EVs에 3종 antibody labelling 후 Zetaview®를 이용한 분석 절차

[With위드인스트루먼트]

안녕하세요.

Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점, 위드인스트루먼트입니다.

이번 포스팅에서는 EVs[Extracellular Vesicles]에 3가지 Tetraspanins (membrane protein

antibody, CD9, CD3, CD81)를 이용하여 Alexa488로 형광 염색하는 절차와 Zetaview를

이용한 측정 절차를 설명 드리겠습니다.

실험 준비

1. Fresh EVs 혹은 동결건조 EVs 100ug (HCT116 cell, HBM-HCT-100. Hansa Biomed Life Science)

2. Yellow-green 형광 polystyrene beads (#700092, YG-488, Particle Merix)

3. Particle free PBS (혹은 다른 설정된 Buffer)

4. Antiblodies

Antibody	Clone	Company	Fluorochrome	Estimated minimum dilution
CD9 antibody	#209306	R&D Systems	Alexa 488	1 : 50,000
CD63 antibody	H5C6	Novus	Alexa 488	1 : 50,000
CD81 antibody	#454720	R&D Systems	Alexa 488	1 : 50,000

기기 준비

1. Zetaview start-up routine을 진행합니다.

2. YG-488 polystyrene particles를 사용하여 적절한 scatter, 형광 모드의 조정을 진행합니다.

3. Scatter, 형광에서 동일한 수의 입자가 count 되는 것을 목표로 설정을 진행합니다.

Buffer의 background 확인

1. Buffer를 최소 30초동안 Cell에 흘려서 안정시킵니다.

2. 3~5ml의 buffer를 syringe를 사용하여 injection port에 주입합니다.

3. 장비 설정을 동일하게 설정해둔 상태에서 scatter, 형광모드에서 각각 background 신호가 잡히는지 확인을 진행합니다.

4. 아래표와 같이 setting을 준비하고 manual을 참고하여 자세한 내용을 확인하세요.

5. Background particle 수가 10~20 이상이라면 물이나 buffer를 교제합니다.

EVs의 농도 결정

1. 직전 추출한 EVs를 사용 혹은 동결된 EVs를 재복원을 합니다.

2. 자세한 사항은 제조자 정보에 따라 재복원 과정을 진행합니다.

3. 재복원을 할 때 입자가 업는 물을 사용하여 침전물이 완전히 녹은 것을 확인합니다.

4. EVs의 최적의 희석 농도를 찾기 위해, 화면에 대략 200개 정도의 입자를 목표로 세팅을 합니다.

   성공적으로 재구성된 EVs의 농도는 약 1:2000배 희석 배율이 예상합니다.

5. 희석 된 EVs를 주입합니다. Bubble이 없고 균일하게 모든 포지션에 위치하면 측정을 진행합니다.

Background check of antibody

1. Antibody를 datasheet에 나타난 수치와 맞추기 위해 1:10 Pre-dilution [선제 희석]을 진행합니다.

2. Mean intensity 값이 형광모드에서 7미만임을 확인합니다.

3. Scatter mode에서 형광 antibody 희석액이 25개 미만으로 나타나는 것을 확인합니다.

EVs 염색

1. Scatter 모드에서 EV의 농도 및 필요한 희석 농도를 결정합니다.

    (일반적으로 동결 건조 EV에서 1:2000)

2. 필요한 antibody의 양을 측정합니다.

3. Buffer 2uL에 1uL의 CD9 antibody (1:10) 희석액을 추가합니다.

4. 1uL의 CD63 antibody(1:10) 희석액을 추가합니다.

5. 1uL의 CD81 antibody(1:10) 희석액을 추가합니다.

6. Pipette을 사용하여 조심스럽게 섞어줍니다. (pipette 3uL setting)

7. EV sample [2x10^10/mL 농도]을 5uL 추가해줍니다.

8. Pipette을 사용하여 조심스럽게 섞어줍니다. (pipette 8uL setting)

9. Sample을 Spin down하여 bubble을 제거합니다.

10. 암실에서 2.5시간 이상 보관합니다.

염색 된 EVs의 형광 측정

1. EVs를 보관 단계 이후 희석한 후 주사합니다.

2. 샘플이 Sample Cell의 11 positions에 고르게 채워진 것을 확인해줍니다.

3. 염색된 EV를 형광과 scatter 모드에서 각각 측정 진행해줍니다.

    (*처음 표의 setting값을 참고해주세요.)

형광 염색율은 형광모드 측정치 CF와 scatter 모드 측정치 CS의 비교로 계산할 수 있습니다.

위 공식을 통해 형광 염색율을 계산할 수 있습니다.

형광 비율의 표준편차(△%F)의 계산은 위의 식에 따라 계산할 수 있습니다.

△CF(형광 표준편차), △CS(Scatter 표준편차)

실험의 프로토콜 최적화를 위한 권장 사항

1. 최적의 antibody의 농도가 다를 수 있으므로, 최대 설정 농도와 유사하게 다른 농도로도 시도하시길 바랍니다.

2. Background signal은 낮은 상태로 유지하세요.

3. Control을 사용하여 결합되지 않은 형광의 간섭이 일어나지 않는지 확안하기 바랍니다.

4. %F값은 여러 번 희석을 통해 안정적인 염색 이후 값을 확립할 수 있습니다.

5. 염색 과정의 2시간 암실 보관하는 시간이 결과에 영향을 줍니다. 여러가지 다른 보관 시간을 시도하시길 바랍니다.

   최소 보관 시간은 30분입니다.

6. 낮은 형광 염색율의 경우, 염색에 높은 농도의 EV를 사용하여 형광모드 측정에서 입자의 통계적으로 유의한 수를 얻으세요.

   일부 단백질들은 염색을 방해될 수 있다는 점도 명심하세요.

형광 측정을 위한 권장 사항

1. Scatter와 형광 채널에서 선명한 이미지를 확보하고 온도의 변동이 영향이 있을 수 있어 매일 refocus를 권장합니다.

2. Zetaveiw 소프트웨어의 'anti-bleach' 기능을 사용하세요.

   Bleaching이 일어나지 않은 sample을 밀어 입자들이 laser에 가능한 적게 노출되도록 해줍니다.

3. Free dye가 chamber 안에 없는 것을 확인하세요. 다른 sample에 염색을 유발할 수 있습니다.

   장기적으로 청소해야 합니다.

재현성을 높이기 위한 권장 사항

1. 먼지에 노출되지 않게 해주세요.

2. Powder free gloves 사용, 미리 닦은 microcentrifuge tubes 사용하기

3. 희석이나 세척할 때 새로운 falcon tube 사용하기

4. Buffer 보관함에서 직접 pipetting하는 것은 background 입자량을 증가시킬 수 있습니다.

5. Low-bind pipette tips을 사용하고 microcentrifuge caps을 작게 해서 모세관력, pipette tip의 습윤성으로 인한

   Sample의 손실과 pipetting 오류를 최소화합니다.

6. 농도 작업 범위의 선형성 확인 : sample을 다양한 희석배수로 측정하고, 통계적 평가를 위해 3번을 같은 희석을 진행합니다.

7. Sample의 과도한 흔들림, vortexing을 피해주세요.

8. Nanobubble이 생성되어 측정 값에 변수가 될 수 있습니다.

9. Sample과 sample 사이 세척 과정을 거치고, 새 sample을 주입하기 전에 입자가 없는 상태를 확인합니다.

10. Background count가 높다면 주입구를 교체하고, Zetaview cell assembly를 manual 세척합니다.

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장비에 대한 문의 사항이 있으시면 아래 연락처로 연락주시기 바랍니다.

감사합니다^^