초고속 원심 분리법 및 3종 Kit를 통해 분리된 혈청 유래 Exocome의 Zetaview®를 이용한 분석

[With위드인스트루먼트]

초고속 원심 분리법 및 3종 Kit를 통해 분리된 혈청 유래 Exocome의 Zetaview®를 이용한 분석

안녕하세요.

Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점, 위드인스트루먼트입니다.

이번 포스팅에서는 Zetaview를 활용하여 초고속 원심분리법과

3가지 Exosome Kit로 분리한 혈청 유래 Exosome 비교 연구 내용을 분석했습니다.

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Exosome은 세포 간 신호 전달 및 Biomarker 역할을 하기 때문에

신뢰할 수 있을 품질의 Exosome을 얻어내기 위한 과정이 가장 중요합니다.

초고속 원심분리 (Ultracentrifuge[UC]) 법과 추가적으로 세 가지 Exosome isolation kit

[miRCURY, ExoQuick, TEIR(Total Exosome Isolation Reagent)]를 통해 비교하였고 

암에 걸리지 않은 사람의 혈청을 6가지 용량으로 사용했습니다(5㎖, 1㎖, 500㎕, 250㎕, 100㎕, 50㎕).

그리고 6종류의 상업적으로 판매하는 혈청 Sample을 각각

3가지 용량으로 사용했습니다(1㎖, 500㎕, 100㎕).

추출한 Exosome은 Zetaview를 사용한 Nanoparticle tracking analysis(NTA), 

Westren blot, 투과 전자 현미경 (Transmission electron microscopy[TEM]), 

droplet digital PCR을 각각 사용하여 확인해 보았습니다.

Zetaview 결과를 통하여 기존 연구의 연구들과 같이 Exosome Size의 mean 값의 범위는

(40-150nm)였다는 것을 확인하였고, 3가지 kits를 사용하여 얻은 Exosome의 양은

UC를 통해 얻은 Exosome의 양보다 80 ~ 300배 정도 차이 나는 양을 확인했습니다.

Zetaview를 이용한 Exosome total number of particles의 측정 결과입니다.

miRCURY(파랑), ExoQuick(초록), TEIR(빨강)[왼쪽 Y 축], UC(노랑)[오른쪽 Y 축]

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[ Western blot 결과 ]

Western blot을 통해 Exosome의 분리를 확인할 수 있는 Exosome membrane

protein marker인 CD63, CD9을 통해 분리한 Exosome을 검증하는 과정입니다.

✅ A: 동일하게 각각 10㎕의 단백질 Sample을 가지고 진행한 결과입니다.

✅ B: 측정이 되지 않은 UC의 단백질 양을 50㎕(5배) Sample을 가지고 진행한 결과입니다.

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[ TEM 촬영 결과 ]

염색하지 않은 결과, CD63, CD9을 Immunogold labeling을 진행한 결과이며

scale bar는 100nm 사이즈로 Exosome의 분리를 확인할 수 있는 Exosome membrane

protein marker인 CD63, CD9을 통해 분리한 Exosome을 검증하는 과정입니다.

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[ Zetaview를 이용한 Zeta Potential의 측정결과 ]

TEIR을 제외한 나머지 Sample 들에서 Original Volume의 증가함에 따라

Zeta Potential의 절대 값이 덜어지는 것을 확인할 수 있었습니다.

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[ exRNA vs Sample Volume ]

각 혈청의 Volume에 대한 여러 방법의 exRNA(Extracellular RNA) 양은

유의미한 차이는 보이지 않았고, 5ml에서 추출한 Exosome은 다른 혈청 Volume에서

나온 것보다 3배 이상의 exRNA를 포함했지만 시작 Volume 과의 연관은 없어 보였고,

다른 Volume들 사이에서도 큰 차이는 나타나지 않았습니다.

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[ Droplet Digital PCR 결과 [

RNA 분리 이후 miR-16과 miR-451의 발현 양을 Droplet Digital PCR을 사용하여 확인한 결과입니다.

miR-16과 miR-451은 혈청 Exosome에 존재한다 알려져 있고 이전에 Exosome 분리 기술의

효율성을 평가하는 데 사용됩니다.

키트에서 추출한 Exosome의 양이 UC보다 훨씬 더 많은 양의 입자 수를 분리했지만,

추출된 exRNA의 양에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였습니다.

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이번 실험의 결론은 키트 유래 Exosome은 UC 유래 Exosome과 비교했을 때 

80 ~ 300배 정도 더 많은 양의 입자 수를 얻을 수 있는 것을 확인할 수 있었으며, 

추가적으로 그 입자 수의 Exosome 들을 활용하여 Western blotting을 진행하였을 때

 더 많은 단백질 양을 갖고 있는 것을 확인하여 단백질을 활용한 분석에 있어서는 

조금 더 우세한 면을 확인할 수 있었지만 입자의 Zeta Potential이나 TEM 분석으로는

 다른 점을 찾기에 쉽지 않았고 Exosome의 exRNA와 Exosome과 연관된 RNA의

양의 분석에 있어서는 입자 수와 관계없이 키트를 사용한 분리 방법과 UC를 이용한

분리 방법이 큰 차이를 내지 않는 것을 확인했습니다.

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