조 단백질의 정량

[호텔조리장]

조단백질의 정량

• 단백질은 각종 아미노산으로 구성되어 있으며 그 분자 중에는 질소를 함유하고 있는 것이 단백질의 특징중의 하나.
• 단백질 중의 질소함량은 식품의 종류에 따라 대체로 일정하므로 kjeldahl법을 이용하여 질소를 정량한 후 단백질량으로 환산하면 식품중의 단백 질량을 알 수 있다.

  1. kjeldahl법의 원리

• 시료를 진한 황산 및 촉매로 강하게 가열하여 시료중의 유기물을 분해 하고 질소를 황산 암모니아로 바꾼다음 과잉의 알칼리를 가하여 증류하고 유출되는 암모니아를 일정량의 산에 흡수시킨 후 이의 양을 적정
• 이 방법은 단백질의 질소 뿐만 아니라 핵산, purine 및 pyrimidine염기의 유도체, amide화합물, 요소(urea), creatin 등도 포함되므로 조단백질이라 한다.
• kjeldahl법으로 조단백질을 정량할 경우 시료의 종류에 따른 오차가 생길 수 있으므로 FAO에서는 조단백질 산출용 질소계수(nitrogen coefficient)를 정함
• 식품의 질소계수 - 단백질의 질소함량에 따라 즉, 단백질의 종류에 따라 다르다.
• 질소계수
  • 그러나 단백질은 평균 16%의 질소를 함유
    단백질 100g 중의 질소의 양이 16g이므로 보통 질소계수는 → 6.25(100/16)로 계산함
  • 식품분석에 있어서 시료의 양에 큰영향을 받지 않으므로 보통 macro kjeldahl법에 따라 조단백질량을 정량하고 시료의 양이 적을 때(0.2∼0.5g)는 semi-micro kjeldahl법에 따라 정량한다.
  • (조)단백질량 = 질소량 × 6.25

  2. 조단백질 정량(macro kjeldahl법)의 원리

• 시료를 진한 황산과 촉매로 가열하면 단백질은 가수분해되어 아미노산으로 되며 이의 아미노기로부터 암모니아가 유리되어 황산과 결합하여 (NH₄)₂SO₄를 생성한다.
  이때 탄소화합물은 CO₂, H₂O, SO₂, H₂ 등의 gas로 된다. 분해후 (NH₄)₂SO₄에 과잉의 NaOH를 가하여 알칼리성으로 하고 가열하여 암모니아를 증류하여 황산(H₂SO₄) (또는 붕산)중에 흡수시킨다.
  황산(또는 붕산)에 흡수된 암모니아는 (NH₄)₂SO₄ [또는 (NH₄)H₂BO₃]의 형태로 존재하며, (NH₄)₂SO₄ [또는 (NH₄)H₂BO₃]는 수용액 중에서 잘 해리되지 않으므로 수산화나트륨(또는 염산) 표준용액으로 직접 적정할 수 있다.

1. 분해반응
   • 단백질 시료에 진한 황산(H₂SO₄)과 촉매제를 넣고 가열하면 유기물은 황산에 의해 탈수 분해됨과 동시에 산화환원이 일어나며 단백질 중의 질소는 정량적으로 암모니아로 변화하여 황산암모늄 (NH₄)₂SO₄의 형태로 분해액 중에 포집하게 된다.
     시료중의 질소(N) + H₂SO₄ + 촉매제 → (NH₄)₂SO₄ + SO₂ + CO₂ + CO + H₂O

         ★ 촉매제
     가. K₂SO₄를 촉매로 가하면 황산의 끓는점을 높여주며, SO₃를 생성하고, 탄소로부터 CO₂가 되는
         산화효과를 높여줌
     나. CuSO₄(황산구리), HgO(산화제2수은)를 소량 가하면 아미노산으로부터 암모니아를 생성하는
         반응이 대단히 촉진됨
     다. CuSO₄(황산구리)보다 HgO(산화제2수은)를 사용하면 분해 속도가 2∼3배 빠름.

2. 증류반응
   • 황산암모늄:(NH₄)₂SO₄을 물로 희석하여 여기에 과잉의 진한 수산화나트륨(NaOH)을 가하고 가열하면 암모니아(NH₃)가 발생하여 증류하게 된다.
     (NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → 2NH₃ + Na₂SO₄ + 2H₂O
3. 중화반응
   • 증류반응에서 생성된 암모니아를 일정량의 규정산 용액(황산 또는 붕산 표준용액)중에 흡수시킨다.
     2NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄
4. 적정반응
   • 잔존하는 산(과잉의 산)량을 규정 알칼리(NaOH) 용액으로 적정하여, 이 적정치로부터 질소량을 산출한다.
     H₂SO₄ + 2NaOH → Na₂SO₄ + 2H₂O

  3. 장치, 재료 및 시약

• 진한황산(비중 1.84, H₂SO₄)
• 30% NaOH : NaOH 30g을 칭량하고 소량의 물을 넣고 진탕하여 녹인 후 물 100ml로 mess up
• 분해촉진제(K₂SO₄ : CuSO₄ = 9 : 1 의 혼합분말) : 막자사발로 분쇄하여 조제
• N/10 H₂SO₄
• N/10 NaOH
• 혼합지시약 (0.1% methyl red : 0.1% methylene blue = 2 : 1)
• 200ml kjeldahl flask
• 가열기구 (분해장치)와 증류장치
• 시료 : 밀가루(중력분 1g)
• 뷰렛 (25 or 50ml)
• 피펫, 필라
• 100ml mess flask
• 비등석 or 분말아연(boiling chips)

  4. 실험방법

1. 분해
   • 시료 1∼5g(질소 10mg에 상당 하는 양)을 정확히 칭량(고체일 경우 파라핀지 사용)

         ★ 밀가루(중력분)의 경우
     8.6g(단백질) / 100g(밀가루) → 0.086g(단) / 1g(밀)
     질소량 = 단백질량 / 6.25 = 0.086g / 6.25 = 0.01376g(질소) / 1g(밀)
                = 13.76mg(질소)/1g(밀)

   • 200ml keldahl flask에 넣음(이때 시료가 flask에 부착되지 않도록 주의)
   • 여기에 분해촉진제 0.5g, 진한황산 10ml를 가하고
   • draft실(hood내) 또는 분해대 중에서 천천히 가열하여 비등 후 방냉
   • 동시에 다른 분해flask에 시료없이 공시험을 행함

     가. 분해병을 분해대에 올려눟고 가스불을 약하게 하여 약 30분간 가열(시료용액의 색: 흑갈색)
         - 분해가 시작되면 탄소가 유리되어 나중에는 흑색점조하게 되므로 내용물이 넘치지 않도록 주의
           하여 처음에는 약하게 가열하여 거품이 발생하지 않으면 강하게 가열하여 가열분해 한다.
     나. 가스불을 약간 강하게 한다.(갈색)
     다. 가스불을 강하게 한다.(황색)
     라. 시료용액의 색이 담록색으로 된후 (공시험: 10분, 시료: 1시간 소요됨) 약 1시간 더 가열하여 불을
          끈다.
         - 반응이 진행됨에 따라 탄소는 CO₂로 되어 비산하고 액은 투명하게 되어 담록색으로 됨
     마. 10∼15분간 방냉. (상온이 될 때까지) : 담록색→백색
         (※ 공시험의 경우 유기물을 함유하지 않을 때에는 처음부터 청색이 된다.)

   • 염류의 결정이 석출되지 않도록 증류수 20ml를 주의하여 첨가
   • 100ml mess flask에 위 용액을 씻으면서 넣고 방냉후 표준선까지 증류수를 넣어서 100ml로 mess up. : 백색→담청색 (희석한 분해시료 용액)
   
   킬달 분해장치
2. 증류 및 중화

   Semimicro Kjeldahl 증류장치

   A : 수증기 발생장치 B : 역류병 C : 증류플라스크 D : 냉각관 E : 수기 F : 깔대기 G : 냉각관 선단 a, b, c, d : 콕

   • 증류 플라스크(C)에 시료액 대신 증류수를 넣어서 약 20분간 증류하여 증류 플라스크(C), 냉각관(D) 내부를 세정해 둔다.
   • 둥근 플라스크에 증류수 2/3, 비등석(끓임쪽) 수개 또는 한쪽 끝이 막힌 모세관(돌비를 막기 위해), 진한황산 몇방울(∵암모니아 존재시 위험)을 가하여 미산성이 되게 함
   • 여기에 희석한 분해시료 용액 10ml (100ml중의 10ml이므로 희석배수는 10이 됨)를 취하여 깔대기(F)를 통해 증류 플라스크(C)에 주입
   • 냉각관(D)의 하부에 있는 200ml용 삼각 플라스크(E)에 N/10 황산용액 10ml를 취하고 지시약 2∼3방울을 가하여 냉각관(D)의 끝부분이 N/10 황산용액 중에 침지되도록 장치 고정
   • 최후에 분해 플라스크 심부에 눈금이 부착된 깔대기(F)로 부터 30% 수산화나트륨 용액 10ml를 가하여 용액을 강알칼리성으로 한다.
   • 코크 b를 열고 a와 c를 닫아 수증기가 통하면 점차적으로 증류 플라스크(C)중의 용액은 비등상태로 되어 암모니아가 발생하여 수증기와 같이 냉각관을 통하면서 냉각되어 N/10 황산용액 중(△-플라스크 : E)에 포집됨
   • 15∼20분간 증류하여 암모니아가 완전히 증류하였는지를 (적색 리트머스지로서) 확인한 후에 △-플라스크를 냉각관의 끝부분에서 약간 떼어(냉각관의 끝이 액면 위로 오게 하고) 다시 2∼3분간 증류를 계속
   • 냉각관(C)의 끝부분을 증류수로 잘 세척하여(세액은 △-플라스크에 받는다.) △-플라스크를 냉각관에서 떼어낸다.
   • 그 후 불을 약하게 하고(or 불을 끄고) 시간이 조금 경과한후(10∼20초) 코크 a를 열고 코크b를 닫아 증류 플라스크(C)의 액을 역류병(B)으로 역류하게 한다.
3. 적 정
   • 암모니아를 포집한 △-플라스크 중에 잔존하고 있는 N/10 황산용액에 혼합지시약(methyl red : methylene blue = 2 : 1)을 넣고 N/10 수산화나트륨(NaOH)용액으로 적정 (종말점: 담초록)
   • 이렇게 하면 암모니아에 의해서 중화한 N/10 황산용액의 용량을 알 수 있다.
   • 이상의 조작과 같게 별도로 바탕시험(공시험)을 행한다.
4. 계 산
   
   
   • a : 본시험에 대한 N/10 NaOH 용액의 적정치(ml)
   • b : 공시험에 대한 N/10 NaOH 용액의 적정치(ml)
   • S : 시료의 평취량(g)
   • F : N/10-NaOH 용액의 역가(g)
   • V : 희석배수
   • 0.0014 : N/10-NaOH 용액 1ml에 상당하는 질소량(g)

  5. 연습문제

1. 일반적으로 식품의 조단백질 정량에 있어서 질소계수는 얼마인가?
2. 조단백질 정량에 있어서 분해촉매로 가하는 K₂SO₄ 와 CuSO₄의 혼합비율은 얼마인가?
3. 시료가 진한황산으로 분해되었을 때 시료중의 질소는 어떠한 형태로 존재하는가?
4. N/10-H₂SO₄ 용액을 수기에 넣었을 때 보통 사용하는 혼합지시약은 무엇인가?
5. 분해병에 취하는 시료의 적당량은 시료중의 질소함량이 어느 정도가 좋은가?
6. 필요에 따라 시료를 전혀 넣지 않고 시약만으로 똑같은 조작을 실시하는 것을 무엇이라 하나?
7. N/10-H₂SO₄ 용액을 수기에 넣고 분해액을 증류하여 암모니아를 유출시킨 후 적정하는 표준용액은 무엇인가?
8. 분해액을 증류하여 암모니아를 유출시키기 위하여 가하는 시약은 무엇인가?

[폐리소나]

시험준비를 위하여 스크랩합니다.수고하셨습니다