Colocalization-NTA (C-NTA) Zetaview®

[With위드인스트루먼트]

인간 혈소판 유래 MSX-EVs에서의 이중 염색된 CD9과 CD41의 측정

안녕하세요. Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점, 위드인스트루먼트입니다.

이번 포스팅에서는 Colocalization-NTA, C-NTA 분석기인 Zetaveiw를 이용하여

CD9과 CD41로 이중 형광 염색된 인간 혈소판 유래 MSC-EVs(Extracellular Vesicles)의

이중 형광 검출 방법을 설명 드리겠습니다.

약 10여년간 NTA(Nano particle Tracking Analysis)는 EVs의 특성을

하기위한 기술로서 확립되었습니다. 처음 NTA는 Scatter mode에서

EV의 크기분포, 농도의 측정에 사용되었고 이후 Fluorescence-NTA가 개발되며

형광 표정 분석이 가능해지게 되어 연구 분야의 동향에 맞는 혁신적인 위치에 도달하였습니다.

새로 출시된 Particle Metrix GmbH 사의 Zetaview® 시스템인 PMX-230 TWIN Zetaview

또는 PMX-430 QUATT Zetaview 모델을 사용하면 이제 동일한 입자에서 두 개의 독립적인

형광을 감지할 수 있습니다. 두 개의 레이저와 각각 형광 필터의 초고속 전환으로 해당 형광을

감지하여 분석할 수 있습니다.

이번 실험에서는 EV marker 단백질 역할도 하는 세포 표면 항원 CD9, CD41에 대한

형광 접합 항체를 사용하여 이중 염색된 MSC 유래 EVs에 대한 Colocalization을

설명하고자 합니다. NTA colocalization 결과를 이미지 유동 세포 계측

IFCM(Image follow cytometry) 결과와 비교하여 설명 드리겠습니다.

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EVs의 형광 표지 마커를 부착 및 측정하기 까지의 절차

1) 측정 농도가 3.7x1011 particles/ml 인 MSC-EV 1㎕

2) anti-Human CD9-APC 항체의 1:7.5로 희석된 희석액 7.5㎕

3) anti-Human CD41-AF488 항체의 1:10 희석액 10㎕

4) PBS buffer 1.5㎕

1~4를 섞은 후 실온의 암실에서 2시간 동안 보관, 배양 후 전체 혼합물에

PBS를 전체 2ml가 되도록 추가해주고 NTA 및 IFCM 분석을 진행하였습니다.

Lysis Control은 비이온성 세제 NP-40으로 준비하고 EV의 막 파열에 사용되었습니다.

보관 이후 20㎕의 0.5% NP-40용액을 형광 표기 마커가 부착된 EV 혼합물에 첨가하여

최종 농도가 0.25% NP-40이 되도록 한 후 실온의 암실에서 30분 동안 더 보관해주었습니다.

용해된 혼합물 또한 PBS를 전체 2ml가 되도록 추가해주고 NTA, IFCM분석을 진행하였습니다.

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NTA, Colocalization 측정

크기, 농도 NTA 측정은 Zetaveiw PMX-420 QUATT를 사용하였습니다.

Colocalization data 획득은 Zetaveiw PMX-230 TWIN 모델을 사용하였습니다.

Colocalization 실험은 자동화된 일련의 단계로 구성되어 짧은 비디오 촬영 기술을

통해 빨간색, 녹색 형광채널에서 기록된 후 다음 두 채널의 overlay가 진행됩니다.

Colocalization event는 적색, 녹생 형광 태그를 모두 포함하는 입자가

브라운 동작 범위 내에서 두 채널 모두에서 감지를 생성할 때 발생합니다.

Colocalization 비율은 ex640/F660, ex488/F500 각각의 채널에서 감지된 값에서

Colocalization event 수를 나누어 계산합니다.

PMX-420 QUATT의 측정 parameter setting

PMX-230 TWIN의 측정 parameter setting

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Imaging Flow cytometry (IFCM)

IFCM은 Amnis® ImageStream®X Mark II 장비를 이용하여 측정하였습니다.

IFCM의 측정 parameter setting

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입자 크기 및 농도 측정 결과

NTA 측정 결과 scatter 모드에서 입자 직경의 중간값(X50)은 127nm였으며,

농도는 3.68x10^11 particles/ml 이였습니다.

측정 sample에서 EVs의 phenotypes(표현형)을 특이적으로 검출하기 위해 입자는

EV의 marker로 알려진 CD9-APC 항체와 CD-41-AF488을 각각 이중 표지하였고 CD9와

CD41이 결과에서 검출된 것으로 소포체를 증명하며 5회 반복 측정을 통해 결과를 얻었습니다.

Scatter 모드에서 측정된 MSC-EV의 크기 분포표(회색), CD41, CD9로 동시에 형광 염색되어 있는 상태에서 형광 모드에서 측정한 결과 (녹색, 붉은색)

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CD41이 detection된 EVs는 110.6nm의 중간 직경과 2.06x10^10 particles/ml의

농도를 나타냈고 CD9이 detection된 EVs 126.2nm의 중간 직경과

3.38x10^10 particles/ml 의 농도였습니다. CD9과 CD41의 EVs의 비율은 각각 5.6%,

9.1%로 나타나 측정한 sample가 순도가 높지 않고 다른 나노 입자들을 많이

포함하고 있다 예상할 수 있었습니다.

Colocalization의 측정은 일반적으로 생물학적 표본 내에서 근접한 입자의 최소 두 가지의

특정 표지를 동시 감지하는 것을 말하고, 여기서는 특정 형광으로 표지 됩니다.

NTA를 사용하여 Colocalization 비율을 정확하게 정량화 하기 위한 주요 전체 조건으로

1) 두 레이저에 의한 동일한 측정 부피의 레이저 조사

2) 레이저 채널 사이의 짧은 전환 시간으로 시야 밖으로 확산되는 입자 손실을 최소화

3) 검색 반경 설정으로 잘못된 결과의 분석 가능성 최소화

MSC-EVs의 동시 염색 Colocalization 결과는 아래와 같습니다.

CD9-APC, CD41-AF488로 이중 염색된 MSC-EVs의 산란 현상을 x-y 좌표로 나타낸 화면 (각 녹색 점은 CD41 detection된 입자를 나타내고 각 붉은 점은 CD9 detection 입자를 나타냅니다. 이중으로 detection된 EVs는 보라색 십자가로 표시 되었습니다.)

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Colocalization 측정은 58.5%(±5.5)의 평균 비율을 나타냈는데,

이는 CD41에 양성인 EVs중 58%가 CD9을 보유하고 있음을 의미합니다.

IFCM을 통한 결과로도 CD41, CD9 이중양성 EV에 대해 58%를

제공한 결과를 확인할 수 있습니다.

IFCM으로 이중 염색된 MSC-EV로 진행한 IFCM을 scatter plot의 형태로 도출한 그래프

EV의 58%는 CD41, CD9에 대해 DP (double-positive)로 간주합니다.

형광 신호가 인공물이 아닌 막 입자에서 유래된 것임을 확인하기 위해 NP-40으로

용해를 진행하여 지질층이 파괴되어 F-NTA 신호가 감소하게 됩니다.

NP-40 lysis 진행한 control 결과는 4%(±4)로 매우 적은 입자가 확인되었고,

입자들 중 Colocalization 결과는 아래와 같이 확인할 수 있었습니다.

x-y 좌표로 나타낸 2중 형광 염색 진행한 MSC-EVs를 0.5% NP-40에 보관한 후 4%의 입자만 두개의 형광 결과에서 검출

NP-40 컨트롤에서의 입자수의 급격한 감소와 Colocalization의 매우 낮은 비율은 실제로

F-NTA로 감지한 EV입자가 membrane으로 둘러싸여 있다는 것을 나타냅니다.

또한, IFCM 통한 결과로도 5%의 결과를 확인할 수 있었습니다.

IFCM으로 NP-40을 이용한 용해 대조군에서 5%의 DP(double-positive)의 값으로 나타낸 그래프

NTA에 의해 분석된 scatter및 형광 모드 분석, negative control(PBS, antibody reagent, NP-40) / 위 – particle concentration, 아래 - particle diameter

NP-40 대조군은 Scatter 모드에서 입자 수가 54% 감소하고 형광 모드에선

입자가 없음을 확인했습니다. 일부 입자가 Colocalization 측정에서 감지되긴 하였지만

기존 F-NTA에서는 감지되지 않은 것으로 미뤄보아 측정 예상 결과와 다른 특징을

가진 입자로 설명할 수 있습니다.

이번 연구를 통해 CD41, CD9에 양성인 EVs를 측정하였고 입자 수를 Scatter와

형광 모드에서 비교하였고, 인간 혈소판 유래 MSC-EVs 입자에서의 측정은 F-NTA가

이상적인 방법임을 확인할 수 있었습니다.

생물학적 나노 입자에서 이 방법은 결합되지 않은 항체를 제거하기 위한 세척 단계가

필요하지 않았기 때문에 빠르고 재현성이 높은 결과로 입증되었습니다.

C-NTA와 IFCM에서 얻은 Colocalization 결과는 매우 유사하여 혈소판 유래(CD41-양성)

CD9-양성 EVs가 Test 샘플에 존재한다는 것을 입증합니다.

Data를 통해 Target antibody의 염색을 진행할 때에 Scatter 기반 NTA보다

F-NTA(Fluorescence NTA)를 통하여 더 높은 수준을 결정할 수 있었음을 확인할 수 있었습니다.

또한 C-NTA는 정확한 크기 결정의 이점을 포함하여 단일 측정에서 입자수준의

biomarker를 감지하고 식별하기 위한 정확한 도구임 또한 입증되었습니다.

따라서 C-NTA는 단일 F-NTA 또는 Scatter 기반 NTA를 보완하여 보다 표적화 된 결과를

제공하여 EVs(Extracellular Vesicles)의 연구에 있어서 알려지지 않은 것을

밝히는 데에 도움이 됩니다.

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