☆ TPHA(Treponema pallidum hemagglutination assay)

[영범이]

☆ TPHA(Treponema pallidum hemagglutination assay) 1) 의 의 Treponema pallidum(Nichols 균주)의 균체성분을 적혈구에 흡착시킨 후 이 감작적혈구를 매독환자의 혈청 중에 가하면 적혈구에 흡착된 TP의 균체성분과 환자의 혈청 중에 존재하는 TP에 대한 항체가 반응해서 응집이 일어난다. 이 반응을 매독 Treponema 감작적혈구 응집반응(TPHA)이라 한다. 이는 간접 혈구응집 반응이다(Passive hemagglutination). 2) 기 구 ① 소시험관 및 tube rack ② pipette(첨단에 눈금이 있는 것. 0.5㎖, 1.0㎖, 10.0㎖) ③ 원심침전기(3,000 rpm 정도로 소시험관을 여러 개 넣어 원심침전 시킬 수 있는 것) ④ 적혈구 응집반응판(tray) : 아크릴 수지제로 되어있으며 직경 16㎜, 반경 8㎜의 구면을 가진 것. ⑤ 냉장고 ⑥ 교반봉 3) 시 약 ① 흡수용 시약 고정한 면양 적혈구 …………………………………………………… 0.1㎖ 건강한 토끼고환 acetone 처리분말 ………………………………… 5㎎ Treponema pallidum(Reiter 균주) 균체성분 ……………………… 0.05㎖ Arabic gum …………………………………………………………… 25㎎ Polysorbate …………………………………………………………… 0.0001㎎ Thimerosal …………………………………………………………… 1㎎ 을 0.15M 인산 완충식염수로 전량 10㎖로 희석하여 동결건조 시켜 시판되고 있으므로 사용할 때 지시서대로 증류수에 용해하여 사용한다. ② 희석용 용액 건강한 토끼혈청 ……………………………………………………… 0.25㎎ Arabic gum …………………………………………………………… 6.25㎎ Polysorbate 80 ……………………………………………………… 0.0025㎎ Thimerosal …………………………………………………………… 2.5㎎ 을 0.15M 인산 완충식염수(pH 7.2)로 전량 25㎖로 한 것. ③ 감작 적혈구 Formalin으로 고정한 면양 적혈구를 탄닌산으로 처리하고 여기에다 초음파로 파괴한 TP 균체성 분을 흡착시킨 것이다. 희석용액으로 2.5%의 비율로 부유시켜 있고, 보존을 위해서 동결건조 되어있기 때문에 사용할 때에는 지시서에 표시된 증류수를 가해서 용해한다. ④ 대조혈청(미감작 적혈구 : sheep cell로만 구성) 희석용액으로 80배로 희석한 양성 및 음성대조 혈청을 준비한다. 시판품은 동결건조 되어있다. 4) 검사방법 (1) 정성법 ① 검사혈청 0.05㎖를 정확히 소시험관에 넣는다. ② 여기에 흡수용 시약 0.95㎖를 가해서(20배 희석) 충분히 혼합한다. ③ 2∼6℃의 냉장고 속에 30분 이상 방치한다. 이 조작에 의해서 환자의 혈청 중에 포함되어있는 면양 적할구에 대한 이종응집소와 매독 이외의 Treponema(비병원성주)에 대한 항체가 흡수된다. 사람은 매독 Treponema 이외의 Treponema(비병원성)의 침입을 받는 경우가 있기 때문에 이것에 대한 항체를 흡수해 주지 않으면 비특이적으로 감작적혈구가 응집할 때가 있다. 흡수용 시약 속에는 비병원성 Treponema(Reiter 균주)의 균체성분이 포함되어 있으므로 흡수조작에 의해서 Treponema 속 공동항원에 대한 항체가 흡수된다. ④ 원심침전(2,500 rpm 5분)해서 상층을 분리한다. ⑤ 상층 0.2㎖와 희석용액 0.6㎖를 소시험관에 넣는다(1:80배 희석이 된다). ⑥ 1:80 희석혈청 0.5㎖를 pipette으로 채취하여 반응접시(tray) 속에 넣는다. ⑦ 이어서 감작적혈구 부유액 0.05㎖를 넣는다. ⑧ 반응접시를 가볍게 두들겨서 내용을 충분히 혼합한다. ⑨ 건조하지 않도록 뚜껑을 하고 반응접시를 실온에 3∼4시간 조용히 방치한 후 응집유무를 관찰 한다. ⑩ 다음날(18시간 후) 재차 관찰한다. 18시간 후에 관찰하면 응집이 뚜렷하게 되므로 판정이 용이하다. (2) 정량법 ① 흡수가 끝난 80배 혈청을 아래와 같이 4배수 희석한다. ② 4배수 희석한 혈청 0.5㎖씩을 반응접시의 well에 각각 넣는다. ③ 이어서 정성법과 똑같은 조작을 해서 응집이 일어난 최고 희석배수를 역가로 판정한다. 5) 판 정 실험이 끝난 hemagglutination tray는 흔들리지 않는 책상 위에 하얀 종이를 깔고 그 위에 조용히 올려 놓은 다음 응집여부를 관찰하여 아래와 같은 요령으로 결과를 기록한다. (-) : 붉은 세포가 중앙에 모여있고, 그 둘레에 과립의 침전이 없이 깨끗하다. (±) : 붉은 세포가 원을 만들고 있으며 원둘레가 두껍고 비교적 크다. 원둘레의 테두리는 비교적 매끄럽다. (+) : 붉은 세포의 원둘레는 주위의 많은 과립침전으로 거칠고 둘레의 두께가 얇다. (++) : 붉은 세포는 넓게 퍼져있고, 원둘레는 얇은 막으로 덮혀있는 형태로 나타난다. (+++) : 밑바닥에 넓게 퍼져서 침전되어 있고 가끔 붉은 세포의 일부는 중앙을 향하여 부분적으로 slip되어 질 수도 있다. 6) 결과의 해석 TPHA는 특이도와 예민성도 높고 재현성도 우수한 반응이지만 매독감염 초기에는 cardiolipin 항원을 사용하는 반응보다 늦게 양성으로 나타나고 또 자연치유가 되었거나 치료에 의해서 STS(Serologic test for syphilis)가 음성화 한 환자라도 양성을 나타낸다. 따라서 TPHA 단독으로 매독 이환의 유무를 판정하지 말고 STS와 조합해서 실시하여 종합판정을 해야한다. 7) 반응 실시상의 주의 ① 접시의 well이 일정하지 않으면 반응상이 변화한다. ② 접시를 진동하면 반응상이 변화하여 위음성을 나타낼 때가 있다. ③ 판정기준을 동일하게 통일시켜 놓지 않으면 판정이 상당히 애매할 때가 있다. 표. STS와 TP항원을 사용하는 반응의 종합판정 STS TPHA· FTA-ABS 해 석 - - 매독이 극히 초기나 매독 감염이 없을 때 + - 매독 감염의 초기나 erythematous 등에 의한 BFP - + 매독 감염 후 수년이 경과했거나 치료 후의 매독 또는 매독 Treponema와 공통항원을 갖는 Treponema의 감염 + + 매독이나 매독 Treponema와 공통항원을 갖는 Treponema에 의한 감염