Re: 3일 금식이 면역에 미치는 영향 .. 2021..

[문형철]

\

Aging Cell

. 2021 Oct 27;20(11):e13507. doi: 10.1111/acel.13507

Innate immune remodeling by short‐term intensive fasting

Jiawei Qian 1,2, Yixuan Fang 1,2,3, Na Yuan 1,2,3, Xueqin Gao 1, Yaqi Lv 1,2, Chen Zhao 1,2, Suping Zhang 1,2,3, Quan Li 1, Lei Li 1,2, Li Xu 1,2, Wen Wei 1,2, Jianrong Wang 1,2,3,✉

• Author information
• Article notes
• Copyright and License information

PMCID: PMC8590100  PMID: 34705313

Abstract

Previous studies have shown that long‐term light or moderate fasting such as intermittent fasting can improve health and prolong lifespan. However, in humans short‐term intensive fasting, a complete water‐only fasting has little been studied. Here, we used multi‐omics tools to eval‎uate the impact of short‐term intensive fasting on immune function by comparison of the CD45+ leukocytes from the fasting subjects before and after 72‐h fasting. Transcriptomic and proteomic profiling of CD45+ leukocytes revealed extensive expression‎ changes, marked by higher gene upregulation than downregulation after fasting. Functional enrichment of differentially expressed genes and proteins exposed several pathways critical to metabolic and immune cell functions. Specifically, short‐term intensive fasting enhanced autophagy levels through upregulation of key members involved in the upstream signals and within the autophagy machinery, whereas apoptosis was reduced by down‐turning of apoptotic gene expression‎, thereby increasing the leukocyte viability. When focusing on specific leukocyte populations, peripheral neutrophils are noticeably increased by short‐term intensive fasting. Finally, proteomic analysis of leukocytes showed that short‐term intensive fasting not only increased neutrophil degranulation, but also increased cytokine secretion. Our results suggest that short‐term intensive fasting boost immune function, in particular innate immune function, at least in part by remodeling leukocytes expression‎ profile.

초록

이전 연구들은 장기적인 가벼운-중간강도 간헐적 단식 같은 

중간 강도의 단식이 건강을 개선하고 수명을 연장할 수 있음을 보여주었습니다. 

그러나 

인간에서 단기적인 강도 높은 단식, 

즉 완전한 물만 섭취하는 단식에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았습니다. 

본 연구에서는 

단기적인 강도 높은 단식이 면역 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해 

단식 전후 72시간 동안 단식한 대상자의 CD45+ 백혈구를 비교하여 

다중 오믹스 도구를 사용했습니다. 

CD45+ 백혈구의 전사체 및 단백질체 프로파일링 결과, 

단식 후 유전자 발현이 억제되는 것보다 활성화되는 것이 더 두드러지는 광범위한 발현 변화가 나타났습니다. 

발현이 차이나는 유전자와 단백질의 기능적 농축을 통해 

대사 및 면역 세포 기능에 중요한 여러 경로를 확인할 수 있었습니다. 

구체적으로, 

단기 집중 단식은 상류 신호 및 자가포식 기전에 관여하는 주요 구성 요소의 발현을 활성화하여 

자가포식 수준을 높이는 반면, 

세포 사멸 유전자의 발현을 억제하여 세포 사멸을 감소시켜 백혈구 생존력을 높였습니다. 

특정 백혈구 군집에 초점을 맞출 때, 

단기 집중적 금식은 말초 중성구 수를 현저히 증가시켰습니다. 

마지막으로, 

백혈구의 프로테오믹 분석 결과, 단기 집중적 금식은 

중성구의 분비체 방출을 증가시킬 뿐만 아니라 사이토킨 분비도 증가시켰습니다. 

본 연구 결과는 단기 집중적 금식이 백혈구의 발현 프로필을 재구성함으로써

 면역 기능을, 특히 선천성 면역 기능을 부분적으로 강화한다는 것을 시사합니다.

Keywords: fasting, human, innate immunity, longevity, neutrophils

---

Short‐term intensive fasting remodels innate immunity in humans through improving neutrophil function with elevated secretion of cytokines, together with upregulation of autophagy and downregulation of apoptosis.

---

AbbreviationsBFS

breadth first search

DAG

directed acyclic graph

DEG

differentially expressed genes

DEP

differentially expressed proteins

DFS

depth first search

F.T.

Francisella tularensis

FDR

false‐discovery rate

GSEA

gene set enrichment analysis

PMA

para‐methoxyamphetamine

SigDEG(s)

an intersection of unpaired and paired analysis differentially expressed gene(s)

sigDEP(s)

an intersection of unpaired and paired analysis differentially expressed protein(s)

1. INTRODUCTION

Fasting has been considered an effective non‐medical intervention for fitness and delaying of aging agenda. Light or moderate fasting belongs to incomplete fasting format and mainly consists of intermittent fasting, fasting‐mimicking diets, and calorie restriction. The positive health benefits of incomplete fasting have been well documented (de Cabo & Mattson, 2019). Incomplete fasting was reported to reduce obesity (Bloom, 1959), cardiovascular diseases (Horne et al., 2008, 2013; Most et al., 2018), cancer (Ajona et al., 2020; Di Biase et al., 2016; Nencioni et al., 2018; Pietrocola et al., 2016; Yamaza et al., 2010), rheumatoid arthritis (Kjeldsen‐Kragh et al., 1991), metabolic syndrome (Steiniger et al., 2009), osteoarthritis (Schmidt et al., 2010), fibromyalgia(Michalsen et al., 2013), and improve memory (Witte et al., 2009). Through the use of animal fasting models, the mechanism of such health benefits has been becoming clear, such as regulation via ketogenesis (Capozzi et al., 2020; López‐Soldado et al., 2020; Steinhauser et al., 2018), hormone modulation (Fontana et al., 2016; Sutton et al., 2018; Volek et al., 2002), circadian clock (Gill et al., 2015), and gut microbiota changes that protect the central nervous system in autoimmunity disorders (Cignarella et al., 2018). Fasting also reduces inflammation (Jordan et al., 2019; Liang et al., 2021), promotes immunological memory (Collins et al., 2019), impacts immune cell dynamics and mucosal immune responses (Nagai et al., 2019), and increases stress resistance (Mladenovic Djordjevic et al., 2021), lipolysis (Kong et al., 2020), and autophagy(Liu et al., 2017).

1. 서론

단식은 건강 증진과 노화 지연에 효과적인 비의료적 개입 방법으로 인정받아 왔습니다. 경도 또는 중등도의 단식은 불완전 단식 형식에 속하며 주로 간헐적 단식, 단식 모방 식이요법, 칼로리 제한으로 구성됩니다.

불완전 단식의 긍정적인 건강 효과는 잘 문서화되어 있습니다(de Cabo & Mattson, 2019).

불완전 단식은 비만(Bloom, 1959), 심혈관 질환(Horne et al., 2008, 2013; Most et al., 2018), 암(Ajona et al., 2020; Di Biase et al., 2016; Nencioni et al., 2018; Pietrocola et al., 2016; Yamaza et al., 2010), 류마티스 관절염 (Kjeldsen-Kragh 등, 1991), 대사 증후군 (Steiniger 등, 2009), 골관절염 (Schmidt 등, 2010), 섬유근육통 (Michalsen 등, 2013), 그리고 기억력 개선 (Witte 등, 2009). 동물 단식 모델을 통해 이러한 건강 혜택의 메커니즘이 점차 명확해지고 있습니다.

예를 들어

케토제네시스 조절(Capozzi et al., 2020; López‐Soldado et al., 2020; Steinhauser et al., 2018),

호르몬 조절(Fontana et al., 2016; Sutton et al., 2018; Volek et al., 2002),

생체 시계 조절(Gill et al., 2015), 그리고

자가면역 질환에서 중추 신경계를 보호하는 장 미생물군 변화(Cignarella et al., 2018) 등이 보고되었습니다.

단식은 또한 염증을 감소시킵니다(Jordan et al., 2019; Liang et al., 2021),

면역 기억을 촉진하고 (Collins 외, 2019),

면역 세포의 역학 및 점막 면역 반응에 영향을 미치며 (Nagai 외, 2019),

스트레스 저항력을 높입니다 (Mladenovic Djordjevic 외, 2021),

지방 분해 (Kong 외, 2020) 및 자가포식 (Liu 외, 2017).

In contrast to incomplete fasting, short‐term intensive fasting, such as beego, is complete water‐only fasting without regular food and minimal calories or supplements during the day and at night. Beego is a traditional fasting format for Chinese that lasts days to weeks initially developed for spiritual purpose and later extended to fitness. It involves psychological assistance such as meditation for Chinese, which is similar to Ramadan for introspection and prayer for Muslims. But beego is different from Ramadan since observers of Ramadan refrain from eating or drinking between sunrise and sunset each day by refeeding every night within an entire holy month (Sheikh & Wallia, 2007). The impact of Ramadan, which includes fasting on the day and refeeding at night during the holly month, on immunity remains controversial, with some reports showing benefits on the immune function, while others show no impact or harmful results (Adawi et al., 2017; Faris et al., 2012; Latifynia et al., 2009). Among other beneficial effects, Ramadan was found to attenuate inflammatory status by suppressing proinflammatory cytokine expression‎ and decreasing circulating levels of leukocytes and body fat (Faris et al., 2012). Despite a decline in the neutrophil phagocytic and serum opsonization indexes, at the end of Ramadan, the percentage of neutrophils participating in phagocytosis increased with fasting. In addition, there was an increase in the percentage of neutrophils demonstrating nitro blue tetrazolium reduction. Therefore, Ramadan might have beneficial effects on neutrophil phagocytic function (Latifynia et al.,2009).

Unlike complete fasting, calorie restriction is one of the light or incomplete fasting formats. Short‐term calorie restriction does not result in beneficial effect on health. Early study shows that dietary restriction impairs neutrophil exudation by reducing CD11b/CD18 expression‎ and chemokine production (Ikeda et al., 2001). In mice, long‐term (4‐months) calorie restriction influences innate and adaptive intestinal immunity. At the end of 4‐month fasting, lysozyme and phospholipase A2 gene levels were significantly increased, while IgA levels were diminished in the ileum due to reduced transport by its receptor pIgR. Additionally, long‐term calorie restriction differentially modified the expression‎ of innate and adaptive immunity mediators in the intestine with increased gene expression‎ of most cytokines (Suárez‐Souto et al., 2012). A recent study showed that short‐term (2–22 h) incomplete fasting in mice has differential transient effects on multiple organs (Huang et al., 2020). There, the authors identified T‐cell regulation as a central and prominent target of systemic modulations during short‐term fasting. Mechanistically, these changes seem to be driven by priming of adaptive immunity and the fine‐tuning of innate immune signaling. Similarly, a more recent study on intermittent fasting (overnight or 24‐h fasting followed by 3 h of refeeding) reports reduction in inflammation by blunting human CD4+ T helper cell activation and differentiation (Han et al., 2021).

More ongoing clinical trials are using fasting as a potential therapy, either alone or in combination with current front‐line treatments, for various health conditions (Longo et al., 2021). The TrueNorth Health Foundation has been conducting clinical study on water‐only fasting that shows largely positive outcomes with moderate adverse events (ClinicalTrials.gov, 2020a, 2020b, 2020c; Finnell et al., 2018).

불완전한 단식과 달리,

단기 집중 단식인 베고는 낮과 밤에 규칙적인 식사나 최소한의 칼로리 또는 보충제를 섭취하지 않는

완전한 물만 섭취하는 단식입니다.

베고는 중국 전통 단식 형식으로,

초기에는 영적 목적으로 개발되었으며

나중에 피트니스 목적으로 확장되었습니다.

중국인에게는 명상 같은 심리적 지원이 포함되며,

이는 무슬림의 라마단과 유사하게 내성반성과 기도에 초점을 맞춥니다.

그러나

beego는 라마단과 다릅니다.

라마단 관찰자들은

성스러운 달 동안 매일 일출부터 일몰까지 음식과 음료를 섭취하지 않으며,

밤에 한 번에 모든 식사를 섭취합니다(Sheikh & Wallia, 2007).

라마단의 영향, 즉 성스러운 달 동안 낮에 단식하고 밤에 식사를 하는 것이 면역 체계에 미치는 영향은 여전히 논란의 대상입니다.

일부 연구에서는 면역 기능에 긍정적인 영향을 보였지만, 다른 연구에서는 영향이 없거나 해로운 결과를 보여주었습니다(Adawi et al., 2017; Faris et al., 2012; Latifynia et al., 2009). 다른 유익한 효과 중 하나는 라마단이 염증 상태를 완화시키는 것으로 나타났으며, 이는 염증성 사이토카인 발현 억제와 백혈구 및 체지방의 순환 수준 감소로 인해 발생했습니다(Faris et al., 2012). 중성구 식작용 및 혈청 오pson화 지표가 감소했음에도 불구하고, 라마단 종료 시 중성구의 식작용에 참여하는 비율이 단식 기간 동안 증가했습니다. 또한, 니트로 블루 테트라졸리움 감소 반응을 보이는 중성구의 비율이 증가했습니다. 따라서 라마단은 중성구 식작용 기능에 유익한 영향을 미칠 수 있습니다(Latifynia et al.,2009).

완전 단식과 달리 칼로리 제한은 경도 또는 불완전 단식 형식 중 하나입니다.

단기 칼로리 제한은 건강에 유익한 효과를 유발하지 않습니다.

초기 연구에서 식이 제한은 CD11b/CD18 발현과 화학유인물질 생산을 감소시켜 중성구 침윤을 저해한다는 것이 밝혀졌습니다(Ikeda et al., 2001). 쥐에서 장기(4개월) 칼로리 제한은 선천적 및 적응성 장 면역에 영향을 미칩니다. 4개월 단식 후, 장내에서 리소자임과 인산리파아제 A2 유전자 수준이 유의미하게 증가했으며, pIgR 수용체에 의한 운반 감소로 인해 IgA 수준이 감소했습니다. 또한 장기 칼로리 제한은 장 내 선천적 및 적응 면역 매개체의 발현을 차등적으로 조절했으며, 대부분의 사이토킨 유전자 발현이 증가했습니다(Suárez-Souto 등, 2012).

최근 연구에서 쥐에서 단기(2~22시간) 부분 금식이 다중 장기에서 차등적인 일시적 효과를 보였다는 결과가 나왔습니다(Huang et al., 2020). 해당 연구에서 저자들은 단기 금식 동안 전신 조절의 중심적이고 주요한 표적으로 T세포 조절을 식별했습니다. 기전적으로 이러한 변화는 적응 면역의 활성화와 선천 면역 신호 전달의 미세 조정에 의해驱动되는 것으로 보입니다. 유사하게, 간헐적 단식(밤새 또는 24시간 단식 후 3시간의 재급식)에 대한 최근 연구는 인간 CD4+ T 보조 세포의 활성화 및 분화를 억제함으로써 염증을 감소시킨다고 보고했습니다(Han et al., 2021).

현재 진행 중인 임상 시험에서는 단식을 단독으로 또는 현재 주요 치료법과 결합하여 다양한 건강 상태에 대한 잠재적 치료법으로 활용하고 있습니다(Longo et al., 2021). TrueNorth Health Foundation은 물만 섭취하는 단식에 대한 임상 연구를 진행 중이며, 이는 중간 정도의 부작용과 함께 주로 긍정적인 결과를 보여주고 있습니다(ClinicalTrials.gov, 2020a, 2020b, 2020c; Finnell et al., 2018).

However, the biological effects of short‐term intensive fasting and the underlying mechanisms of such beneficial impact remain fundamentally unexplored. Our group recently performed a chronological study with beego participants who fasted for 7 or 14 days followed by a 7‐day programmed refeeding phase. In there, we observed that beego effectively decreased blood triacylglycerol (TG) selectively in TG‐high subjects, but not in TG‐normal subjects. Despite a transient cholesterol increase in all participants during fasting, these levels were normalized upon completion of the refeeding program. As a result, beego improved cardiovascular physiology and selectively reduced blood pressure in hypertensive subjects. Additionally, beego may coordinate and limit thrombosis risk by reducing platelet formation, activation, aggregation, and degranulation, while retaining normal hemostasis through sustained levels of coagulation factors and other hemostatic proteins (Fang et al., 2021). These studies suggest that, under medical supervision, beego can be implemented as a noninvasive intervention to reduce thrombosis risk. Since occasional short‐term intensive fasting is less dependent on professional supervision, this might prove easier to practice for fitness purposes as compared to long‐term intensive fasting. Here, we attempt to eval‎uate immune function after an occasional short‐term intensive fasting of 72 h.

그러나 단기 집중 단식의 생물학적 효과와 이러한 유익한 영향의 근본적인 메커니즘은 여전히 근본적으로 탐구되지 않았습니다. 우리 연구팀은 최근 beego 참가자들을 대상으로 7일 또는 14일 단식 후 7일간의 프로그램화된 재급식 단계를 포함한 시계열 연구를 수행했습니다. 이 연구에서 beego는 TG 수치가 높은 대상자에서 혈중 트리아실글리세롤(TG)을 선택적으로 감소시켰지만, TG 수치가 정상인 대상자에서는 감소 효과가 관찰되지 않았습니다.

모든 참가자가 단식 기간 동안 일시적으로 콜레스테롤 수치가 증가했지만,

재식사 프로그램이 끝난 후에는 수치가 정상으로 돌아왔습니다.

그 결과, beego는 심혈관 생리 기능을 개선하고 고혈압 환자의 혈압을 선택적으로 낮추는 효과가 있었습니다.

또한, beego는 응고 인자 및 기타 지혈 단백질의 수치를 정상으로 유지하면서 혈소판 형성, 활성화, 응집 및 탈과립을 감소시켜 혈전 위험을 조정하고 제한할 수 있습니다 (Fang et al., 2021). 이 연구들은 의료 감독 하에서 beego가 혈전 위험을 감소시키는 비침습적 개입으로 적용될 수 있음을 시사합니다. 간헐적인 단기 집중 단식은 전문적 감독에 덜 의존하기 때문에, 장기 집중 단식보다 피트니스 목적으로 실천하기 더 쉬울 수 있습니다. 본 연구에서는 72시간 간헐적 단기 집중 단식 후 면역 기능을 평가하려고 시도합니다.

2. RESULTS

2.1. Short‐term intensive fasting alters immunologic transcriptomic and proteomic profiles in leukocytes

To explore the impact of intensive fasting on innate immunity, we performed a multi‐omics analysis of circulating leukocytes from fasting subjects. Peripheral blood leukocytes (CD45+ cells) from 11 fasting participants were sorted and processed for transcriptomic and proteomic sequencing. The RNA and protein samples before and after 72 h of intensive fasting of four participants passed quality control, forming the paired analytical group. Also, in each sequencing experiment there are three additional samples at each time point that did not form sample pairs. RNA expression‎ and protein abundance were quantified before and after 72 h of intensive fasting, and due to possible high variance in the gene expression‎ profile across individual, the three additional unpaired samples were included in each analytical group for an unpaired analysis, which helped boost statistical power (Figure 1a). Principal component analysis of all samples’ transcriptomic (Figure 1b) and proteomic profiling (Figure 1c) exhibited distinct signatures between the two time points, intensive fasting 0 h (on the morning just before the fasting begins) and intensive fasting 72 h (on the morning just after 72‐h fasting finishes). A total of 37, 963 mRNAs were identified in paired transcriptomic profiling (n = 4). Unpaired analysis (n = 7) showed 3, 243 differentially expressed genes (DEGs), in which 2, 100 genes were up‐regulated and 1, 143 genes were down‐regulated. Paired analysis produced a total of 879 DEGs, with 474 genes up‐regulated and 405 genes down‐regulated (Figure 1d). Therefore, the intersection of the DEGs from the two analytical schemes was defined as the significant DEG set in response to fasting, where 458 genes were up‐regulated and 376 genes were down‐regulated (Figure 1f). Proteomic profiling yielded a total of 4, 839 proteins, with the paired differential expressed proteins (DEPs) set containing 104 up‐regulated proteins and 83 down‐regulated proteins (Figure 1e). The significant DEP set in response to fasting was composed of 80 up‐regulated and 46 proteins down‐regulated proteins (Figure 1g).

2. 결과

2.1. 단기 집중 단식이 백혈구의 면역학적 전사체 및 단백체 프로파일 변화를 유발합니다

집중적 단식이 선천성 면역에 미치는 영향을 탐구하기 위해, 단식 중인 대상자의 순환 백혈구에 대한 다중 오믹스 분석을 수행했습니다. 11명의 단식 참가자로부터 채취한 말초 혈액 백혈구(CD45+ 세포)를 분리 및 처리하여 전사체 및 단백체 시퀀싱을 진행했습니다. 4명의 참가자의 집중적 단식 전후 72시간 시점에서 채취한 RNA 및 단백질 샘플이 품질 관리 기준을 충족해 쌍을 이룬 분석 그룹을 형성했습니다. 또한 각 시퀀싱 실험마다 시간점별로 쌍을 이루지 않은 추가 샘플 3개가 포함되었습니다. 집중 단식 전후 72시간 시점에서 RNA 발현과 단백질 농도를 정량화했으며, 개인 간 유전자 발현 프로파일의 높은 변동성을 고려해 각 분석 그룹에 쌍을 이루지 않은 추가 샘플 3개를 포함해 쌍을 이루지 않은 분석을 수행했습니다. 이는 통계적 힘을 강화하는 데 기여했습니다(그림 1a). 모든 샘플의 전사체 프로파일링(그림 1b)과 단백체 프로파일링(그림 1c)에 대한 주성분 분석은 두 시간점(집중 단식 0시간(단식 시작 직전 아침)과 집중 단식 72시간(72시간 단식 종료 직후 아침)) 사이에 명확한 차이를 보여주었습니다. 쌍을 이룬 전사체 프로파일링(n = 4)에서 총 37,963개의 mRNA가 식별되었습니다. 쌍을 이루지 않은 분석(n = 7)에서는 3,243개의 차등 발현 유전자(DEGs)가 확인되었으며, 이 중 2,100개는 상향 조절되었고 1,143개는 하향 조절되었습니다. 쌍을 이룬 분석에서는 총 879개의 DEGs가 확인되었으며, 이 중 474개 유전자가 상향 조절되었고 405개 유전자가 하향 조절되었습니다(그림 1d). 따라서 두 분석 방식에서 확인된 DEGs의 교집합은 단식에 대한 반응으로 유의미한 DEG 집합으로 정의되었으며, 이 중 458개 유전자가 상향 조절되었고 376개 유전자가 하향 조절되었습니다(그림 1f). 프로테오믹스 프로파일링을 통해 총 4,839개의 단백질이 식별되었으며, 쌍을 이룬 차등 발현 단백질(DEP) 집합에는 104개의 상향 조절된 단백질과 83개의 하향 조절된 단백질이 포함되었습니다(그림 1e). 단식 반응에 대한 유의미한 DEP 집합은 80개의 상향 조절된 단백질과 46개의 하향 조절된 단백질로 구성되었습니다(그림 1g).

FIGURE 1.

Open in a new tab

Short‐term intensive fasting alters the immune transcriptomic and proteomic profiles of leukocytes. (A) Schematic outline of intensive fasting regimes used in this study and experimental procedures conducted. (B) Two‐dimensional PCA of CD45+ cell transcriptome and (C) proteome from samples collected before and 3 days after intensive fasting. A total of 7 participants were included in this analysis. (paired n = 4, and unpaired n = 7). (D) Volcano plot of CD45+ cell transcriptome and (E) proteome. In the volcano plot, differentially expressed genes were determined under the condition of fold change ≥2 (proteins with fold change ≥1.5) and false‐discovery rate (adjusted p value) threshold ≤0.05. The negative values represent a decrease in gene expression‎ and the positive values represent an increase in gene expression‎. The fold change was log‐transformed, and p value was transformed by −log10. Purple dots represent up‐regulated genes/proteins and blue dots represent down‐regulated genes/proteins. (F) Four‐way Venn diagram depicting significantly regulated genes and (G) proteins in CD45+ cells before and 72 h after intensive fasting. Significant molecular signatures are selected by intersection of the paired and unpaired analysis

단기 집중 단식은 백혈구의 면역 전사체 및 단백체 프로파일을 변화시킵니다. (A) 본 연구에서 사용된 집중 단식 프로토콜 및 실험 절차의 개요도. (B) 집중 단식 전과 3일 후에 수집된 샘플의 CD45+ 세포 전사체에 대한 2차원 주성분 분석(PCA) 및 (C) 단백체. 본 분석에는 총 7명의 참가자가 포함되었습니다(쌍을 이룬 n = 4, 쌍을 이루지 않은 n = 7). (D) CD45+ 세포 전사체 (D) 및 (E) 단백체에 대한 화산도. 화산도에서 차등 발현 유전자는 변화 배율 ≥2 (단백질의 경우 변화 배율 ≥1.5) 및 거짓 발견률 (조정 p값) 임계값 ≤0.05 조건 하에서 결정되었습니다. 음의 값은 유전자 발현 감소, 양의 값은 유전자 발현 증가를 나타냅니다. 배수 변화는 로그 변환되었으며, p 값은 −log10으로 변환되었습니다. 보라색 점은 상향 조절된 유전자/단백질을, 파란색 점은 하향 조절된 유전자/단백질을 나타냅니다. (F) 집중적 단식 전후 72시간에 CD45+ 세포에서 유의미하게 조절된 유전자와 (G) 단백질을 나타내는 4중 벤 다이어그램. 유의미한 분자 서명은 쌍을 이룬 분석과 쌍을 이루지 않은 분석의 교집합으로 선택되었습니다.

2.2. Functional enrichment on DEGs and DEPs reveals pathways critical to immune cell functions

To determine biological pathways that are activated or silenced during the intensive fasting process, we employed overrepresentation analysis on both our omics data using GOAtools, a python‐based library (Klopfenstein et al., 2018). Pathways with either a false‐discovery rate (FDR) lower than 0.05 or study count higher than 20 (15 in proteomics) were considered as biological insightful. The enrichment analysis on sigDEGs produced 549 pathways in gene ontology biological process (GOBP), 74 in cellular component (GOCC), and 101 in molecular function (GOMF). Enrichment on sigDEPs produced 155 enriched pathways in GOBP, 77 in GOCC, and 15 in GOMF. Gene ontology database has been known for its hierarchal structure, so we next employed both breadth first search (BFS) and depth first search (DFS) to interpret the enrichment results. We used BFS to summarize the key molecular changes after 72 h of intensive fasting. As shown in Figure 2a–d, intensive fasting clearly influences immunological functions, immune response, metabolic process, and response to stimulus. DFS analysis revealed a distinct enrichment in leukocyte‐mediated immune functions, particularly processes related to innate immunity. Further analysis revealed other aspects involved in leukocyte functions, including cell motility and chemotaxis, which are both integral functions in leukocyte activation (Figure 2e).

2.2. DEGs 및 DEPs의 기능적 풍부도 분석을 통해 면역 세포 기능에 중요한 경로 확인

강도 높은 단식 과정 중 활성화되거나 억제되는 생물학적 경로를 확인하기 위해, 우리는 GOAtools(Klopfenstein et al., 2018)라는 파이썬 기반 라이브러리를 사용하여 우리 omics 데이터에 대해 과표현 분석을 수행했습니다. FDR(false-discovery rate)이 0.05 미만 또는 연구 수 20개 이상(프로테오믹스는 15개)인 경로는 생물학적 의미가 있는 것으로 간주되었습니다. sigDEGs에 대한 풍부도 분석은 유전자 온톨로지 생물학적 과정(GOBP)에서 549개, 세포 구성 요소(GOCC)에서 74개, 분자 기능(GOMF)에서 101개의 경로를 생성했습니다. sigDEPs에 대한 풍부도 분석은 GOBP에서 155개, GOCC에서 77개, GOMF에서 15개의 풍부한 경로를 생성했습니다. 유전자 온톨로지 데이터베이스는 계층적 구조로 알려져 있으므로, 우리는 풍부도 분석 결과를 해석하기 위해 breadth first search (BFS)와 depth first search (DFS)를 모두 적용했습니다. BFS는 집중적 단식 72시간 후의 주요 분자 변화를 요약하는 데 사용되었습니다. 그림 2a–d에 표시된 바와 같이, 집중적 단식은 면역 기능, 면역 반응, 대사 과정, 자극에 대한 반응에 명확한 영향을 미쳤습니다. DFS 분석은 백혈구 매개 면역 기능, 특히 선천성 면역과 관련된 과정에서의 명확한 풍부화를 보여주었습니다. 추가 분석은 백혈구 기능과 관련된 다른 측면, 즉 세포 운동성과 화학유동성을 포함했으며, 이는 모두 백혈구 활성화의 필수적인 기능입니다(그림 2e).

FIGURE 2.

Open in a new tab

Multi‐omics enrichment analysis of leukocyte transcriptome and proteome reveal activated metabolic processes and shifted immunologic functions after short‐term intensive fasting. Gene ontology enrichment analysis on (A) biological process (BP), (B) cellular component (CC), and (C) molecular function (MF) of transcriptomic data. (D) Gene ontology enrichment analysis on BP, CC, and MF of proteomic data. Dot size represents the number of genes in each pathway, and the color ranging from red to blue corresponds to statistical significance, false‐discovery rate (FDR), from most significant to least significant. (E) Bubble plot depicting DEGs (left), and DEPs (right) associated with leukocyte functions. Color bar represents the FDR of each enriched pathway, ranging from low to high, in correspondence red to blue

다중 오믹스 풍부도 분석을 통해 단기 집중 단식 후 백혈구 전사체 및 단백체에서 활성화된 대사 과정과 변화된 면역 기능이 밝혀졌습니다. 전사체 데이터의 (A) 생물학적 과정 (BP), (B) 세포 구성 요소 (CC), 및 (C) 분자 기능 (MF)에 대한 유전자 온톨로지 풍부도 분석. (D) 단백체 데이터의 BP, CC, 및 MF에 대한 유전자 온톨로지 풍부도 분석. 점의 크기는 각 경로에 속한 유전자 수를 나타내며, 빨간색에서 파란색으로 변하는 색상은 통계적 유의성(FDR)을 나타내며, 가장 유의미한 것부터 가장 덜 유의미한 순서입니다. (E) 백혈구 기능과 관련된 차등 발현 유전자(DEGs, 왼쪽) 및 차등 발현 단백질(DEPs, 오른쪽)을 나타내는 버블 플롯. 색상 바는 각 풍부화 경로의 FDR을 나타내며, 빨간색에서 파란색으로 변하는 순서입니다.

2.3. Intensive fasting enhances autophagy level of leukocytes

Autophagy is a metabolic mechanism which safeguards cell homeostasis by lysosomal degradation of aged or damaged organelles and proteins aggregates, thereby facilitating bioenergetic homeostasis. Starvation is known to trigger autophagy in cell lines and animal models, but in vivo characterization of autophagy activity in human body remains challenging since autophagic flux assays require treatment with pharmacological inhibitors, which is toxic. Thus, high‐throughput sequencing provides a feasible way to address this question. Our proteomic profiling revealed that a group of mammalian autophagy‐related proteins including major autophagy machinery members (Beclin1, Atg3, Atg5, Atg16, etc.), autolysosome members (LAMP, SNAP29, VAMP28, CTSD, CTSB, etc.), and autophagy upstream regulators (TSC2, Akt, TBK1, etc.) were up‐regulated during intensive fasting. Moreover, proteins known to inhibit autophagy such as Bcl‐2 are generally down‐regulated (Figure 3a).

2.3. 집중적인 단식은 백혈구의 자가포식 수준을 향상시킵니다.

자가포식은

노화되거나 손상된 세포 기관 및 단백질 응집체를 리소좀으로 분해하여 세포의 항상성을 유지하고,

그로 인해 생체 에너지의 항상성을 촉진하는 대사 메커니즘입니다.

기아는 세포주 및 동물 모델에서 자가포식을 유발하는 것으로 알려져 있지만,

자가포식 플럭스 분석에는 독성이 있는 약리학적 억제제 처리가 필요하기 때문에

인체에서 자가포식 활동을 생체 내에서 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다.

따라서,

고처리량 시퀀싱은 이 문제를 해결할 수 있는 실용적인 방법입니다.

우리의 단백질체 프로파일링은

주요 자가포식 기전 구성 요소(Beclin1, Atg3, Atg5, Atg16 등),

오토리소좀 구성 요소(LAMP, SNAP29, VAMP28, CTSD, CTSB 등) 및

자가포식 상류 조절 인자(TSC2, Akt, TBK1 등)를 포함한

포유류 자가포식 관련 단백질 그룹이 집중적인 단식 중에 상향 조절된다는 것을 밝혔습니다.

또한,

Bcl-2와 같은 자가포식을 억제하는 것으로 알려진 단백질은

일반적으로 하향 조절됩니다 (그림 3a).

FIGURE 3.

Open in a new tab

Intensive fasting increases autophagy level of leukocytes. (A) Annotated heatmap of differentially expressed proteins involved in the autophagy process. The signaling pathway is adapted from kegg pathway hsa04140. (B) Measurement of LC3 protein by western blotting

To validate these results, we assess LC3 expression‎, a key indicator for the formation of autophagosome, by immunoblotting assay, and show that the ratio between LC3‐II/LC3‐I was significantly elevated 72 h after intensive fasting (Figure 3b), further suggesting that intensive fasting increase leukocyte autophagy activity, which helps maintain a better cell homeostasis.

2.4. Intensive fasting reduces apoptosis level of leukocytes and increased neutrophils

Physiological autophagy is a protective mechanism to protect cells during starvation and other stresses, and its activation often inhibits apoptosis. Transcriptomic profiling revealed a majority of down‐regulated genes related to apoptotic activity (69 out of 104 sigDEGs). This suggests that intensive fasting lowers apoptosis activity of leukocytes (Figure 4a). Measurement of apoptotic status by flow cytometry analysis showed a significant increase in the percentage of live cells (Annexin V and PI double negative) in CD45+ leukocyte population from 57 subjects at 72 h after intensive fasting, confirm‎ing reduced apoptosis of leukocytes by intensive fasting (Figure 4b).

집중적인 단식은 백혈구의 자가포식 수준을 증가시킵니다. (A) 자가포식 과정에 관여하는 발현 차이의 단백질에 대한 주석이 달린 히트맵. 신호 전달 경로는 kegg pathway hsa04140에서 발췌한 것입니다. (B) 웨스턴 블로팅을 통한 LC3 단백질 측정

이러한 결과를 검증하기 위해, 자가포식 소체 형성의 주요 지표인 LC3 발현을 면역블로팅 분석으로 평가한 결과, 집중 단식 72시간 후 LC3-II/LC3-I의 비율이 유의하게 증가한 것을 확인했습니다(그림 3b). 이는 집중 단식이 백혈구의 자가포식 활동을 증가시켜 세포의 항상성을 더 잘 유지하는 데 도움이 된다는 것을 다시 한 번 시사합니다.

2.4. 집중 단식은 백혈구의 세포 사멸 수준을 감소시키고 호중구 수를 증가시킵니다.

생리적 자가포식은 기아 및 기타 스트레스 상황에서 세포를 보호하는 보호 메커니즘이며,

이 메커니즘이 활성화되면 세포 사멸이 억제되는 경우가 많습니다.

전사체 프로파일링을 통해 세포 사멸 활동과 관련된 유전자의 대부분이 하향 조절된 것으로 나타났습니다 (104개의 sigDEG 중 69개).

이는 집중적인 단식이 백혈구의 세포 사멸 활동을 저하시키는 것을 의미합니다 (그림 4a).

유세포 분석을 통한 세포 사멸 상태 측정 결과, 집중적 단식 후 72시간 경과 시 57명의 대상자에서 CD45+ 백혈구 인구 중 살아있는 세포(Annexin V 및 PI 이중 음성)의 비율이 유의미하게 증가했으며, 이는 집중적 단식이 백혈구의 세포 사멸을 감소시킨다는 것을 확인했습니다(그림 4b).

FIGURE 4.

Open in a new tab

Intensive fasting reduces apoptosis of leukocytes. (A) DEGs enriched in the apoptotic and regulation of apoptotic process. All pathways are statistically significant enrichment. (B) Representative flow cytometry plot for measurement of apoptotic CD45+ cells before and 72 h after intensive fasting (left panel). Quantification of the flow cytometry on apoptosis of CD45+ population (right panel). Wilcoxon matched‐pairs signed rank test is used. *p value <0.05, **p value <0.01, ***p value <0.001, ****p value <0.0001. (C, D) Peripheral neutrophils and lymphocytes count at before (Control) and 72 h after intensive fasting (last day of the fasting)

To explore the response to fasting in various leukocytes populations, we examined the peripheral leukocyte counts from 57 participants after intensive fasting. Statistical analysis on complete blood count data revealed major shifts in leukocyte composition. Noticeably, neutrophil showed significant elevation in both total cell number and frequency, which was associated with a reduction in lymphocytes, but within its normal value range (Figure 4c,d), suggesting that intensive fasting favors innate immune enhancement.

2.5. Neutrophil activation is the main immunological response to intensive fasting

Since CD45+ population comprises mainly neutrophils, macrophages/monocytes, and lymphocytes, we next identified the molecular signatures specific to each cell lineage. Significantly more DEGs/DEPs associated with neutrophil degranulation were identified in the enrichment of descendants of leukocyte‐mediated immunity. Neutrophils are largely responsible for pathogen clearance through phagocytosis, degranulation, and the release of neutrophil extracellular traps, but can also modulate the immune response by interacting with other immune cells such as antigen‐presenting cells or lymphocytes (Kanashiro et al., 2020). Both transcriptomic and proteomic profiling revealed significantly increased enrichment in neutrophil degranulation (Figure 2e, Figure S1), suggesting activation of neutrophils after intensive fasting. All proteins involved in neutrophil degranulation showed significant upregulation, except for the pro‐platelet basic protein, PPBP (Figure 5a). In contrast, no detectable changes were found in phagocytosis and neutrophil extracellular traps (NETs).

강도 높은 단식은 백혈구의 아포토시스를 감소시킵니다.

(A) 아포토시스 및 아포토시스 과정 조절과 관련된 풍부하게 표현된 차등 발현 유전자(DEGs). 모든 경로는 통계적으로 유의미한 풍부함을 보입니다.

(B) 강도 높은 단식 전과 72시간 후의 아포토시스 CD45+ 세포 측정을 위한 대표적 유동 세포 측정도(왼쪽 패널). CD45+ 인구에서의 아포토시스 측정 유동 세포 측정 결과(오른쪽 패널). Wilcoxon 매칭 쌍 서명 순위 검정이 사용되었습니다.

*p 값 <0.05, **p 값 <0.01, ***p 값 <0.001, ****p 값 <0.0001. (C, D) 집중적 단식 전(대조군)과 단식 후 72시간(단식 마지막 날)의 말초 중성구 및 림프구 수.

다양한 백혈구 군집의 단식 반응을 탐구하기 위해, 우리는 집중 단식 후 57명의 참가자에서 말초 백혈구 수를 조사했습니다. 완전 혈구 계수 데이터의 통계적 분석은 백혈구 구성의 주요 변화를 보여주었습니다. 특히, 중성구는 총 세포 수와 빈도 모두에서 유의미한 증가를 보였으며, 이는 림프구 감소와 연관되었지만 정상 범위 내였습니다(그림 4c,d), 이는 집중 단식이 선천성 면역 강화에 유리함을 시사합니다.

2.5. 중증 단식에 대한 주요 면역학적 반응은 중성구 활성화입니다

CD45+ 군은 주로

중성구, 대식세포/단핵구, 림프구로 구성되어 있으므로,

우리는 각 세포 계통에 특이적인 분자적 특징을 식별했습니다.

백혈구 매개 면역 반응의 후손 군에서 중성구 분비와 관련된 DEGs/DEPs가 유의미하게 더 많이 식별되었습니다.

중성구는 식균작용, 분비, 중성구 세포외 트랩 방출을 통해

병원체 제거에 주로 관여하지만,

항원 제시 세포나 림프구와 같은 다른 면역 세포와의 상호작용을 통해 면역 반응을 조절할 수 있습니다(Kanashiro et al., 2020).

전사체 및 단백체 프로파일링 결과,

중증 단식 후 중성구 분비 활성화가 유의미하게 증가했습니다(그림 2e, 그림 S1).

중성구 분비와 관련된 모든 단백질은

프로-혈소판 기본 단백질(PPBP)을 제외하고 유의미하게 발현이 증가했습니다(그림 5a).

반면,

식작용 및 중성구 세포외 트랩(NETs)에서는

검출 가능한 변화가 관찰되지 않았습니다.

FIGURE 5.

Open in a new tab

Neutrophil activation is the key immunological change in response to intensive fasting.

(A) Heatmap of proteomic profiling on neutrophil degranulation. Expression‎ data were row normalized to illustrate the differential status.

(B) Circos plot depicting DEPs with cytokines activity and their origins annotated by HPA database. Total value for each cytokines sums up to 100% and total value for each cell type is stacked percentage from their corresponding cytokines. Heatmap illustrating the relative expression‎ at intensive fasting 0 and 72 h is plotted around circos plot. The outer block corresponds to expression‎ at 0‐h intensive fasting, and the inner block corresponds to expression‎ at 72‐h fasting. Expression‎ data are normalized for each protein. (C, D) GSEA analysis of dataset from PMA‐ and F.T.‐ stimulated neutrophils

중증 단식 시 중성구 활성화는 주요 면역학적 변화입니다. (A) 중성구 분비체 분해에 대한 프로테오믹스 프로파일링의 히트맵. 발현 데이터는 차이를 강조하기 위해 행 표준화되었습니다. (B) 사이토킨 활성과 HPA 데이터베이스로 주석이 달린 DEPs를 보여주는 서커스 플롯. 각 사이토킨의 총 값은 100%를 합산하며, 각 세포 유형의 총 값은 해당 사이토킨에서 쌓인 백분율입니다. 강도 높은 단식 0시간과 72시간의 상대적 발현을 보여주는 히트맵이 Circos 플롯 주변에 플롯되었습니다. 외곽 블록은 0시간 강도 높은 단식 시의 발현을, 내측 블록은 72시간 단식 시의 발현을 나타냅니다. 발현 데이터는 각 단백질별로 정규화되었습니다. (C, D) PMA 및 F.T.로 자극받은 중성구 데이터셋의 GSEA 분석

Cytokines released from innate immune cells plays a key role in the regulation of the immune response. These signaling molecules initiate or constrain inflammatory responses to infection and injury (Lacy & Stow, 2011). Notable changes were detected in the expression‎ of cytokines in various leukocytes in response to intensive fasting. Figure 5b illustrates the contribution of neutrophils, NK cells, T cells, and B cells to cytokine secretion. Specifically, NCAM1, HSPB1, F13A1, and PF4 varied significantly in expression‎ level among participants before intensive fasting but stabilized 72 h after the fasting (Figure S2). Neutrophil and natural killer cells were the main drivers of cytokine responses as manifested by stacked percentages 1163% and 774%, respectively, for neutrophil and natural killer cells (Figure 5b). Next, we used gene set enrichment analysis (GSEA) on an immunological signature database (Liberzon et al., 2015) to verify these results. GSEA analysis of the transcriptomic profiles showed mainly positive correlation between intensive fasting and stimulated neutrophils. Particularly, one dataset from neutrophils treated with bacterium Francisella tularensis (GSE37416, Schwartz et al., 2013) showed positive correlated expression‎ pattern (Figure 5c). Similarly, another dataset (GSE126757) from a commonly used neutrophil stimuli, para‐methoxyamphetamine (PMA), was also considered in verifying the stimulated status of CD45+ population after intensive fasting, and again showed positive correlation (Figure 5d). Given the elevated neutrophil count and frequency 72 h after intensive fasting, we conclude that intensive fasting works as a stimulus in neutrophil activation.

To eval‎uate a broader impact of intensive fasting on immune response, we performed biochemical analysis on 57 fasting subjects, which showed elevated levels of serum total protein, serum albumin, and serum globulin, but within the normal range. Serum albumin/globulin ratio remained unchanged while serum pre‐albumin decreased (Figure S3), suggesting that intensive fasting strengthen overall immunity by promoting serum protein production.

선천성 면역 세포에서 분비되는 사이토카인은 면역 반응 조절에 핵심적인 역할을 합니다. 이러한 신호 분자는 감염 및 손상에 대한 염증 반응을 시작하거나 억제합니다 (Lacy & Stow, 2011). 집중적 금식 후 다양한 백혈구에서 사이토카인 발현에 유의미한 변화가 관찰되었습니다. 그림 5b는 중성구, NK 세포, T 세포, B 세포가 사이토카인 분비에 기여하는 정도를 보여줍니다. 구체적으로, NCAM1, HSPB1, F13A1, PF4는 집중적 금식 전 참가자 간 발현 수준에서 유의미하게 차이가 있었지만, 금식 후 72시간에 안정화되었습니다(그림 S2). 중성구와 자연살해 세포는 사이토킨 반응의 주요 촉진제로, 중성구와 자연살해 세포의 쌓인 백분율이 각각 1163%와 774%로 나타났습니다(그림 5b). 다음으로, 우리는 면역학적 서명 데이터베이스(Liberzon et al., 2015)를 사용하여 유전자 세트 풍부도 분석(GSEA)을 수행하여 이러한 결과를 검증했습니다. 전사체 프로파일의 GSEA 분석 결과, 집중적 단식과 자극받은 중성구 사이에 주로 양의 상관관계가 관찰되었습니다. 특히, 세균 Francisella tularensis로 처리된 중성구 데이터셋(GSE37416, Schwartz et al., 2013)은 양의 상관관계를 보이는 발현 패턴을 보여주었습니다(그림 5c). 또한, 일반적으로 사용되는 중성구 자극제인 파라-메톡시아메페타민(PMA)에서 유래한 다른 데이터셋(GSE126757)도 집중적 단식 후 CD45+ 인구군의 자극 상태를 검증하는 데 고려되었으며, 다시 한 번 양의 상관관계를 보여주었습니다(그림 5d). 집중적 단식 후 72시간에 중성구 수와 빈도가 증가한 점을 고려할 때, 집중적 단식이 중성구 활성화의 자극제로 작용한다는 결론을 내릴 수 있습니다.

면역 반응에 대한 집중적 단식의 광범위한 영향을 평가하기 위해 57명의 단식 대상자를 대상으로 생화학적 분석을 수행했습니다. 결과적으로 혈청 총 단백질, 혈청 알부민, 혈청 글로불린 수치가 상승했지만 정상 범위 내에 있었습니다. 혈청 알부민/글로불린 비율은 변하지 않았으며, 혈청 프리알부민은 감소했습니다(그림 S3). 이는 집중적 단식이 혈청 단백질 생성을 촉진함으로써 전체 면역력을 강화한다는 것을 시사합니다.

3. DISCUSSION

In this clinical study, we applied multi‐omics tools to examine the impact of short‐term intensive fasting on immune function. Our analysis suggests that occasional short‐term intensive fasting enhances immune function, particularly, neutrophil activity. Presumably, this is achieved at least in part by remodeling of the leukocyte's expression‎ profiles (Figure 6).

3. 논의

이 임상 연구에서 우리는 단기 집중적 단식이 면역 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해 다중 오믹스 도구를 적용했습니다. 분석 결과, 간헐적인 단기 집중적 단식이 면역 기능을 향상시키며, 특히 중성구 활성을 강화한다는 것을 보여주었습니다. 이는 적어도 부분적으로 백혈구의 발현 프로파일 재편성(그림 6)을 통해 달성된 것으로 추정됩니다.

FIGURE 6.

Open in a new tab

Short‐term intensive fasting remodels innate immune function in humans. 72‐h intensive fasting improves neutrophil function with elevated secretion of cytokines. The fasting‐triggered upregulation of autophagy and downregulation of apoptosis together contribute to the improved innate immunity

단기 집중 단식은 인간의 선천적 면역 기능을 재구성합니다. 72시간의 집중 단식은 사이토카인 분비를 증가시켜 호중구 기능을 개선합니다. 단식으로 유발된 자가포식(autophagy)의 상향 조절과 세포사멸(apoptosis)의 하향 조절이 함께 선천적 면역력 개선에 기여합니다.

Unlike previous work which primarily focuses on circulating peripheral blood mononuclear cells and lymphocytes (Han et al., 2021; Huang et al., 2020), here we sorted CD45+ leukocytes cells to investigate both the differentials in innate and adaptive immune system. CD45+ cells are composed of myeloid, natural killer cells, T cells, B cells, and plasma cells. The ratios of lymphoid and myeloid cells are relatively close in the CD45+ population (Zhao et al., 2020), enabling us to investigate the biological changes in human immune system. Neutrophils are generally the first responders to bacterial infection and play a pivotal role in initiation and mediation of immune response. Neutrophils exercise their bactericidal ability via a series of biological processes including phagocytosis, secretion of proteases, production of reactive oxygen species, and release of neutrophil extracellular traps (Manfredi et al., 2018; Nathan, 2006). Our transcriptomic and proteomic analysis of CD45+ cells revealed activated neutrophil function and neutrophil degranulation process, accompanied by increased granule contents, which suggests increased granule production. This degranulation process is a regulated exocytosis of secretory granules containing mediators such as proteases, lipases, and inflammatory mediators. Other functions related to neutrophil activation, such as cell migration and cell adhesion, also displayed positive regulation in response to intensive fasting.

The activation profile of neutrophils 72 h after intensive fasting resembled that of chemical (PMA) and biological (F. Tularensis) stimulation. PMA has been widely used to induce neutrophil activation in vitro, inducing the release of superoxide anion and neutrophil extracellular traps (Kenny et al., 2017). Similarly, F. Tularensis, a pathogenic species of Gram‐negative coccobacillus, has been reported to not only activate neutrophil‐mediated immunity, but also to be closely related to longer neutrophil lifespan and subsequently prolonged inflammation. Comparative GSEA on transcriptomic profiling with PMA‐stimulated neutrophils (GSE126757) and F. Tularensis stimulated neutrophils showed molecular variations similar to those observed here at the end of 72‐h intensive fasting. In the process of neutrophil activation, integrin family protein showed variation in both transcripts and protein levels, which have been closely related to leukocyte‐mediated immune activation. Particularly, integrin ITGAL/ITGB2, accompanied with ICAM3, has been reported to contribute to neutrophil efferocytosis of macrophages (Kristóf et al., 2013).

Cathepsin family contains a series of lysosomal proteases that have been implicated in a wide variety of inflammatory activities. Cathepsin C (CTSC) is known to function as the key activator of elastase, and cathepsin G (CTSG) in neutrophils has been reported as a pathogenesis signature in many auto‐immune and chronic inflammatory diseases (Burgener et al., 2019), whereas cathepsin D (CTSD) has been related not only to immune responses but also regulation of programmed cell death. Considering these factors that weigh greatly in the immune response, these data further suggest that occasional intensive fasting can act as a trigger of the innate immune response. On the contrary, cytokines related to platelet activation are decreased. This is consistent with our recent report on the reduction of blood clots risk by beego (Fang et al., 2021).

A previous report showed that overnight or 24‐h fasting can blunt CD4+ Th cells activation and differentiation, which may be exploited as an intervention on auto‐immune diseases (Han et al., 2021). In this intensive fasting model, we also discovered from transcriptomic profiling on leukocytes that genes involved in lymphocyte differentiation are prone to be negative regulated during intensive fasting. However, peripheral blood count indicates that participants had statistically lower lymphocytes, but within normal range after 72‐h intensive fasting. Thus, our results suggest that intensive fasting favors strengthening of innate immunity.

Autophagy is implicated in multiple functions of various tissues, including but not limited to decelerating of aging and suppression of oncogenesis (Cao et al., 2015; Fang et al., 2020; Yuan et al., 2020). In vivo autophagy is effectively activated in response to intensive fasting (Figure 3a,b). This presumably leads to digestion of aged proteins/organelles into amino acids and free fatty acids for recycling and regeneration of new proteins and organelles. Autophagy initiation is highly dependent on Beclin1, a key member in the Beclin1‐PI3K C3 complex (Kroemer et al., 2010). Beclin1 upregulation enhances autophagy (Wang et al., 2009). Interestingly, different formats of fasting impacts autophagy in a slightly different way in the regulation of p62, which was reduced in response to intensive fasting in our study (Figure 3a), but was increased in the incomplete fasting regimes (Bagherniya et al., 2018). On the contrary, the apoptotic process in leukocytes is prone to suppression after 72‐h intensive fasting, which is proven by flow cytometry and omics signatures (Figure 4). This is in consistence with the role of Beclin1 that activates autophagy but inhibits apoptosis (Wang, 2008). Interestingly, short‐term intensive fasting enhances immune function, but does not aggravate prolonged inflammation which could cause subsequent harm to those with chronic inflammation. In our recent study, we monitored the hematological profile seven days and in some participants 14 days of intensive fasting after 7‐day refeeding process, and the composition of their leukocyte's populations were more balanced after intensive fasting (Fang et al., 2021). Nevertheless, it would be helpful to examine the short‐term and long‐term effects of occasional intensive fasting on other clinical complications such as chronic inflammation or tissue damage.

Many viruses prohibit host autophagy by blocking autophagy‐triggered pathways. A recent study has indicated that severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS‐CoV‐2) also inhibits host autophagy activity and in vitro administration of spermidine, AKT inhibitor MK‐2206, and the Beclin‐1 stabilizing, anti‐helminthic drug niclosamide effectively inhibits SARS‐CoV‐2 propagation (Gassen et al., 2020), suggesting a potential application of autophagy against SARS‐CoV‐2 infection. Compromised immunity has a high risk of viral disease. Due to quick mutations of fatal viruses such as coronavirus disease‐19 (COVID‐19) that challenge the effectiveness of timely developed drugs and vaccines, strengthening immunity through both medical and non‐medical interventions, including but not limited to fasting, may be helpful for surviving this disease (Bartleson et al., 2021; Hannan et al., 2020). Intensive fasting causes an extreme starvation stress, which presumably triggers higher activation of autophagy than incomplete fasting does, possibly leading to a better priming of the host immune system to fight against virus diseases.

However, our trial has several limitations. It is difficult to recruit a comparable control group for sampling since the subjects in this fasting study have different subhealthy conditions. It is also not easy to organize large cohort in the same location for several days eating nothing but being requested to donate blood samples. The quantity for each sampling was fully based on the informed consent from the volunteered subjects. The quality of the samples also varied among subjects and even differed in the same subject between two sampling times (0‐ and 72‐h fasting), leading to small size of cohort for multi‐omics analysis and some samples are unpaired. However, the number of subjects used for laboratory biochemical analysis is much bigger since much less quantity for each sample was required.

Psychological induction is known to have an influence on immune function (Black & Slavich, 2016; Davidson et al., 2003). Validation with laboratory animals for psychological influence on intensive fasting is virtually impossible. We noticed that laboratory mice could not survive 4‐day water‐only fasting. In addition, there was a big variance in the age of the subjects used for our analysis and we were unable to group the data within a similar age although we realized that the immune system undergoes age‐associated changes. Future study with age‐grouped larger cohort is warranted to deepen our understanding of the impact of intensive fasting on immune system and establish direct link between psychological intervene and fasting effect.

Finally, this study focused on leukocytes expression‎ profiling in the context of intensive fasting. Post‐translational modification of proteins and epigenetic modulation of the genome and macromolecules may also be implicated in reshaping immune function in response to intensive fasting. Therefore, we recognize that changes in gene expression‎ patterns at transcriptional and translational levels are only partially responsible for innate immune remodeling by intensive fasting.

이전 연구들은 주로 순환하는 말초 혈액 단핵구와 림프구에 초점을 맞췄습니다(Han et al., 2021; Huang et al., 2020). 본 연구에서는 CD45+ 백혈구 세포를 분리하여 선천적 면역 체계와 적응 면역 체계의 차이를 조사했습니다. CD45+ 세포는 골수계, 자연살해 세포, T 세포, B 세포, 플라즈마 세포로 구성됩니다. CD45+ 인구에서 림프계와 골수계 세포의 비율은 상대적으로 유사합니다(Zhao et al., 2020), 이는 인간 면역계의 생물학적 변화를 조사하는 데 적합합니다. 중성구는 세균 감염에 대한 첫 번째 반응자로서 면역 반응의 시작과 조절에 핵심적인 역할을 합니다. 중성구는 식작용, 프로테아제 분비, 활성산소종 생성, 중성구 세포외 트랩(NETs) 방출 등 일련의 생물학적 과정을 통해 세균 살상 능력을 발휘합니다(Manfredi et al., 2018; Nathan, 2006). 우리 연구팀의 CD45+ 세포에 대한 전사체 및 단백체 분석 결과, 활성화된 중성구 기능과 중성구 분비 과정이 관찰되었으며, 이는 분비 소체 내용물의 증가와 함께 분비 소체 생산 증가를 시사합니다. 이 분비 과정은 프로테아제, 리파제, 염증 매개체 등을 포함한 분비 소체(secretory granules)의 조절된 분비(exocytosis)입니다. 중증 금식(intensive fasting)에 대한 반응으로 중성구 활성화와 관련된 다른 기능, 예를 들어 세포 이동 및 세포 부착도 긍정적으로 조절되었습니다.

중증 금식 72시간 후 중성구의 활성화 프로파일은 화학적(PMA) 및 생물학적(F. Tularensis) 자극에 의한 활성화 프로파일과 유사했습니다. PMA는 체외에서 중성구 활성화를 유도하는 데 널리 사용되며, 슈퍼옥사이드 음이온과 중성구 세포외 트랩(Kenny et al., 2017)의 방출을 유발합니다. 마찬가지로 그람 음성 코코박테리아 속의 병원성 종인 F. Tularensis는 중성구 매개 면역 활성화를 유도할 뿐만 아니라 중성구 수명 연장 및 이후 염증 지속과 밀접하게 관련되어 있다는 보고가 있습니다. PMA로 자극받은 중성구(GSE126757)와 F. Tularensis로 자극받은 중성구의 전사체 프로파일링을 비교한 GSEA는 72시간 집중 단식 후 관찰된 분자적 변이와 유사한 결과를 보여주었습니다. 중성구 활성화 과정에서 인테그린 가족 단백질은 전사체 및 단백질 수준에서 변이를 보였으며, 이는 백혈구 매개 면역 활성화와 밀접하게 관련되어 있습니다. 특히, ICAM3와 함께 발현되는 integrin ITGAL/ITGB2는 대식세포의 중성구 효소적 소화에 기여한다는 보고가 있습니다(Kristóf et al., 2013).

카테프신 가족은 다양한 염증 활동과 연관된 리소좀 프로테아제 시리즈를 포함합니다. 카테프신 C(CTSC)는 엘라스테이스의 주요 활성화제로 기능하며, 중성구 내 카테프신 G(CTSG)는 많은 자가면역 및 만성 염증성 질환의 병리학적 특징으로 보고되었습니다(Burgener et al., 2019). 반면 카테프신 D(CTSD)는 면역 반응뿐만 아니라 프로그램된 세포 사멸 조절과도 관련이 있습니다. 이러한 면역 반응에 큰 영향을 미치는 요인들을 고려할 때, 이 데이터는 간헐적인 집중적 단식이 선천성 면역 반응의 유발 요인으로 작용할 수 있음을 시사합니다. 반면, 혈소판 활성화와 관련된 사이토카인은 감소합니다. 이는 최근 우리 연구에서 beego가 혈전 위험을 감소시킨다는 보고(Fang et al., 2021)와 일치합니다.

이전 연구에서는 밤새 또는 24시간 단식이 CD4+ Th 세포의 활성화와 분화를 억제한다는 결과가 나왔으며, 이는 자가면역 질환 치료 전략으로 활용될 수 있습니다(Han et al., 2021). 이 집중 단식 모델에서 백혈구 전사체 프로파일링을 통해 집중 단식 중 림프구 분화 관련 유전자들이 음성 조절되기 쉽다는 것을 발견했습니다. 그러나 말초 혈액 검사 결과, 참가자들은 72시간 집중 단식 후 림프구 수치가 통계적으로 유의미하게 감소했지만 정상 범위 내에 있었습니다. 따라서 우리 결과는 집중 단식이 선천성 면역 강화에 유리함을 시사합니다.

자가포식은 노화 지연 및 종양 발생 억제 등 다양한 조직의 여러 기능에 관여합니다 (Cao et al., 2015; Fang et al., 2020; Yuan et al., 2020). 생체 내 자가포식은 집중적인 단식에 반응하여 효과적으로 활성화됩니다 (그림 3a, b). 이는 노화된 단백질/세포 기관이 아미노산과 유리 지방산으로 분해되어 재활용되고 새로운 단백질과 세포 기관이 재생되는 것으로 보입니다. 자가포식 시작은 Beclin1-PI3K C3 복합체의 핵심 구성 요소인 Beclin1에 크게 의존합니다 (Kroemer et al., 2010). Beclin1의 발현이 증가하면 자가포식이 강화됩니다 (Wang et al., 2009). 흥미롭게도, 단식의 형태에 따라 p62의 조절에 미치는 영향이 약간 다릅니다. 본 연구에서는 집중적인 단식에서 p62가 감소한 반면 (그림 3a), 불완전한 단식에서는 p62가 증가했습니다 (Bagherniya et al., 2018). 반대로, 백혈구의 세포 사멸 과정은 72시간의 집중적인 단식 후 억제되기 쉬우며, 이는 유세포 분석 및 오믹스 시그니처에 의해 입증되었습니다 (그림 4). 이는 자가포식을 활성화하지만 세포 사멸을 억제하는 Beclin1의 역할과 일치합니다 (Wang, 2008). 흥미롭게도, 단기간의 집중적인 단식은 면역 기능을 강화하지만, 만성 염증 환자에게 후속적인 해를 끼칠 수 있는 장기적인 염증을 악화시키지 않습니다. 최근 연구에서 우리는 7일간의 재급식 과정 후 7일 및 일부 참가자의 경우 14일간의 집중적 단식 후 혈액학적 프로필을 모니터링했으며, 집중적 단식 후 백혈구 군집의 구성은 더 균형 잡힌 것으로 나타났습니다(Fang et al., 2021). 그럼에도 불구하고, 간헐적 집중적 단식이 만성 염증이나 조직 손상과 같은 다른 임상적 합병증에 미치는 단기적 및 장기적 효과를 조사하는 것이 도움이 될 것입니다.

많은 바이러스는 자가포식을 유발하는 경로를 차단하여 숙주의 자가포식을 억제합니다. 최근 연구에 따르면 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)도 숙주의 자가포식 활동을 억제하며, 체외에서 스페르미딘, AKT 억제제 MK-2206 및 베클린-1 안정화제, 항기생충제인 니클로사미드를 투여하면 SARS-CoV-2의 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났습니다 (Gassen et al., 2020). 이는 SARS-CoV-2 감염에 대한 자가포식의 잠재적 적용 가능성을 시사합니다. 면역력 저하는 바이러스 질환의 위험을 높입니다. 코로나19(COVID-19)와 같은 치명적인 바이러스의 빠른 변이로 인해 신속히 개발된 약물과 백신 효과에 도전받기 때문에, 단식 등을 포함한 의료적 및 비의료적 개입을 통해 면역력을 강화하는 것이 이 질환을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다(Bartleson et al., 2021; Hannan et al., 2020). 집중적인 단식은 극심한 기아 스트레스를 유발하며, 이는 불완전한 단식보다 자가포식(autophagy)을 더 활성화시켜 바이러스 질병에 대항하기 위해 숙주 면역 체계를 더 잘 준비시킬 가능성이 있습니다.

그러나, 우리의 실험에는 몇 가지 한계가 있습니다. 이 단식 연구에 참여한 피험자들은 서로 다른 건강 상태에 있기 때문에, 비교 가능한 대조군을 모집하기가 어렵습니다. 또한, 같은 장소에서 며칠 동안 아무것도 먹지 않고 혈액 샘플을 기증하도록 요청하는 대규모 코호트를 조직하는 것도 쉽지 않습니다. 각 채취 시의 양은 자발적으로 참여한 대상자의 사전 동의에 전적으로 기반했습니다. 샘플의 품질도 대상자 간에 차이가 있었으며, 동일한 대상자에서도 두 번의 채취 시점(0시간 및 72시간 단식) 사이에 차이가 있어 다중 오믹스 분석을 위한 코호트 규모가 작았고 일부 샘플은 쌍을 이루지 못했습니다. 그러나 실험실 생화학적 분석에 사용된 대상자 수는 각 샘플당 필요한 양이 훨씬 적었기 때문에 훨씬 더 많았습니다.

심리적 유도 요인이 면역 기능에 영향을 미친다는 것은 알려져 있습니다(Black & Slavich, 2016; Davidson et al., 2003). 심리적 요인이 집중적 금식에 미치는 영향을 실험동물로 검증하는 것은 사실상 불가능합니다. 실험실 쥐는 4일간의 물만 섭취하는 금식에서 생존하지 못했습니다. 또한 분석에 사용된 대상의 연령에 큰 변이가 있었으며, 면역 체계가 연령에 따라 변화한다는 점을 고려해도 유사한 연령 그룹으로 데이터를 분류할 수 없었습니다. 연령별 그룹으로 구성된 대규모 코호트를 대상으로 한 향후 연구는 집중적 금식이 면역 체계에 미치는 영향을 심층적으로 이해하고 심리적 개입과 금식 효과 간의 직접적인 연관성을 확립하는 데 필요합니다.

마지막으로, 이 연구는 집중적 단식 맥락에서 백혈구 발현 프로파일링에 초점을 맞췄습니다. 단백질의 포스트트랜스레이셔널 변형과 유전체 및 대분자의 에피게놈 조절도 집중적 단식에 대한 면역 기능 재편에 관여할 수 있습니다. 따라서 우리는 집중적 단식이 선천적 면역 재편에 미치는 영향은 전사 및 번역 수준에서의 유전자 발현 패턴 변화가 부분적으로만 책임진다는 점을 인정합니다.

4. CONCLUSION

We observed that occasional short‐term intensive fasting has a significant effect on immune function, especially innate immunity. Leukocyte survival can be promoted by enhanced autophagy and decreased apoptosis 72 h after intensive fasting. The degranulation of neutrophils increased significantly, and cytokines that govern immune cells are mostly increased, largely released by neutrophils. This suggests that occasional intensive fasting enhances innate immune function. In summary, our study provides a comprehensive transcriptomic and proteomic profiling of leukocytes after 72‐h intensive fasting and provides new insights into the pathways involved in the systemic immune remodeling after occasional short‐term intensive fasting. Altogether, this suggests that occasional short‐term intensive fasting may be exploited as an immune‐modulatory intervention.

4. 결론

우리는 간헐적인 단기 집중 단식이 면역 기능, 특히 선천적 면역에 상당한 영향을 미친다는 것을 관찰했습니다. 집중 단식 72시간 후에는 자가포식이 강화되고 세포 사멸이 감소하여 백혈구 생존이 촉진될 수 있습니다. 호중구의 탈과립이 크게 증가했으며, 면역 세포를 조절하는 사이토카인이 대부분 증가했으며, 대부분 호중구에 의해 방출되었습니다. 이는 간헐적인 집중 단식이 선천적 면역 기능을 강화한다는 것을 시사합니다. 요약하면, 본 연구는 72시간 집중적 단식 후 백혈구의 전사체 및 단백체 프로파일링을 종합적으로 분석했으며, 간헐적 단기 집중적 단식 후 전신 면역 재편성에 관여하는 경로에 대한 새로운 통찰을 제공했습니다. 전체적으로 이는 간헐적 단기 집중적 단식이 면역 조절 개입으로 활용될 수 있음을 시사합니다.

5. EXPERIMENTAL PROCEDURES

5.1. Ethics

The study was approved from Institutional Ethics Review Board at Soochow University (Approval No. ECSU‐2019000153) and the Chinese Clinical Trial Register, an official review board of China for clinical trial (Registration No. ChiCTR1900027451). 11 participants aged from 29 to 60 years old for the multi‐omics study (Table S1), 57 participants aged from 16 to 59 for blood routine test (Table S2), and 40 participants aged from 27 to 67 for biochemical analysis (Table S3; statistic data presented solely in Figures S3; were from the same subjects in an earlier fasting event), and were recruited by the research team. Participants were enrolled after giving their written informed consent.

5.2. Fasting protocol

Intensive fasting was done in the way as described earlier (Fang et al., 2021). To facilitate the intensive fasting, psychological induction such as meditation was conducted with the subjects during the fasting period. The sampling used for this study was taken at 0 and 72 h of the fasting to examine the impact on immune response from a short‐term intensive fasting. The participants chosen for this study were solely based on their informed consent on providing more blood sampling sufficient for multi‐omics study.

5.3. Flow cytometry cell sorting

Peripheral blood mononuclear cells were harvested by density centrifugation (Ficoll‐Paque, GE Healthcare Life Sciences). Cells were stained with fluorochrome‐conjugated antibody (CD45 FITC, eBioscience), and CD45‐positive cells were sorted by flow cytometry (BD FACSAria III). Cells were stained with antibody (CD45 BV421, Biolegend) and analyzed apoptosis by kit (FITC annexin V apoptosis detection kit, BD).

5.4. mRNA library construction

Total RNA was extracted from the tissues using Trizol (Invitrogen) according to manual instruction. Oligo(dT)‐attached magnetic beads were used to purify mRNA. The purified mRNA was then fragmented into small pieces with fragment buffer at appropriate temperature. First‐strand cDNA was generated using random hexamer‐primed reverse transcription, followed by a second‐strand cDNA synthesis. A‐Tailing Mix and RNA Index Adapters were then added by incubating. The cDNA fragments obtained from previous step were amplified by PCR, and products were purified by Ampure XP Beads and then dissolved in EB solution. The product was validated on the Agilent Technologies 2100 bioanalyzer for quality control. The double‐stranded PCR products from previous step were heated denatured and circularized by the splint oligo sequence to get the final library. The single‐strand circle DNA was formatted as the final library. The final library was amplified with phi29 to make DNA nanoball (DNB) which had more than 300 copies of one molecular, DNBs were loaded into the patterned nanoarray and single end 50 bases reads were generated on BGIseq500 platform (BGI).

5.5. Reference genome and annotation

Human genome sequence (primary assembly, GRCh38.p13) fasta file, comprehensive gene annotation GTF file (primary assembly, GENCODE release 36), and metadata (UniProtKB/SwissProt entry associated with the transcript, GENCODE release 36) were downloaded from GENCODE website. The index for HISAT2 was built using GENCODE genome sequences according to hisat2‐build manual. Gene features (gene length, gene‐transcript‐swissprot‐id conversion) were generated from the GTF file using in‐house scripts.

5.6. mRNA quantification pipeline

All 14 sequenced fastq files were generated and cleaned by BGI; then, we aligned the RNA sequencing reads using HISAT2 (version 2.2.1) (Kim et al., 2019) with self‐built ht2 index (Alignment result is listed in Table S4). The parameters were default for single‐end analysis. Aligned reads were stored in SAM files. Next, we sorted SAM files into BAM files as well as for compression using SAMtools(version 1.11) (Danecek et al., 2021). For quantification, featureCounts (Liao et al., 2014) from Subread package (version 2.0.1) was used with comprehensive gene annotation GTF with exon as feature type and with gene id as meta feature. Quantification results were stored in tab‐delimited format.

5.7. Principal component analysis

Two‐dimensional principal component analysis (PCA) was conducted using python library Scikit‐learn module PCA (Pedregosa et al., 2011). RNA read count matrix was normalized using sklearn.preprocessing. PowerTransformer class. Protein abundance was normalized using z‐scoring. PCA scatter plots were plotted using python library Seaborn (Ref https://doi.org/10.21105/joss.03021). Confidence ellipse was also generated with two standard deviations to the corresponding group values.

5.8. RNA‐Seq differential expression‎ analysis

DEG analysis was performed using R package DESeq2 (version 1.30.0) (Love et al., 2014). Paired analysis was performed with the condition parameter included with both individual identities for each sample and treatment, while unpaired analysis was performed with only the treatment parameter. We determine DEGs with |log2FoldChange| >1 and adjusted p value <0.05. Venn diagram was plotted using python library matplotlib with up/down DEGs from those two analytical approaches. A intersect set of DEGs (SigDEGs) of paired DEGs and unpaired DEGs were extracted for further analysis.

5.9. Proteomic extraction

Leukocyte sample was sonicated three times on ice using a high‐intensity ultrasonic processor (Scientz) in lysis buffer (8 M urea, 1% Protease Inhibitor Cocktail). (Note: For PTM experiments, inhibitors were also added to the lysis buffer, for example, 3 μM TSA and 50 mM NAM for acetylation) The remaining debris was removed by centrifugation at 12,000 g at 4°C for 10 min. Finally, the supernatant was collected and the protein concentration was determined with BCA kit according to the manufacturer's instructions.

5.10. Trypsin digestion

For digestion, the protein solution was reduced with 5 mM dithiothreitol for 30 min at 56°C and alkylated with 11 mM iodoacetamide for 15 min at room temperature in darkness. The protein sample was then diluted by adding 100 mM TEAB to urea concentration <2 M. Finally, trypsin was added at 1:50 trypsin‐to‐protein mass ratio for the first digestion overnight and 1:100 trypsin‐to‐protein mass ratio for a second 4 h‐digestion.

5.11. LC‐MS/MS analysis

The tryptic peptides were dissolved in 0.1% formic acid (solvent A), directly loaded onto a home‐made reversed‐phase analytical column. The gradient was comprised of an increase from 6% to 23% solvent B (0.1% formic acid in 98% acetonitrile) over 26 min, 23% to 35% in 8 min and climbing to 80% in 3 min then holding at 80% for the last 3 min, all at a constant flow rate of 400 nl/min on an EASY‐nLC 1000 UPLC system. The peptides were subjected to NSI source followed by tandem mass spectrometry (MS/MS) in Q ExactiveTM Plus (Thermo) coupled online to the UPLC. The electrospray voltage applied was 2.0 kV. The m/z scan range was 350–1800 for full scan, and intact peptides were detected in the Orbitrap at a resolution of 70,000. Peptides were then selected for MS/MS using NCE setting as 28 and the fragments were detected in the Orbitrap at a resolution of 17,500. A data‐dependent procedure that alternated between one MS scan followed by 20 MS/MS scans was applied with 15.0s dynamic exclusion. Automatic gain control (AGC) was set at 5E4. Fixed first mass was set as 100 m/z.

5.12. Protein database search

The resulting MS/MS data were processed using Maxquant search engine (v.1.5.2.8). Tandem mass spectra were searched against human uniprot database concatenated with reverse decoy database. Trypsin/P was specified as cleavage enzyme allowing up to four missing cleavages. The mass tolerance for precursor ions was set as 20 ppm in First search and 5 ppm in Main search, and the mass tolerance for fragment ions was set as 0.02 Da. Carbamidomethyl on Cys was specified as fixed modification and acetylation modification and oxidation on Met were specified as variable modifications. False‐discovery rate (FDR) was adjusted to <1% and minimum score for modified peptides was set >40.

5.13. Differential protein expression‎ analysis

We first calculated the relative expression‎ based on samples’ LFQ intensity. Protein expression‎ differences are determined based on the ratio of Fasted versus Control. Statistical significance is determined using two‐tailed Student's t test. We determine DEPs with |log2FoldChange| >log2(1.5) and adjusted p value <0.05.

5.14. Gene ontology and annotations

Gene ontology OBO file (release 1 February 2021) was downloaded from geneontology.org. Human gene ontology annotation GAF file (release 1 December 2020) was downloaded from EBI Gene Ontology Annotation Database.

5.15. Gene ontology enrichment analysis

We conducted overrepresentation analysis on DEGs/DEPs identified from differential analysis using python library GOAtools. All DEG enrichment query lists were converted from Ensemble gene id to protein id for convenience. Enrichment background was generated from gene ontology annotation GAF file using in‐house script. Criterion for identifying significantly overrepresented terms was set as adjusted p value <0.05.

5.16. Gene ontology DAG search

Ancestors and descendants of certain pathways were identified using in‐house directed acyclic graph (DAG) search module derived from GOAtools. All search results were validated manually.

5.17. Gene set enrichment analysis

We conducted Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) on pre‐ranked gene lists with log2FoldChange as ranking metric using GSEA v4.1.0 (Subramanian et al., 2005). We used gene ontology biological process terms as gene sets, and the gene sets were generated using in‐house script from gene ontology associations middleware from gene ontology analysis. We use nominal p value with the criteria of nominal p value lower than 0.05 to identify significant GSEA results.

5.18. Cytokine contribution analysis

Expression‎ data were extracted from Human Protein Atlas. Original expression‎ metric was normalized for each cytokine to indicate the contribution of each type, and the percentages of all cytokines were stacked in each cell type to illustrate the overall contribution from each cell type.

5.19. Human peripheral blood Acquisition and laboratory biochemical analysis

The blood is mixed promptly with the EDTA to avoid sample clotting. The samples were analyzed on the automatic five categories hematology analyzer (Siemens). Blood routine test and laboratory biochemical analysis were performed in the way described previously (Fang et al., 2021). Briefly, whole blood without anticoagulant was incubated at 4°C overnight and then centrifuged at 500 g for 20 min at room temperature. All serum samples were separated and frozen at −80°C until laboratory testing. Serum was analyzed for blood lipids with the Chemistry Analyzer (Roche, cobas c702) by Dian Diagnostics, China. This information has been included in the revised manuscript.

5.20. Statistical analysis

Absolute values in complete blood count were analyzed using paired Student's t test, and percentages were analyzed using Wilcoxon matched‐pairs signed rank test. Percentages of apoptotic status in flow cytometry were analyzed using Wilcoxon matched‐pairs signed rank test.

CONFLICT OF INTEREST

All authors declare no competing interests.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

JQ and YF designed the study, analyzed the data and wrote the manuscript. NY, YF, SZ, XG, YL, LL, LX, WW, CZ, and QL co‐organized the fasting practice, collected and prepared samples, and discussed the manuscript. JW conceived the study, and finalized the manuscript.

Supporting information

Supplementary Material

Click here for additional data file. (1,022.7KB, pdf)

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank all the volunteers participating in this fasting study and the campus Hospital of Soochow University for providing the facilities in the collection of blood samples and taking physical measurement. This study was supported in part by the National Natural Science Foundation of China by grants 91649113 and 82170227 (to JW), 82000117 (to YF), and by Soyo Center of Soochow University (to JW) by grant H190443, and by the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China (to YF) by grant BK20200191, and by the Postdoctor Science Foundation of Jiangsu Province (to YF) by grant 2020Z064, and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, the Project of State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University by grant No. GZC00201 (to JW), the Aerospace Medical Experiment Project of Space Station by grant No. HYZHXM02002, as well as by the Hui‐Chun Chin and Tsung‐Dao Lee Chinese Undergraduate Research Endowment (CURE) (to QL).

Qian, J. , Fang, Y. , Yuan, N. , Gao, X. , Lv, Y. , Zhao, C. , Zhang, S. , Li, Q. , Li, L. , Xu, L. , Wei, W. , & Wang, J. (2021). Innate immune remodeling by short‐term intensive fasting. Aging Cell, 20, e13507. 10.1111/acel.13507

Jiawei Qian, Yixuan Fang and Na Yuan contributed equally to this work.

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The data that support the findings of this study are available from the corresponding authors upon request.

REFERENCES

1. Adawi, M. , Watad, A. , Brown, S. , Aazza, K. , Aazza, H. , Zouhir, M. , Sharif, K. , Ghanayem, K. , Farah, R. , Mahagna, H. , Fiordoro, S. , Sukkar, S. G. , Bragazzi, N. L. , & Mahroum, N. (2017). Ramadan fasting exerts immunomodulatory effects: Insights from a systematic review. Frontiers in Immunology, 8, 1144. 10.3389/fimmu.2017.01144 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
2. Ajona, D. , Ortiz‐Espinosa, S. , Lozano, T. , Exposito, F. , Calvo, A. , Valencia, K. , Redrado, M. , Remírez, A. , Lecanda, F. , Alignani, D. , Lasarte, J. J. , Macaya, I. , Senent, Y. , Bértolo, C. , Sainz, C. , Gil‐Bazo, I. , Eguren‐Santamaría, I. , Lopez‐Picazo, J. M. , Gonzalez, A. , … Pio, R. (2020). Short‐term starvation reduces IGF‐1 levels to sensitize lung tumors to PD‐1 immune checkpoint blockade. Nature Cancer, 1(1), 75–85. 10.1038/s43018-019-0007-9 [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
3. Bagherniya, M. , Butler, A. E. , Barreto, G. E. , & Sahebkar, A. (2018). The effect of fasting or calorie restriction on autophagy induction: A review of the literature. Ageing research reviews, 47, 183–197. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
4. Bartleson, J. M. , Radenkovic, D. , Covarrubias, A. J. , Furman, D. , Winer, D. A. , & Verdin, E. (2021). SARS‐CoV‐2, COVID‐19 and the aging immune system. Nature Aging, 1, 769–782. 10.1038/s43587-021-00114-7 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5. Black, D. S. , & Slavich, G. M. (2016). Mindfulness meditation and the immune system: a systematic review of randomized controlled trials. Annals of the New York Academy of Sciences, 1373(1), 13–24. 10.1111/nyas.12998 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
6. Bloom, W. L. (1959). Fasting as an introduction to the treatment of obesity. Metabolism: Clinical and Experimental, 8(3), 214–220. [PubMed] [Google Scholar]
7. Burgener, S. S. , Leborgne, N. , Snipas, S. J. , Salvesen, G. S. , Bird, P. I. , & Benarafa, C. (2019). Cathepsin G inhibition by Serpinb1 and Serpinb6 prevents programmed necrosis in neutrophils and monocytes and reduces GSDMD‐driven inflammation. Cell Reports, 27(12), 3646–56.e5. 10.1016/j.celrep.2019.05.065 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
8. Cao, Y. , Zhang, S. , Yuan, N. A. , Wang, J. , Li, X. , Xu, F. , Lin, W. , Song, L. , Fang, Y. , Wang, Z. , Wang, Z. , Zhang, H. , Zhang, Y. I. , Zhao, W. , Hu, S. , Zhang, X. , & Wang, J. (2015). Hierarchal autophagic divergence of hematopoietic system. The Journal of Biological Chemistry, 290(38), 23050–23063. 10.1074/jbc.M115.650028 [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
9. Capozzi, M. E. , Coch, R. W. , Koech, J. , Astapova, I. I. , Wait, J. B. , Encisco, S. E. , Douros, J. D. , El, K. , Finan, B. , Sloop, K. W. , Herman, M. A.