부
를 육안으로 관찰하고 희생하여 주형을 떠 피부 손상 억제효과를 관찰하였다. 10 주 동안 UVB
를 조사하지 않은 NC군은 육안으로 관찰하기에 피부 표피의 결 까지 관찰 될 정도로 전혀 손상되
지 않은 상태였다. 하지만 UVB를 조사하고 아무런 처치를 하지 않은 UVC군의 경우에는 mouse
피부결이 많이 손상되었고, 관찰 하기 어려웠으며, 피부가 두꺼워 보였다. 또한, 각질이 일어난 것
을 확인할 수 있었다. Fig. 13의 (A) 에서 보이는 바와 같이 천년초를 투여한 군의 경우 10 주
UVB 조사로 인한 광노화 현상과 함께 피부 표면이 손상되었다. 하지만, 천년초 추출물이 어느 정
도 피부손상을 억제하였고, 피부 보호 효과가 있음을 알 수 있었다. CO군의 경우 각질이 발생하
였지만 UVC군에 비하여 적게 발생하였고, CO-L군보다 CO-H에서 적어진 것을 확인 할 수 있었
다. CA군의 경우 Low dosage와 High dosage가 비슷한 것으로 관찰되었으며, COA는 다른
Treat군과 비교하여 훨씬 더 각질이 적은 것을 확인 할 수 있었다. Fig. 13의 (B)의 주형에서는
피부 표피가 손상되지 않아서 피부결이 남아있는 것을 확인 할 수 있었다. 반면 UVC군은 손상된
부분은 피부결을 확인 할 수 없는 정도로 매끈하였고, 손상이 심한 부위에는 주름이 형성되어 있
는 것을 확인할 수 있었다. 피부 주형의 경우 시료를 처리한 모둔 군은 NC와 비교하여 피부결에
손상이 생겨 피부결을 제대로 확인 할 수 없었다. 하지만 UVC와 비교하여 좀 덜 거칠어진 것을
확인 할 수 있었다. UVC 군의 경우 털구멍도 관찰하기 힘들었지만 시료 Treat군을 보면 털구멍
108 2013년 기초연구과제총서
이 확인되었다. 시료 treat 군 Low dosage에서는 주름과 함께 다소 거칠어진 피부가 확인되었지
만, High dosage에서는 피부 손상이 거칠어진 부분은 발견 되지 않았다. 따라서, 천년초 처치군
이 피부 보호 효과를 가지고 있다고 사료된다.
A
B
Fig. 13. Photographs dorsal skin of the mouse treated by cheonnyuncho.
NC: Normal control; UVC: UVB Control; CO: Oral administration of Cheonnyuncho extract; CA:
Topical application of cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of
cheonnyuncho extract; -L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 109
피부 수분 보유량: Coneometer는 피부표면 (각질층 하방 일정한 깊이 10~20 μm이내의)의
수분함유량을 정전부하용량(Capacitance) 계측법으로 측정하는 센서기이다. 수분의 함량과 정전용
량은 서로 비례하는 경향이 있어 피부의 보습도가 높을수록 측정되는 수치가 높아진다.
Fig. 14 에서 나타난 피부 수분 보유량을 보면 먹기 군과 바르기 군의 경우 높은 농도에서 수
분보유량이 증가하는 경향을 나타냈으며, 먹고 바르기 군의 경우는 두 농도 모두 증가하는 경향을
확인할 수 있었다 (p<0.05).
함습제는 피부의 수분을 증가시켜 유연성과 탄력성을 높이고 피부를 매끄럽고 부드럽게 하며, 다
양한 외부자극으로부터 보호하는 역할을 한다. 화장품은 피부에 수분균형을 맞춰주는 중요한 역할
을 가지고 있는데, 함습제는 화장품에 아주 중요한 재료이다. 이러한 결과는 천년초 추출물이 피부
의 수분보유량을 증가시키는 효과가 있어 화장품의 함습제로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
경표피수분손실량: 경표피수분손실량은 피부로부터 증발하는 수분을 가리키며, 각질층에서 피부
장벽기능 손상 및 회복의 생리학적 지표로 사용된다. Fig. 15를 보면 천년초 먹이기 군에서 경표
피수분손실량이 유의적으로 줄어든 것을 확인 할 수 있었다. 바르기 군의 경우 두 농도 모두 줄어
드는 경향을 보였으나 낮은 농도의 경우에서만 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 먹고
바르기 군에서는 두 농도 모두 UVC 대비 경향을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 미루어 보
아 천년초 처치에 따라 경표피수분손실량이 줄어드는 경향을 보였다. 따라서, 천년초가 광노화에
따른 피부장벽 기능 및 손상을 보호해 준다는 것을 확인할 수 있었다.
110 2013년 기초연구과제총서
Fig. 14. Skin water-holding capacity
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
Fig. 15. Transepidermarl water loss
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 111
홍반 지수: 피부와 모발의 색은 표피 및 모피질에 존재하는 멜라닌의 양과 분포, 표피의 두께
및 상태에 따라 달라진다. 또한 인종과 지역, 성별, 연령 및 개인에 따라 각기 다르며 동일인에
있어서도 부위별, 계절별로 차이가 있고 또한 건강상태나 스트레스 등에 의해서도 다르게 나타난
다. 피부의 평가에 대한 여러 가지 물리적 요소 중 피부색은 임상적으로 가장 중요한 요소이며 피
부에 존재하는 멜라닌과 헤모글로빈에 의해 결정된다. 피부색은 넓게 redness와 darkness로 구분
할 수 있으며, redness는 주로 피부자극 정도 혹은 알러지를 나타내는 홍반을 측정하기 위해 사
용되며, darkness는 미백효과를 측정하는데 사용되고 있다. 멜라닌과 혈색소에 대응하는 파장대의
빛을 흡수하고 반사되는 양을 측정하여 멜라닌지수와 홍반 지수로 계산한다.
Fig. 16 홍반 지수의 경우 낮아지는 경향을 보였으나, 높은 농도의 먹이기 군에서만 유의적인
결과를 확인할 수 있었다. 홍반 지수 측정을 통해 천년초 시료를 처치 하였을 때 낮아지는 경향을
보였으나 유의적으로는 감소하지 않아 hairless mouse의 피부에 큰 영향을 미치지 않는 것으로
사료된다.
피부산성도: 건강한 피부의 표면은 피부의 땀샘과 지방샘에서 분비되는 분비물로 pH 4~5.5정
도의 산성막을 이루고 있다고 한다. 피부 장벽에 손상을 입게 되는 경우 pH 가 높아지게 된다.
달라지게 된다(Berg, Milligan, & Sarbaugh, 1994). 이를 바탕으로 피부의 산성도를 측정해 보
았다. Fig. 17를 보면, 전체적으로 UVB의 경우 높아지는 경향을 보였으나, 전체적으로 NS로 피
부 산성도에 영향을 미칠 만큼 손상되지는 않는 것으로 사료된다.
112 2013년 기초연구과제총서
Fig. 16. Mexameter value.
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
Fig. 17. Skin pH
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: O ral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 113
HAS 의 발현 변화: Hyaluronic acid (HA)에는 구조적으로 수산기 (-OH)가 많아 친수성이
고, 진피 층 내에서 콜라겐 섬유와 뮤코다당류가 결합된 상태로 수분을 다량 함유한 기질을 형성
하는 보습 인자이다. Hyaluronic acid synthesis (HAS)는 세포막에 존재하여 HA를 합성하는 역
할을 하는 효소이다. HAS-1과 HAS-2는 2~4 × 106 Da 크기의 HA를 생성하고 (Averbeck,
et al., 2006).
Fig. 18-A의 HAS-1경우, UVC이 NC에 비하여 유의적으로 증가하는 것을 관찰 할 수 있었
다. 먹기군의 경우 낮은 농도에서는 UVC보다는 감소하는 경향을 보였으나 유의적으로 감소하지는
않았다, 하지만 높은 농도의 경우 유의적으로 NC 수준과 비슷한 것을 확인 할 수 있었다. 바르기
와 먹고 바르기 모두 유의적으로 NC 수준과 같은 양의 HAS-1이 발현된 것을 확인 할 수 있었
다. 바르기와 먹고 바르기를 비교해 볼 때에는 먹고 바르기의 양이 더 적어진 것을 확인 할 수 있
었다.
Fig. 18의 B를 보면, HAS-2의 경우, 먹기, 바르기, 먹고 바르기군 모두 NC와 유의한 수준을
나타났으며, UVC의 경우, NC비해 유의적으로 증가하였다.
HYAL 의 발현 변화: Hyaluronic acid (HA)는 HA에는 구조적으로 수산기 (-OH)가 많아 친
수성이고, 진피 층 내에서 콜라겐 섬유와 뮤코다당류가 결합된 상태로 수분을 다량 함유한 기질을
형성하는 보습 인자이다. HYAL (hyaluronidase)는 HA의 글리코시드 결합을 가수분해하는 역할
을 하여 HA를 분해하는 효소이다.
Fig. 19을 보면 HYAL-1,2 모두 NC에 비하여 UVC의 발현양이 유의적으로 늘어난 것을 확인
할 수 있었다. A를 보면 HYAL-1의 발현 양을 확인할 수 있다. 먹기의 경우 낮은 농도에서는
HYAL의 발현양이 높아 UVC와 같은 수준이었다. 하지만, 바르기와 먹고 바르기의 경우 두 농도
모두 유의적으로 NC와 같은 수준으로 나타났다. B의 HYAL-2 또한 먹기에서 UVC와 비교하여
낮아지는 경향을 보였지만 낮은 농도에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 바르기와 먹고 바르
기 모두 UVC와 비교하여 NC 수준으로 HYAL-2의 발현양이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
CD44의 발현량의 변화: CD44는 Hyaluronic acid의 receptor protein이다. Hyaluronic acid
의 함량을 보기 예측하기 위하여, CD44의 mRNA발현양을 확인하여 보았다. Fig. 20을 보면,
CD44의 발현양이 UV Treat 한 군이 더 많아지는 것을 확인 할 수 있었다. 먹기군을 보면, 천년
114 2013년 기초연구과제총서
초를 처치한 군의 경우 유의적이진 않지만, CD44가 낮아지는 것을 확인 할 수 있었다. 바르기의
경우에도, 유의적이진 않지만, 천년초 처치를 하였을 때 낮아지는 경향을 확인 할 수 있었다. 먹
고 바르기 군의 경우에는, 낮고 높은 농도 둘 다 유의적으로 CD44의 발현양이 NC수준으로 낮은
것 을 확인 할 수 있었다.
Fig. 18. The mRNA expression of HAS. A; HAS-1, B; HAS-2
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with different
superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control; UVC: UVB
Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of cheonnyuncho
extract extracts; COA: O ral administration & topical application of cheonnyuncho extract; -L and –
H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 115
Fig. 19. The mRNA expression of HAYL. A; HYAL-1, B; HYAL-2.
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: O ral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
116 2013년 기초연구과제총서
Fig. 20 The mRNA expression of CD44
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: O ral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
HA 함량: ELISA 를 이용하여 hairless mouse 피부의 Hyaluronic acid 함량을 확인 하여 보
았다. HA함량을 보면(Fig. 21) UV treat한 군의 경우 함량이 늘어난 것을 확인 할 수 있었다.
먹기군의 경우 시료를 처리 하였을 때 낮아지는 경향을 나타냈었으며, 높은 dosage에서 유의적으
로 NC수준과 같은 것을 확인 할 수 있었다. 바르기와 먹고 바르기 군의 경우에도 낮아지는 경향
을 보였으나, 높은 농도에서만 유의적으로 NC와 같아지는 것을 확인 할 수 있었다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 117
Fig. 21. Hyaluronic acid contents
NS; not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
H & E Staining; 희생시킨 hairless mouse 의 등 피부를 적출하여 포르말린에 고정시킨 후
hematoxylin & eosin staining (H&E staining) 을 행하였다. Fig. 22은 H&E staining 후 현
미경으로 관찰한 모습이다. 먼저 NC의 경우 표피 층이 매우 얇고 각질 층도 거의 존재하지 않음
을 확인할 수 있다. 따라서 NC는 주름 형성이 거의 되지 않았음을 알 수 있다. 광 노화 현상이
일어나면 피부 장벽이 무너지는데 이때, 피부의 보습력도 낮아진다고 볼 수 있다. 광 노화의 큰
특징으로는 두꺼워지는 표피이다. UVC 군의 경우 NC에 비하여 굉장히 피부 표피가 두꺼워져 있
음이 관찰되고, 표피가 끊어져 주름이 형성되어 있음을 확인할 수 있다. 그에 비하여 천년초 처치
군의 경우, 10 주 동안의 UVB 조사로 인하여 어느 정도 두꺼워진 표피는 관찰되지만 UVC 군에
비하여 먹고 바르기 높은 농도를 제외하고는 얇은 표피를 관찰 할 수 있었다. 또한 사진에서는 나
타나지 않았지만 staining 과정에서 보여진 피부 각질층을 보면 UVC군에 비하여 처치군의 각질
이 적어지는 것을 확인 할 수 있었다.
118 2013년 기초연구과제총서
Fig. 22. H&E staining of treated ginseng leaf extract hairless mouse.
Light micrographs of cells stained with H&E staining. Light micrographs for A; Normal control,
B;UVB Control,C; Cheonnyuncho extract oral application treatment low dosage, D; Cheonnyuncho
extract oral application treatment high dosage, E; Cheonnyuncho extract topical application low
dosage, F; Cheonnyuncho extract topical application high dosage, G; Cheonnyuncho extract oral
and topical application treatment low dosage. H; Cheonnyuncho extract oral and topical
application treatment high dosage.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 119
Detection of CD4 and HYBP via Immunohistochemistry: CD44
Hyaluronic acid(HA)은 물분자와 흡착력이 뛰어나 일반적인 보습 인자로 많이 사용되고 있다.
HA의 Cell receptor 는 크게 세 가지로(CD44, RHAMM, ICAM) 나누어 진다. HA의 분포를 보
기 위하여 CD44에 대해 IHC staining을 해 보았다. Fig. 23을 보면, CD44가 staining 결과 각
질층과 표피층에 집중되어 있고 진피층과 피하조직에도 분포되어있는 것을 확인 할 수 있었다.
NC층에서는 각질이 없고 얇은 진피층을 확인 할 수 있었다. UVC에서는 각질층이 두꺼워 지고
진피층이 두꺼워지면서, CD44의 분포 또한 많아진 것을 확인 할 수 있었다.
먹기군을 보면 낮은 농도에서는 UVC와 비교하여 비슷한 수준을 나타냈으며, 주름형성이 약간
줄어든 경향을 볼 수 있었다. 하지만 높은 농도의 경우 각질층이 발생하긴 하였지만, CD44의 분
포가 NC 수준과 비슷하게 줄어든 것을 확인 할 수 있었다. Image J 로 분석한 결과(Fig. 24),
높은 농도에서 유의적으로 NC 수준으로 변화는 것을 볼 수 있었다. 바르기 군의 경우 낮은 농도
에서 NC수준은 아니지만 NC와 비슷하게 UVC보다는 CD44의 분포가 줄어들고 표피층이 얇아진
것을 확인 할 수 있었다. 하지만, 높은 농도의 바르기 시료의 경우에는 CD44의 분포가 UVB와
비슷하게 보였다. 이는 Image J의 분석 결과에서도 같게 나타났다. 먹고 바르기 군의 경우에는
두 농도 모두 비슷한 수준으로 UVC에 비하여 CD44의 전체적인 분포가 줄어들고 표피가 얇은 것
을 확인 할 수 있었다. 이미지 분석 결과는 먹고 바르기 군만 유의적으로 낮아져 NC 수준으로 나
타나는 것을 확인하였다.
따라서, 천년초 처치 결과 Hairless mouse의 CD44의 분포가 NC 수준으로 내려감을 확인 할
수 있었다. 또한 바르기의 경우 높은 농도보다는 낮은 농도에서 효과가 있는 것으로 나타났다.
120 2013년 기초연구과제총서
Fig. 23. Immunohistochemistry (CD44) of treated Cheonnyuncho Extract hairless mouse.
Light micrographs of cells stained with Immunohistorical staining with CD44 A; Normal control,
B;UVB Control,C; Cheonnyuncho extract oral application treatment low dosage, D; Cheonnyuncho
extract oral application treatment high dosage, E; Cheonnyuncho extract topical application low
dosage, F; Cheonnyuncho extract topical application high dosage, G; Cheonnyuncho extract oral
and topical application treatment low dosage. H; Cheonnyuncho extract oral and topical
application treatment high dosage.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 121
Fig. 24. CD44 expressions of Cheonnyuncho Extract treatment on the hairless mouse.
NS; Not significant. Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed
using one way analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with
different superscript letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control;
UVC: UVB Control; CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of
cheonnyuncho extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract;
-L and –H stands for low and high dosage of treatments, respectively.
HYBP: Hyaluronic acid(HA)의 binding protein중에 하나인 HYBP의 IHC staining을 통하
여, HA의 분포를 확인하였다. Fig. 25와 같이 staining 결과 HYBP표피층에 집중되어 있고 진피
층과 피하조직에도 분포되어있는 것을 확인 할 수 있었다. NC(A)에서는 각질이 없고 얇은 표피층
을 확인 할 수 있었었다. UVC(B)에서는 각질층이 두꺼워 지고 진피층이 두꺼워지면서, HYBP의
분포 또한 많아진 것을 확인 할 수 있었다. 또한 진피층의 HYBP 분포량이 많아진 것을 확인 할
수 있었다. 또한 피부층이 끊어지면서, 굵은 주름이 형성된 것으로 보였다.
먹기 군을 보면 낮은 농도(C)에서는 UVC와 비교하여 표피의 두께는 조금 얇아졌으나 거의 비
슷하였고 HYBP의 표피에서의 분포도 비슷해 보였다, 하지만 진피층의 HYBP분포를 NC와 비슷
한 수준을 나타났다. 높은 농도의 먹기군(D)을 보면, 일부 각질이 나타나지만, 표피의 두께나 표
피에서의 HYBP, 진피에서의 HYBP의 분포가 NC와 유사한 수준인 것을 확인 할 수 있었다. 이
는 이미지 분석 결과(Fig. 26)에서도 높은 농도의 천년초 처치군이 감소하는 것을 확인 할 수 있
었다. 바르기 군의 경우 낮은 농도(E)에서 NC수준 보다는 많지만 UVC보다는 얇은 표피를 확인
할 수 있었고, 진피층의 HYBP가 많아진 것을 확인할 수 있었다, 반면에 높은 농도(F) 에서는
UVC보다는 적지만 비슷한 표피두께와 양상을 나타내었다. 진피의 HYBP는 낮은 농도보다는 낮아
진 것을 확인할 수 있었다. 하지만 바르기군은 두 농도 모두 이미지 분석 결과로는 UVC군과 차
122 2013년 기초연구과제총서
이나지 않는 것으로 보였다. 먹고 바르기 군의 경우, 두 농도 모두 비슷한 수준으로 NC보다는 많
고 UVC보다는 적어진 HYBP를 확인 할 수 있었다. 또한 높은 농도가 낮은농도에 비하여 더 적어
진 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 천년초 처치 결과 Hairless mouse의 HYBP의 분포가 NC의 경향과 비슷하게 감소하
는 것을 확인 할 수 있었다. 특히, 먹기 High 군이 NC수준과 비슷한 양상을 보였다. 따라서 천
년초를 처치한 피부는 광 노화가 진행되지 않는 상태의 HYBP상태와 유사한 상태로 확인 되었으
며, 이는 천년초 처치를 통해 피부장벽 보호기능에 따라서 HA의 분포가 방해 받지 않아 본래의
상태를 유지할 수 있게 해주었다고 사료된다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 123
Fig. 25. Immunohistochemistry (HYBP) of treated Cheonnyuncho Extract hairless mouse.
Light micrographs of cells stained with Immunohistorical staining with HYBP A; Normal control,
B;UVB Control,C; Cheonnyuncho extract oral application treatment low dosage, D; Cheonnyuncho
extract oral application treatment high dosage, E; Cheonnyuncho extract topical application low
dosage, F; Cheonnyuncho extract topical application high dosage, G; Cheonnyuncho extract oral
and topical application treatment low dosage. H; Cheonnyuncho extract oral and topical
application treatment high dosage.
124 2013년 기초연구과제총서
Fig. 26. Immunohistochemistry (HYBP) of treated Cheonnyuncho Extract hairless mouse.
Each bar are mean±SEM. (n=5). Differences between groups were analyzed using one way
analysis of variance (ANOVA) by Duncan’s multiple rage tests. Means with different superscript
letters within a row are significantly different at p<0. NC: Normal control; UVC: UVB Control;
CO: Oral administration of cheonnyuncho extract; CA: Topical application of cheonnyuncho
extract; COA: Oral administration & topical application of cheonnyuncho extract; -L and –H
stands for low and high dosage of treatments, respectively.
3.4. 천년초의 피부안전성
일반 중독 증상: 1차 자극을 평가하기 위하여 시험물질을 처리한 그룹의 동물에서는 시험물질
에 의한 특이한 일반증상 및 사망의 예는 관찰되지 않았다. 피부 감작성을 측정하기 위해 양성 대
조물 (DNCB)을 투여한 그룹에서는 피부에 중등도에 이르는 홍반과 부종이 관찰되었으며, 외부자
극에 과민하게 반응하는 행동을 보였으나 이로 인한 사망은 관찰되지 않았다 (Fig. 27).
1차 피부 자극(primary skin irritation)의 평가: 동결 건조한 분말 천년초 시료를 화장품 사
용 예정량의 10 배인 10%의 농도로 실험하였다. 찰과부위와 비찰과 부위에 24 시간 폐색첩포 후
첩포물을 제거한 다음 24, 72시간째에 관찰한 결과를 Table. 13에 나타내었다. 실험 시작에 비해
실험 종료 후 동물의 체중 변화량은 +30.4±4.7 g 정도로 나타났다. Table. 13에 나타난 바와
같이 대조군 (생리식염수)과 시험군(천년초) 모두에서는 부종과 홍반이 전혀 관찰되지 않았다.
Draze 법에 의한 1차 피부자극지수 (Primary irritation inden, P.I.I.)를 산출한 결과 천년초 는
0.12로 나타났다. Kang 등의 보고에 의하면 현재 기능성 화장품 소재로 많이 사용되는 2500 IU
의 레티놀 크림에서도 비찰과 부위에서는 홍반이나 부종이 없으나 찰과영역에서 아주 가벼운 홍반
이 관찰되어 P.I.I.가 0.875로 나왔다고 보고하였다 (Kang et al., 2002). 따라서 천년초의
P.I.I.가 0.12로 약간의 자극은 관찰되었으나 이는 pratically non-irritation (비자극성)에 해당
하는 자극으로 피부자극이 거의 없음을 알 수 있었다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 125
Fig. 27. Photographs of guinea pig.
Table 13. The evaluation on primary skin irritation of Cheonnyuncho.
Skin reaction
Score of skin irritation (No.) Mean
score
P.I.I
hr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Control
(Saline)
Intact
skin
Erythema
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0.00
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Edama
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Abraded
skin
Erythema
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Edama
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cheonnyun
-cho
Intact
skin
Erythema
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0.12
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Edama
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Abraded
skin
Erythema
24 0 2 0 0 2 0 0 0 0 0 0.4
72 0 1 0 0 2 0 0 0 0 0 0.3
Edama
24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mean score = total score / number of animal (10)P.I.I. (primary irritation index. Σtotal score /
animal No. × 4)
126 2013년 기초연구과제총서
피부 감작성 평가: 모든 동물의 처리 부위를 시험물질을 1차 감작하고 야기처리 후 24, 48, 72
시간째에 실시한 결과(Fig. 28)를 Table 14.에 나타내었다. 실험 종료 후 체중 변화량은 음성 대
조군이 +139.1±10.1 g, 양성 대조군이 +88.8±45.4 g, 천년초군은 144.3±35.1 g 으로 나타
났다. Table 14에 나타난 것처럼 천년초를 처리한 군에서는 발적, 홍반, 부종 등이 거의 관찰되지
않아 grade Ⅰ 으로 판정되었다. 양성 대조군에서는 평균 반응 2.3 정도의 홍반과 부종이 모든
동물에서 관찰되었다.
Fig. 28. Photographs of guinea pig skin.
Table 14. The evaluation of contact allergenicity with maximization test.
Skin reaction
Sensitization
score
Mean
response
Sensitization
rate (%)
Evaluation
grade
Group Induction Challenge 1 2 3 4 5 (class)
Negative
control
D.W D.W
24 0 0 0 0 0 0
0
I
(weak)
48 0 0 0 0 0 0
72 0 0 0 0 0 0
Positive
control
1%
DNCB
0.1%
DNCB
24 2 3 2 2 3 2.4
100
V
(extreme)
48 3 2 3 2 2 2.4
72 1 3 2 2 2 2.0
Cheonnyuncho
10%
Cheonnyuncho
1%
Cheonnyuncho
24 0 0 1 0 1 0.4
10
I
(weak)
48 0 0 0 1 0 0.2
72 0 0 0 0 0 0
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 127
3.5. 천년초 화장품의 안정성
Table 15과 Fig. 29은 천년초 추출액 화장품의 안정성을 본 결과이다. Fig. 29 은 침전물의
생성량과 pH를 나타낸 결과로서 침전물의 경우 0 주차부터 존재하였으나 6 주 동안 관찰한 결과
통계적으로 유의하게 증가하지 않았다. 또한 pH의 경우는 시간이 지남에 따른 변화가 별로 없는
것으로 관찰되었다. Table 15.은 색도의 변화를 나타낸 결과이다. BsE의 경우 25±2℃/ 절대습
도에서는 L값과 b값이 늘어나고 a값이 줄어드는 경향으로 나타났으며, 총 색차를 나타내는 ΔE값
은 감소하는 것으로 관찰되었다. (p <0.05). 40±2℃/70±5% 상대습도에서도 25℃와 마찬가지의
경향을 보였다. PH-25의 경우 25±2℃/ 절대습도에서는 유의적으로 a값과 b값이 증가하는 경향
으로 나타났으며 ΔE의 경우 시간이 지남에 따라 감소하는 경향으로 나타났다. 40±2℃/70±5%
상대습도에서는 L값과 a,b값 모두 유의적으로 증가하고 색차를 나타내는 ΔE값은 점차 감소하는
경향으로 나타났다.
Fig. 29. Precipitant and pH changes of Cheonnyuncho extraction cosmetic formulation at
25±2℃/AH (A) and at 40±2℃/70±5% RH (B) for 6 weeks.
PHE ; BsE + enzymatic treated Cheonnyuncho, AH; Absolute humidity, RH; relative humidity.
128 2013년 기초연구과제총서
Table 15. Chromaticity changes of Cheonnyuncho extraction cosmetic formulation at
25±2℃/AH and at 40±2℃/70±5% RH for 6 weeks.
L (Lightness) a (Redness) b (Yellowness) Δ E
25℃
BsE
0 week 35.89±0.22ab 1.82±0.66bc 1.64±0.33a 0.00±0.00bc
1 week 35.74±0.56abc 1.59±0.06c 3.57±0.20c -0.11±0.11abc
2 week 32.85±5.96a -0.32±0.67ab 2.16±0.94ab 2.75±5.68c
3 week 38.17±3.50abc 0.56±1.48abc 2.32±1.06ab -2.55±3.09abc
4 week 38.92±2.24bc 0.11±0.89abc 2.62±0.48bc -3.33±1.85ab
5 week 39.47±1.76c -0.11±0.58abc 1.73±0.12ab -3.91±1.37a
6 week 37.92±0.40abc -0.78±0.21a 2.29±0.36ab -2.36±0.29abc
PHE
0 week 24.78±0.25a 1.40±0.74a 5.22±0.80a 0.00±0.00b
1 week 25.76±0.07ab 1.84±0.19a 5.45±0.55a -1.15±0.05ab
2 week 28.59±1.41c 3.80±0.38b 8.23±1.00bc -3.67±1.29a
3 week 26.59±1.92abc 3.33±0.53b 8.49±1.49cd -1.68±1.83ab
4 week 25.87±2.93abc 3.51±1.13b 6.93±2.24ab -1.07±2.91ab
5 week 28.24±1.62bc 3.49±0.66b 9.87±0.23d -3.22±1.53ab
6 week 25.69±0.15ab 3.37±0.12b 8.61±0.77bcd -0.82±0.10b
40℃
BsE
0 week 35.89±0.22b 1.82±0.66abc 1.64±0.33a 0.00±0.00c
1 week 36.51±1.06bc 1.54±0.19bc 3.62±0.05c -0.88±0.78bc
2 week 29.98±2.20a 2.06±1.91c 1.09±0.54a 5.67±1.86d
3 week 35.09±1.07b 0.97±0.76abc 2.54±0.07b 0.52±0.63c
4 week 40.31±0.86d -0.18±0.39ab 2.49±0.45b -4.72±0.56a
5 week 38.79±0.14cd -0.54±0.20a 2.29±0.46b -3.23±0.36ab
6 week 39.59±1.13d -0.72±0.11a 2.90±0.33b 4.02±0.86a
PHE
0 week 24.78±0.25ab 1.40±0.74a 5.22±0.80a 0.00±0.00ab
1 week 24.94±2.08ab 1.18±0.27a 5.58±0.40a 0.34±2.05b
2 week 28.03±1.54c 3.66±0.50c 7.40±0.53ab -3.20±1.44a
3 week 26.55±2.14bc 3.22±0.05c 8.92±1.27b -1.61±2.19ab
4 week 24.37±0.52ab 3.35±0.77c 9.44±3.02b 0.65±0.21b
5 week 23.80±0.45a 2.17±0.28b 6.06±0.32ab 0.82±0.40ab
6 week 28.09±0.66c 3.18±0.49c 8.63±3.93c -3.14±0.92a
PHE; BsE + enzymatic treated Cheonnyuncho extracts, AH; Absolute humidity, RH; relative
humidity.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 129
요약 및 결론
천년초(Opuntia humifusa)는 충남 아산지역에서 대량 재배되는 선인장으로서, 제주도의 백년
초가 길고 굵은 가시가 많고 1-2 m까지 자라는 반면, 솜털 가시를 가지며 약 30 cm로 자란다.
여름에는 물을 가까이 하여 성장 번식하고, 휴면기인 겨울에는 비닐하우스가 없는 노지에서도 생
존하며, 병충해에 강한 특징을 지니고 있다.
다양한 생리활성을 지닌 것으로 알려진 천년초에 대한 가공식품의 개발 및 연구를 위해서는 먼
저 천년초의 주성분인 펙틴에 의한 점성으로 인한 문제점을 개선해야 하는데, 본 연구팀은 선행
연구를 통하여 효소처리를 통해 점성이 제거된 천년초 가공소재를 개발하였다. 이에 이 연구는 개
발된 소재를 사용하여 천년초 기능성 화장품과 미용음료로서의 소재 가능성을 평가하기 위해 시행
하였다.
먼저, in vitro 상에서 항 산화 활성과 피부 보호 효과를 실험한 결과, 피부 미백과 주름 개선
효과는 거의 미비한 것으로 나타났다. 천년초는 keratinocyte를 사용해 세포 실험을 하여 mRNA
발현을 확인한 결과, 천년초는 보습에 필수적인 HA를 합성하는 HAS의 발현을 증진시키고 HA를
분해하는 HYAL 발현은 저해시키는 효과가 있음을 확인하였다. 6 주령 hairless mouse에 10 주
간 처치한 결과, 먹기군과 먹고 바르기 군, 바르기 군의 낮은 농도에서 수분증발량이 감소하는 것
을 확인하였다. UV 처치에 따라 Normal control의 히아루론산 분해효소인 HYAL-1,2의
m-RNA 발현양이 증가하였다. 천년초 처치군의 경우, 높은 농도의 먹기와 바르기 먹고 바르기
경우에서 HAS와 HYAL의 발현량이 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 또한, ELISA로 확인한 히아루
론산의 함량을 보면 UV처치에 따라 높아지는 것으로 확인되는데 이는 UV처치가 히아루론산을 분
해시키고 이에 따라 새로운 히아론산이 합성되면서 분해된 히아루론산과 합해져 높은 함량을 나타
낸 것으로 보인다. 이는 IHC에서도 히아루론산 바인딩 단백질인 CD44와 HYBP에서도 같은 경향
을 나타냈다. 따라서, UVB로 인한 피부 장벽 파괴와 보습 기능 저하를 천년초 처치로써 방지할
수 있다는 결과를 얻었다.
기능성 화장품과 미용음료 소재 적용에 있어서 천년초의 효능도 물론 중요하지만 피부 안전성
또한 매우 중요하다. 그 때문에 본 연구팀은 사람의 피부와 가장 유사하다고 알려진 기니픽으로
피부 자극성, 피부 감작성 시험을 수행하였다. 그 결과, 천년초는 화장품 사용 예정량의 10 배의
농도로 처치하였음에도 불구하고 발적, 홍반, 부종 등의 부정적인 결과가 나타나지 않고 피부에
130 2013년 기초연구과제총서
적용하였을 때 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다. 또한, 천년초 추출물과 base essence를 섞어
만든 화장품의 안정성 실험도 6 주간 시행하였다. 25℃와 40℃에서 천년초 추출물 화장품은 변성
됨이 없이 약간의 색차만 나타내고 안정하다는 결과를 얻을 수 있었다. 이상의 결과에 의해, 천년
초는 피부 보습에 매우 뛰어난 효과를 지니고 있어 기능성 화장품과 미용음료로서의 소재 개발 가
능성이 충분하다고 보여진다. 게다가, 피부에 적용하였을 때 안전하고 장기 보관 시 안정한 물질
로 판명되어 기능성 화장품과 미용음료로서 사용이 가능하다고 보여진다.
천년초 추출물의 Inner Beauty 소재화 131
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