Vector

[Vector] 1. Vector에 대해 1. DNA의 이송(biological transfer)을 담당. 외부 DNA를 포함할 수 있고, 그 DNA를 다른 세포에서 복제될 수 있도록 하는 유전 요소 (genetic element) 2. Vector는 숙주세포 안에서 복제할 수 있어야만 하고 10 kb 이하로 비교적 작아야 할 필요가 있다(너무 큰 경우, 조작 중 파괴될 가능성이 높아짐). 이러한 기준을 만족시키는 두 종류의 DNA분자는 bacterial cell에서 발견될 수 있다.(plasmids and bacteriophage chromosome) 3. 숙주세포 1개당 수가 많고(copy수가 많다고 표현한다), 간단히 분리정제할 수 있어야한다. 4. 작은 DNA분자로 불필요한 유전정보를 될 수 있는 한 가지고 있지 않음으로써 큰 passenger DNA를 cloning 할 수 있어야 한다. 5. 복제 개시점(origin)이외의 부분을 한군데 절단하는 제한효소가 여러 가지 있어야 한다. 6. Vector DNA나 재조합 DNA를 가지고 있는 숙주세포를 용이하게 검출할 수 있는 유전자를 marker가지고 있어야 한다. 7. 만약 cloning한 passenger DNA를 발현시킬 경우에는 passenger DNA를 발현시키기 위한 promoter를 가지고 있어야 한다. 현재 대장균에 사용되고 있는 vector는 대별해서 plasmid vector과 phage vector가 있다. (1) Plasmid vector: 현재 가장 흔히 이용되고 있는 plasmid vector로는 pBR322와 pUC계의 plasmid가 있다. pBR322는 4,361bp로 구성되어 있으며 유전자 marker로서 ampicillin내성유전자(Ampr)와 tetracycline내성유전자(Tetr)를 가지고 있다. 항생물질 내성유전자내에 외래 DNA가 삽입되면 내성을 잃게 된다. 예를 들면 BamH I, Sph I또는 Sal I 위치에 외래 DNA가 삽입되면 그 재조합체는 ampicillin에는 내성이지만, tetracycline에 대해서는 감수성으로 된다. 반면 Pst I위치에 외래 DNA가 삽입되면 그 재조합체는 tetracycline에는 내성이지만 , ampicillin에는 감수성이 된다. 이와 같이 한 약제에는 내성이고 다른 약제에는 감수성인 균을 선별하게 되면 재조합체를얻게 된다. 이와 같은 방법을 삽입실활법이라 한다. pUC계의 plasmid로 널리 이용되고 있는 것은 pUC18, pUC19, pUC118, pUC119등이 있다. pUC계 palsmid는 선별 marker로서 ampicillin내성유전자와 베타-galactosidase유전자(lacZ)를 가지고 있고, 베타-galactosidase유전자 상에는 multi-cloning부위가 존재한다. pUC plasmid를 가지고 있는 대장균을, X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-베타-galactoside)를 함유한 plate에서 증식시키게 되면 균체 내로 침투한 X-gal이 생산된 베타-galactosidase에 의해 분해되어 청색의 colony를 만든다. 베타-galactosidase 생산유전자상의 multi-cloning 부위에 DNA단편이 cloning되면 베타-galactosidase유전자는 불활성화 유전자는 백색의 로 된다. 또한 lactose operon의 promoter또는 operator의 아래쪽에 외래 DNA를 삽입시킬 수도 있으므로 외래 DNA를 형질발현시키는 것도 가능하다. (2) Phage vector: Phage vector의 이점은 plasmid vector보다 큰 DNA단편의 삽입이 가능하다는 것이다. 현재 람다 phage를 기본으로 하는 많은 람다 phage계 vector가 개발되어 있다. 람다 phage는 분자량이 32*106(48,502bp)인 직쇄상의 이중쇄 DNA를 게놈으로 가지고 있다. 이중쇄 DNA의 양끝에는 12개의 염기로 된 단일가닥의 접착말단(cos부위)이 존재한다. 람다 phage는 숙주세포에 감염 후 양 말단의 부착말단끼리 결합하여 환상화 된다. 재조합 DNA실험에서는 이 환상의 이중 DNA를 재조합 DNA제작에 이용한다. 2. Vector로써의 특징 ①can replicate within the host cell ②also need to be relatively small ideally less than 10 kb in size 3. Vectorse ①cloning vector 유전자(gene)가 재조합(recombination)될 수 있고, 그 재조합된 유전 물질 전체가 복제(replication)될 수 있는 유전 요소 (genetic element). plasmid와 bacteriophage (λ or M13) 등이 주로 쓰인다. ②expression‎ vector molecular cloning된 유전자가 전사(transcription)와 번역(translation)이 일어날 수 있도록 필요한 조절 서열 (regulatory sequences)을 가진 cloning vector ③shuttle vector 둘 이상의 서로 다른 숙주 세포(hosts)에서 복제될 수 있는 cloning vector