EVs를 Membrane dye[Cell Mask Green]로 형광 염색 절차 및 Zetaview®를 이용한 분석 절차

[With위드인스트루먼트]

안녕하세요^^

Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점 위드인스트루먼트입니다.

이번 포스팅에서는 Zetaview를 활용하여 EVs[Extracellular Vesicles] membrane dye의

형광 염색 절차와 Zetaview를 이용한 측정 절차를 설명 드리겠습니다.

실험 준비물

1, Fresh EVs 혹은 동결건조 EVs 100㎍ (HCT116 cell, HBM-HCT-100. Hansa Biomed Life Science)
2. Cell Mask™ Green (CMG), C37608. Life Technology
3. Particle free PBS (혹은 다른 설정된 buffer)
4. Zetaview NTA[model PMX x20이상] 형광 추적 기능이 있고, 488nm laser가 장착된

   기기와 형광 polystyrene beads (#120-0102, YG488, Particle Metrix)

기기 준비

Zetaview Start-up routine을 진행합니다.
TG488 polystyrene particles를 사용하여 적절한 sactter, 형광 모드의 조정을 진행합니다.
Scatter, 형광에서 동일한 수의 입자가 count 되는 것을 목표로 설정을 진행합니다.

Buffer의 background 확인

Buffer를 최소 30초동안 Cell에 흘려서 안정시킵니다.
3~5ml의 buffer를 syringe를 사용하여 injection port에 주입합니다.
장비 설정을 동일하게 설정해둔 상태에서 scatter, 형광 모드에서 각각 background 신호가
잡히는지 확인을 진행합니다.

아래 표와 같이 setting을 준비하고 manual을 참고하여 자세한 내용을 확인하세요.
Background particle수 가 10~20 이상이라면 물이나 buffer를 교체합니다.

EVs의 농도 결정 (scatter mode)

동결된 EVs를 재복원을 합니다.
자세한 사항은 제조자 정보에 따라 재복원과정을 진행합니다.
EVs의 최적의 희석농도를 찾기 위해 화면에 대략 200개 정도의 입자를 목표로 세팅합니다.

성공적으로 재구성된 EVs의 농도는 1:2000배 희석정도로 예상합니다.
희석된 EVs를 주사합니다. Bubble이 없고 균일하게 모든 포지션에 위치하면 측정을 진행합니다.

Background check of dye

최고 농도를 확정하기 위해 염료를 buffer에 연속 희석한 상태로 준비하고

아래 표는 PBS에 희석된 50~500ng/mL 범위의 CMG 농도가 화면에서 나타나는

모습을 보여주고 있습니다.

"a"의 경우 높은 형광 농도로 background에 결합되지 않은 dye들이 나타나며

노이즈가 발생되어 측정이 불가능합니다.

"b"의 경우도 높은 농도로 희석이 되어있고 노이즈가 화면에 나타나는 것과

이미지의 강도(intensity)도 감소했습니다.

적절한 조건은 "c"와 "d"사이 농도이며, 형광모드에서 표백 안된 sample이 5개

안쪽으로 들어오도록 합니다. Scatter모드, 형광모드 모두에서 항체의 응집이

나타나지 않은 것을 확인합니다.

가끔 정확한 dye의 농도를 모를 수 있습니다.

그러므로 그런 경우 언급된 희석보다 더 부분적으로 희석을 해야합니다.

최대 농도는 Zetaview기기 마다 다를 수 있습니다.

EVs 염색

Scatter 모드에서 EV의 농도 및 필요한 희석농도를 결정합니다.

(일반적으로 동결 건조 EV에서 1:2000)

Dye의 최대 농도를 결정해줍니다. (일반적으로 CMG의 경우 1:50,000 이상)

CMG선제 희석 준비 : 8㎕ buffer 와 2㎕ CMG를 섞어 1/5로 선제 희석을 합니다.

9㎕의 EVs (2x10^11mL 농도 이상)에 1㎕의 선제 희석된 CMG를 넣습니다.

조심스럽게 pipetting 해주고 spin down을 통해 bubble을 제거해줍니다.

상온에서 2시간 동안 암실 보관합니다.

갖고 있는 Evs sample의 농도에 따라 위의 표에 맞추어 선제 희석과

희석 배수를 참고하시기 바랍니다.

염색된 EVs의 형광 측정

EVs를 보관 단계 이후 희석한 후 주사합니다.

고르게 채워진 것을 확인해줍니다.

염색된 EV를 형광 scatter 모드에서 각각 측정 진행해줍니다.

(* 처음 표의 setting값을 참고해주세요.)

형광의 %은 계산할 수 있습니다.

형광모드 측정치 CF와 scatter 모드 측정치 CS의 비교로

위 공식을 통해 형광 염색율을 계산할 수 있습니다.

형광 비율의 표준편차 (△%F)의 계산은 위의 식에 따라 계산할 수 있습니다.

△CF(형광 표준편차), △CS(Scatter 표준편차)

실험의 프로토콜 최적화를 위한 권장 사항

최적의 dye의 농도가 다를 수 있습니다.

최대 설정 농도와 유사하게 다른 농도로도 시도하시길 바랍니다.

Background signal은 낮은 상태로 유지하세요.

Control을 사용하여 결합되지 않은 형광의 간섭이 일어나지 않는지 확인하기 바랍니다.

%F값은 여러 번 희석을 통해 안정적인 염색 이후 값을 확립할 수 있습니다.

염색 과정의 2시간 암실 보관하는 시간이 결과에 영향을 줍니다.

여러가지 다른 보관 시간을 시도하시길 바랍니다, 최소 보관 시간은 30분입니다.

낮은 형광 염색율의 경우, 염색에 높은 농도의 EV를 사용하여 형광모드 측정에서

입자의 통계적으로 유의한 수를 얻으세요.

일부 단백질들은 염색을 방해될 수 있다는 점도 명심하세요.

CMG의 자세한 기술적 datasheet는 제조사 정보를 참조하시기 바랍니다.

형광 측정을 위한 권장 사항

Scatter와 형광 채널에서 선명한 이미지를 확보하고 온도의 변동 때문에

매일 refocus를 권장합니다.

Zetaview기기의 “anti-bleach” 기능을 사용하세요.

bleaching이 일어나지 않은 sample을 밀어 샘플들이 laser에

가능한 적게 노출되도록 해줍니다.

Free dye가 Chamber 안에 없는 것을 확인하세요.

다른 sample에 염색을 유발할 수 있습니다. 정기적으로 청소해야 합니다.

재현성을 높이기 위한 권장 사항

먼지에 노출되지 않게 해주세요.

(powder free gloves 사용, 미리 닦은 microcentrifuge tubes 사용)

희석이나 세척할 때 새로운 falcon tube 사용하기.

Buffer 보관함에서 직접 pipetting하는것은 background 입자량을 증가시킬 수 있습니다.

Low-bind pipette tips을 사용하고 microcentrifuge caps을 작게 해서 모세관력,

pipette tip의 습윤성으로 인한 sample의 손실과 pipetting 오류를 최소화합니다.

농도 작업 범위의 선형성 확인: sample을 다양한 희석배수로 측정하고, 통계적 평가를 위해

3번을 같은 희석을 진행합니다.

Sample의 과도한 흔들림, vortexing을 피해주세요.

nanobubble 이 생성되어 측정 값에 변수가 될 수 있습니다.

Sample과 Sample 사이 세척 과정을 거치고, 새 샘플을 주입하기 전에

입자가 없는 상태를 확인합니다.

Background count가 높다면 주입구를 교체하고, Zetaview cell assembly를 manual 세척합니다.

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장비에 대한 문의 사항이 있으시면 아래 연락처로 연락주시기 바랍니다.

감사합니다.