Re: Ketogenic diet . 자가면역질환 치료 기전. 2024년 cell

[문형철]

ArticleVolume 43, Issue 11114891November 26, 2024Open access

A diet-dependent host metabolite shapes the gut microbiota to protect from autoimmunity

Highlights

Ketogenic diets rescue neuroinflammation in a microbiota-dependent manner

The diet-induced host metabolite β-hydroxybutyrate (βHB) is necessary and sufficient

Transfer of the βHB-associated microbiota protects against neuroinflammation

Gut bacterial indole lactate contributes to these neuroprotective effects

Summary

Diet can protect from autoimmune disease; however, whether diet acts via the host and/or microbiome remains unclear. Here, we use a ketogenic diet (KD) as a model to dissect these complex interactions. A KD rescued the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model of multiple sclerosis in a microbiota-dependent fashion. Dietary supplementation with a single KD-dependent host metabolite (β-hydroxybutyrate [βHB]) rescued EAE, whereas transgenic mice unable to produce βHB in the intestine developed more severe disease. Transplantation of the βHB-shaped gut microbiota was protective. Lactobacillus sequence variants were associated with decreased T helper 17 cell activation in vitro. Finally, we isolated an L. murinus strain that protected from EAE, which was phenocopied by a Lactobacillus metabolite enriched by βHB supplementation, indole lactate. Thus, diet alters the immunomodulatory potential of the gut microbiota by shifting host metabolism, emphasizing the utility of taking a more integrative approach to study diet-host-microbiome interactions.

Introduction

Diet has broad impacts on autoimmune disease, including multiple sclerosis (MS), inflammatory bowel disease, and rheumatoid arthritis,1,2,3,4,5 but the mechanisms responsible remain unclear. Consumption of a high-fat, low-carbohydrate ketogenic diet (KD) improves MS-related symptoms in humans6,7,8 and mice.9,10,11 KDs are defined by a metabolic shift in host metabolism to lipid oxidation, resulting in elevated concentrations of the ketone bodies β-hydroxybutyrate (βHB) and acetoacetate (AcAc) in circulation.12 AcAc and βHB have broad impacts on immune cells, acting to dampen inflammasome activation,13 alter macrophage metabolism,14 and promote T cell function,15 among other immunomodulatory effects,12 providing a direct link between diet-induced shifts in host metabolites and the immune system.

KDs can also indirectly shape the immune system by altering the trillions of microorganisms that colonize the gastrointestinal (GI) tract (the gut microbiota) and/or their aggregate genomes and metabolic activities (the gut microbiome).16,17,18,19 KD-induced shifts in the gut microbiotas of humans and mice result in decreased intestinal immune activation, in part due to the direct antimicrobial properties of βHB.16 Yet the relevance of these diet-induced shifts in the gut microbiota for disease, especially diseases outside the gut, have remained unknown. Due to the complex interactions of KDs on the host and microbiota, our goal was to gain mechanistic insights that would enable the development of more targeted interventions in future studies.

Here, we dissect the role of diet in shaping host-microbiome interactions relevant to disease. We chose to focus on the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model for multiple reasons. The EAE model has been widely used in the autoimmunity field,20,21 is microbiota dependent,22 and can be readily performed in gnotobiotic mice.23 While human MS differs in many ways from EAE,21 multiple MS-associated microorganisms exacerbate the EAE phenotype,22,23,24 and transplantation of the gut microbiota from MS patients increases disease in the EAE model relative to healthy controls.23,25 These results indicate that aspects of EAE reflect clinically relevant host-microbiome interactions, providing mechanistic insights essential to interpreting the large-scale studies correlating aspects of the gut microbiome with MS in patients.26

We identify a pathway through which a microbial community shaped by intestinal production of βHB protects from EAE disease. By pairing recently described methods for generating stable in vitro communities27 with a T helper 17 (Th17) skewing assay, we identify and isolate an immunomodulatory member of the Lactobacillus murinus species from a mouse fed the KD. This strain and its metabolite indole-3-lactate (ILA) were sufficient to decrease immune activation and ameliorate the EAE phenotype. These results provide new targets for therapeutic manipulation and a foundation to explore the mechanistic links between host and microbial metabolism in response to defined dietary perturbations.

소개

식이요법은

다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환, 류마티스 관절염 등

자가면역 질환에 광범위한 영향을 미치지만,1,2,3,4,5

그 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다.

고지방, 저탄수화물 케톤 생성 식이요법(KD)은

인간에서 MS 관련 증상을 개선합니다.6,7,8 및 쥐에서도 마찬가지입니다.9,10,11

KD는 호스트 대사에서 지방 산화로 대사 전환을 유발하여

혈중 케톤체 β-하이드록시부티레이트(βHB)와 아세토아세테이트(AcAc) 농도가

증가하는 특징을 갖습니다.12

AcAc와 βHB는

면역 세포에 광범위한 영향을 미치며,

염증체 활성화 억제,13 대식세포 대사 변화,14 T 세포 기능 촉진 등

면역 조절 효과를 통해,12

식이 유발 대사체 변화와 면역 체계 간의 직접적인 연관성을 제공합니다.

KD는 또한

장내 미생물군집(장내 미생물군)과 그 집합 유전체 및 대사 활동(장내 미생물군집)을 변화시켜

면역계를 간접적으로 형성할 수 있습니다.16,17,18,19

인간과 쥐의 장내 미생물군집 변화는

βHB의 직접적인 항균 특성으로 인해

장내 면역 활성화 감소와 관련이 있습니다.16

그러나

이러한 식이 유발 장 미생물군 변화가 질병,

특히 장 외 질병과의 관련성은 여전히 알려지지 않았습니다.

KD가 호스트와 미생물군에 미치는 복잡한 상호작용으로 인해,

본 연구의 목표는 미래 연구에서 더 타겟팅된 개입을 개발하기 위한 메커니즘적 통찰을 얻는 것입니다.

본 연구에서는

질병과 관련된 호스트-미생물군 상호작용을 형성하는

식이의 역할을 분석했습니다.

우리는 여러 이유로

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 마우스 모델을 선택했습니다.

EAE 모델은

자가면역 분야에서 널리 사용되어 왔으며,20,21

미생물군집에 의존적이며,22

무균 마우스에서 쉽게 수행 가능합니다.23

인간 다발성 경화증(MS)은 EAE와 많은 점에서 다르지만,21

MS와 관련된 여러 미생물이 EAE 증상을 악화시키며,22,23,24

MS 환자의 장 미생물군집 이식은 건강한 대조군에 비해 EAE 모델에서 질병을 증가시킵니다.23,25

이러한 결과는

EAE의 일부 측면이 임상적으로 관련 있는 호스트-미생물군 상호작용을 반영함을 보여주며,

환자에서 장 미생물군과 MS의 연관성을 분석하는 대규모 연구를 해석하는 데

필수적인 메커니즘적 통찰을 제공합니다.26

우리는

장 내 βHB 생산에 의해 형성된 미생물 군집이

EAE 질환으로부터 보호하는 경로를 식별했습니다.

최근에 보고된 안정적인 in vitro 군집 생성 방법27과 T helper 17 (Th17) 편향 검사를 결합하여,

KD를 섭취한 쥐에서 Lactobacillus murinus 종의 면역 조절 성분을 식별하고 분리했습니다.

이 균주와 그 대사산물인 인돌-3-락테이트(ILA)는

면역 활성화 감소와 EAE 증상 완화에 충분했습니다.

이 결과는 치료적 조작을 위한 새로운 표적을 제공하며,

정의된 식이 변화에 대한 호스트와 미생물 대사 간의 메커니즘적 연관성을 탐구하는 기반을 마련합니다.

Results

The impact of diet on neurological phenotypes is microbiota dependent

First, we sought to confirm‎ that a KD protects conventionally raised (CONV-R) mice from EAE.9,10 We fed 12-week-old female C57BL/6J CONV-R mice a high-fat diet (HFD, 75%:15%:10% fat:carbohydrate:protein) or a matched-ingredient KD (90.5%:0%:9.5% fat:carbohydrate:protein; Table S1). Our diets were formulated to control for ingredient differences that have confounded previous comparisons of semi-purified KDs and the more complex chow diet.9,10,11,16,28,29 As expected, the KD led to significantly increased circulating βHB relative to HFD controls (Figure S1A). Ten days after diet initiation, we induced EAE via immunization with a myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide.

Disease was assessed by four commonly used metrics22,24,30:

(1) disease score over time;

(2) the rate of disease incidence;

(3) the maximum disease developed; and

(4) the distribution of mice across maximum disease scores.

The KD significantly reduced disease severity. While HFD mice gradually increased in disease score over 28 days, the KD group had lower disease severity over time (Figure 1A). The incidence rate for the HFD group was 60% compared to 40% in the KD group (Figure 1B), with an average maximum disease score of diseased mice of 3.81 ± 0.38 compared to 2.68 ± 0.63 in the KD group (Figures 1C and 1D). These symptoms were consistent with flow-cytometry-based analyses of immune cells in the brain and spleen 16 days post immunization at peak disease. KD-fed mice had significantly lower CD4+ helper T cells co-producing interferon-γ (IFNγ) and interleukin-17a (IL-17a) in the brain and spleen, which have been previously implicated in EAE31 (Figures 1E–1H and S1B–S1D). KD-fed mice also had decreased disease severity compared to mice on a chow diet in an independent experiment (Figure S1E). Together with prior data from the intestine of healthy mice,16 these results indicate that the impact of the KD on immune activation extends beyond the GI tract to alter systemic immunity and are consistent with previous findings that KDs are protective in MS.9,10,11

결과

식이 요인이

신경학적 표현형에 미치는 영향은

미생물군집에 의존적입니다

먼저, KD가 전통적으로 사육된(CONV-R) 쥐를 EAE로부터 보호하는지 확인했습니다.9,10 12주령의 암컷 C57BL/6J CONV-R 쥐에게 고지방 식이(HFD, 지방:탄수화물:단백질 75%:15%:10%) 또는 성분 일치 KD(지방:탄수화물:단백질 90.5%:0%:9.5% 지방:탄수화물:단백질; 표 S1). 우리의 식단은 이전에 반정제 KD와 더 복잡한 일반 사료 식단을 비교할 때 혼란을 일으킨 성분 차이를 통제하기 위해 설계되었습니다.9,10,11,16,28,29 예상대로 KD는 HFD 대조군에 비해 순환하는 βHB 수치가 유의미하게 증가했습니다(그림 S1A). 식이 시작 후 10일 후, 우리는 미엘린 올리고덴드로사이트 글리코프로틴(MOG) 펩타이드로 면역 접종을 통해 EAE를 유도했습니다.

질병은 네 가지 일반적으로 사용되는 지표로 평가되었습니다22,24,30:

(1) 시간에 따른 질병 점수;

(2) 질병 발생률;

(3) 최대 질병 발달 정도; 및

(4) 최대 질병 점수에 따른 쥐의 분포.

KD는 질병 심각도를 유의미하게 감소시켰습니다. HFD 그룹은 28일 동안 질병 점수가 점차 증가했지만, KD 그룹은 시간 경과에 따라 질병 심각도가 낮았습니다 (그림 1A). HFD 그룹의 발생률은 60%였으며, KD 그룹은 40%였습니다(그림 1B). 질병을 앓은 쥐의 평균 최대 질병 점수는 KD 그룹에서 3.81 ± 0.38이었으며, KD 그룹에서는 2.68 ± 0.63이었습니다(그림 1C 및 1D). 이러한 증상은 면역 세포의 유동 세포 측정 기반 분석 결과와 일치했으며, 면역 접종 후 16일째 질병의 정점 시점에서 뇌와 비장에서 측정되었습니다. KD를 섭취한 쥐는 뇌와 비장에서 인터페론-γ(IFNγ)와 인터루킨-17a(IL-17a)를 동시에 분비하는 CD4+ 보조 T 세포의 수가 유의미하게 낮았으며, 이는 이전 연구에서 EAE와 연관된 것으로 보고되었습니다31 (그림 1E–1H 및 S1B–S1D). KD를 섭취한 쥐는 독립적인 실험에서 일반 사료(chow diet)를 섭취한 쥐에 비해 질병의 중증도가 감소했습니다(그림 S1E). 건강한 쥐의 장에서 얻은 이전 데이터와 함께,16 이 결과는 KD가 면역 활성화에 미치는 영향이 소화관(GI tract)을 넘어 전신 면역에 영향을 미친다는 것을 나타내며, KD가 다발성 경화증(MS)에서 보호 효과를 갖는다는 이전 연구 결과와 일치합니다.9,10,11

Figure 1 A ketogenic diet rescues a mouse model of multiple sclerosis in a microbiota-dependent manner

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Next, we sought to test whether the protective effect of a KD during EAE is dependent on the microbiota. We repeated the same dietary intervention using 9- to 12-week-old C57BL/6J female germ-free (GF) mice (n = 11–12 mice/group; four cages per isolator; two independent experiments). Mice were fed an HFD or KD prior to EAE induction and monitored for 25 days. Serum βHB was significantly elevated in GF KD-fed mice relative to HFD (Figure S1F). In contrast to CONV-R mice (Figures 1A–1D), there were no significant differences between GF mice fed HFD and KD across any of the four disease metrics (Figures 1I–1L). Consistent with prior work,22 GF mice on the HFD had significantly decreased disease phenotypes relative to HFD-fed CONV-R mice (Figure S1G). Thus, the microbiota alters both the initiation of disease and the protective effect of a KD.

Intestinal βHB is necessary and sufficient to protect from disease

The dietary shift to a KD has broad implications for host and microbial metabolism that could feasibly alter the immune system.32 We opted to focus on the ketone body βHB (Figure 2A) given its dependence on the KD and prior links to both immune cells33,34,35 and the microbiota.16 We supplemented the HFD with a βHB-containing ketone ester (100 g/kg hexanoyl hexyl β-hydroxybutyrate, C6x2-βHB, Table S1), which leads to increased gut and circulating βHB.16 We fed 12-week-old CONV-R male and female C57BL/6J mice an HFD, HFD-KE, or KD for 3 days prior to EAE disease induction, and disease was tracked for 21 days.

다음으로, KD가 EAE 동안의 보호 효과가 미생물군집에 의존적인지 확인하기 위해 실험을 진행했습니다. 9~12주령의 C57BL/6J 암컷 무균(GF) 마우스(n = 11–12 마우스/그룹; 격리기당 4개 케이지; 두 개의 독립된 실험)를 대상으로 동일한 식이 개입을 반복했습니다. 마우스는 EAE 유도 전 HFD 또는 KD를 투여받고 25일 동안 관찰되었습니다. 혈청 βHB는 GF KD 투여 마우스에서 HFD 투여 마우스에 비해 유의미하게 증가했습니다(그림 S1F). CONV-R 마우스(그림 1A–1D)와 달리, GF 마우스에서 HFD와 KD 투여 그룹 간 4개의 질병 지표 모두에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다(그림 1I–1L). 이전 연구와 일치하게,22 HFD를 섭취한 GF 마우스는 HFD를 섭취한 CONV-R 마우스에 비해 질병 표현형이 유의미하게 감소했습니다(그림 S1G). 따라서 미생물군은 질병의 발병과 KD의 보호 효과를 모두 조절합니다.

장 내 βHB는 질병으로부터 보호하는 데 필요하고 충분합니다

식이 전환을 통해 KD로 전환하는 것은 호스트와 미생물 대사 모두에 광범위한 영향을 미쳐 면역 시스템을 변경할 수 있습니다.32 우리는 KD에 의존하며 면역 세포33,34,35 및 미생물군과 연관된 케톤체 βHB(그림 2A)에 초점을 맞췄습니다.16 우리는 HFD에 βHB를 함유한 케톤 에스터(100 g/kg 육산일헥실 β-하이드록시부티레이트, C6x2-βHB, 표 S1)를 보충하여 장과 순환하는 βHB 수치를 증가시켰습니다.16 12주령의 CONV-R 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스를 EAE 질환 유도 3일 전부터 HFD, HFD-KE, 또는 KD를 3일간 급여한 후, 질환 진행을 21일간 추적했습니다.

Figure 2 Oral βHB is sufficient for protection from neurological disease

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Remarkably, pharmacological administration of βHB ketone ester (βHB-KE) effectively protected mice from EAE. As previously observed,16,36 βHB-KE and KD both increased circulating βHB levels (Figure 2B). Consistent with our earlier findings (Figure 1A), the HFD group had significantly increased disease scores over time compared to the KD group (Figure 2C). The HFD-KE group was indistinguishable from KD by either disease score (Figure 2C) or incidence rate (Figure 2D). Maximum disease scores were markedly lower in HFD-KE (0.75 ± 0.14) and KD (1.10 ± 0.37) relative to HFD (4.08 ± 0.66, Figure 2E), with all HFD-KE mice scoring ≤2 (Figure 2F). Additionally, both KD and HFD-KE were protective in a relapsing-remitting EAE model in SJL/J mice with proteolipid protein (PLP),37,38 showing reduced disease scores, similar incidence rates, and decreased maximum disease scores compared to HFD-fed mice (Figures 2G–2J). Thus, βHB-KE supplementation is sufficient to improve EAE disease severity.

Although βHB was delivered orally through the diet, it could potentially exert an impact on EAE directly in the central nervous system or in other tissues following absorption from the GI tract. To assess whether intestinal production of βHB is required for the full protective effect of a KD, we generated and validated a transgenic mouse model to selectively abolish the intestinal production of βHB (Figure S2). 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (HMGCS2) is the rate-limiting enzyme for βHB production and is highly expressed in intestinal epithelial cells (IECs) within the large intestine.39 We generated Hmgcs2WT (Hmgcs2fl/fl VillinER/Cre−/−) and Hmgcs2ΔIEC (Hmgcs2fl/fl VillinER/Cre+/−) mice (Figure S2A). Following tamoxifen administration, HMGCS2 was undetectable in colonic IECs by western blot, with no change in the liver (Figures S2B and S2C). βHB was significantly decreased in colonic IECs from Hmgcs2ΔIEC mice (Figure S2D). In contrast, serum βHB was unaffected (Figure S2E), suggesting that the direct impact of intestinal ketogenesis is restricted to the GI tract.

HMGCS2 in IECs was required for KD-mediated protection during EAE. We treated 7- to 9-week-old CONV-R male Hmgcs2ΔIEC and Hmgcs2WT mice with tamoxifen daily for 5 days, allowed for a 5-day washout, then put the mice on a KD for 3 days followed by EAE induction (Figure S3A). Hmgcs2ΔIEC mice had significantly increased disease scores over time relative to their Hmgcs2WT counterparts (Figure 3A). Disease incidence (Figure 3B) and maximum disease scores were lower in Hmgcs2WT mice (Figures 3C and 3D). Circulating βHB levels were not altered between the Hmgcs2WT and Hmgcs2ΔIEC mice (Figure 3E). These phenotypic differences were consistent with the significantly higher IL-17a+ IFNγ+ Th17 cells and IL-17a mean fluorescence intensity within the brains of Hmgcs2ΔIEC mice relative to controls (Figures 3F–3H and S3B).

Figure 3 Intestinal βHB is necessary for protection from neurological disease

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Finally, we used KE pharmacological administration to rescue disease caused by the genetic deletion of Hmgcs2 in IECs. We fed 14- to 17-week-old CONV-R male Hmgcs2ΔIEC and Hmgcs2WT mice a KD or the same KD supplemented with the KE (100 g/kg, Table S1). After 3 days, we induced EAE and tracked disease. Supplementation of the KE significantly increased circulating βHB levels in both Hmgcs2ΔIEC and Hmgcs2WT mice compared to unsupplemented KD (Figure S3C). As expected, Hmgcs2WT mice were unaffected by the addition of the KE (Figures 3I–3L). In contrast, the KE significantly decreased disease scores over time in Hmgcs2ΔIEC mice (Figure 3I) as well as the incidence rate (Figure 3J). Maximum disease scores of diseased mice were also lower in the KE-supplemented Hmgcs2ΔIEC mice relative to KD controls (Figure 3K), where no KD-KE-fed Hmgcs2ΔIEC mice developed clinical disease by day 30 (Figure 3L). These experiments support the key role of the intestinal production of βHB for the protective effect of a KD during EAE.

마지막으로, 우리는 IECs에서 Hmgcs2 유전자 결손으로 인한 질환을 회복하기 위해 KE 약리학적 투여를 사용했습니다. 14~17주령의 CONV-R 수컷 Hmgcs2ΔIEC 및 Hmgcs2WT 마우스에게 KD 또는 동일한 KD에 KE (100 g/kg, 표 S1)를 보충한 식이를 공급했습니다. 3일 후, EAE를 유도하고 질병 진행을 추적했습니다. KE 보충은 Hmgcs2ΔIEC 및 Hmgcs2WT 마우스에서 KD 단독 투여군에 비해 순환 βHB 수준을 유의미하게 증가시켰습니다(그림 S3C). 예상대로, Hmgcs2WT 마우스는 KE 추가에 영향을 받지 않았습니다(그림 3I–3L). 반면, KE는 Hmgcs2ΔIEC 마우스에서 시간 경과에 따라 질병 점수를 유의미하게 감소시켰으며(그림 3I), 발생률도 감소시켰습니다(그림 3J). 질병이 발생한 쥐의 최대 질병 점수는 KD 대조군에 비해 KE를 보충한 Hmgcs2ΔIEC 쥐에서 더 낮았으며(그림 3K), KD-KE를 섭취한 Hmgcs2ΔIEC 쥐는 30일차까지 임상적 질병이 발생하지 않았습니다(그림 3L). 이 실험들은 EAE 동안 KD의 보호 효과에 있어 장 내 βHB 생산의 핵심 역할을 지원합니다.

The antibiotic ampicillin phenocopies the effects of the ketone ester

Given βHB’s potential to alter host12,40 and microbial16 cells in the GI tract, we tested whether KE effects are microbiota dependent. Previous work showed that ampicillin rescues EAE in mice on a standard chow diet,24 but its effects in the context of HFD or KD were unknown. We fed 9-week-old CONV-R female C57BL/6J mice an HFD or HFD-KE for 3 days, then administered ampicillin via their drinking water for 7 days before inducing EAE and tracking disease (Figure S4A). As in previous experiments (Figures 2C–2F), HFD-KE mice had significantly lower disease scores than HFD mice without ampicillin (Figure S4B). Ampicillin reduced EAE scores in HFD mice and showed a trend toward lower disease incidence (Figure S4C), but HFD-KE mice treated with or without ampicillin had similar outcomes. Maximum disease scores were similar across groups, with a slight reduction in ampicillin-treated HFD mice (Figures S4D and S4E). These results suggest that the protective effect of βHB depends on the microbiota, highlighting the need to further explore the impact of diet and KE on gut microbial structure.

항생제 아목시실린은 케톤 에스터의 효과를 모방합니다

βHB가 위장관 내 호스트12,40 및 미생물16 세포를 변화시킬 수 있다는 점을 고려해 KE 효과가 미생물군집에 의존적인지 테스트했습니다. 이전 연구에서 아목시실린이 표준 사료 식이에서 EAE를 회복시켰지만, HFD 또는 KD 맥락에서의 효과는 알려지지 않았습니다. 9주령 CONV-R 암컷 C57BL/6J 마우스에 HFD 또는 HFD-KE를 3일간 급여한 후, EAE 유발 전 7일간 음용수에 암피실린을 투여하고 질병 진행을 추적했습니다(그림 S4A). 이전 실험과 마찬가지로(그림 2C–2F), HFD-KE 마우스는 암피실린을 투여하지 않은 HFD 마우스보다 질병 점수가 유의미하게 낮았습니다(그림 S4B). 아목시실린은 HFD 마우스의 EAE 점수를 감소시켰으며 질병 발생률 감소 경향을 보였습니다(그림 S4C), 그러나 아목시실린을 투여한 HFD-KE 마우스는 유사한 결과를 나타냈습니다. 최대 질병 점수는 그룹 간 유사했으며, 아목시실린을 투여한 HFD 마우스에서 약간의 감소가 관찰되었습니다(그림 S4D 및 S4E). 이 결과는 βHB의 보호 효과가 미생물군집에 의존함을 시사하며, 식이와 KE가 장 미생물군집 구조에 미치는 영향을 추가로 탐구할 필요성을 강조합니다.

Ketogenesis alters the gut microbiota of diseased mice

We hypothesized that intestinal βHB protects from EAE in part by altering the immunomodulatory potential of the gut microbiota. However, it was unclear how a KD and KE would affect the microbiota in diseased mice, as previous studies were in healthy mice.16 Using 16S rRNA gene sequencing (16S-seq), we profiled the gut microbiota of EAE mice fed HFD, HFD-KE, or KD at 7 days post immunization (mice from Figures 2B–2F). 16S-seq revealed significant shifts in the gut microbiota between diets during EAE (Figure S5). Shannon diversity was higher in HFD-KE and KD groups compared to HFD-fed mice (Figure S5A). Principal coordinate analysis and PERMANOVA testing showed significant differences between HFD-KE and HFD, and between KD and HFD (Figure S5B). KE and KD caused similar changes in the abundance of amplicon sequence variants (ASVs), with some notable exceptions (Figures S5C and S5D). Thus, both diet and βHB supplementation significantly impact the gut microbiota of diseased mice.

케토제네시스(Ketogenesis)는 질병 마우스의 장 미생물군집을 변화시킵니다

우리는

장 내 βHB가 장 미생물군집의 면역 조절 잠재력을 변화시켜

EAE로부터 보호하는 데 일부 기여한다고 가설을 세웠습니다.

그러나 이전 연구는

건강한 쥐에서 진행되었기 때문에,

KD와 KE가 질병 쥐의 미생물군집에 어떻게 영향을 미치는지 명확하지 않았습니다.16

16S rRNA 유전자 시퀀싱(16S-seq)을 사용하여,

면역화 후 7일째에 HFD, HFD-KE, 또는

KD를 섭취한 EAE 쥐의 장내 미생물군집을 프로파일링했습니다(그림 2B–2F의 쥐).

16S-seq 결과,

EAE 진행 중 식이 요법에 따라

장내 미생물군집에 유의미한 변화가 관찰되었습니다(그림 S5).

Shannon 다양성은 HFD-KE 및 KD 그룹에서 HFD 급여 마우스보다 높았습니다(그림 S5A). 주좌표 분석 및 PERMANOVA 테스트 결과, HFD-KE와 HFD, KD와 HFD 사이에 유의미한 차이가 나타났습니다 (그림 S5B). KE와 KD는 몇 가지 주목할 만한 예외를 제외하고는 앰플리콘 서열 변이체 (ASV)의 풍부도에 유사한 변화를 일으켰습니다 (그림 S5C 및 S5D).

따라서

식단과 βHB 보충제는

모두 질병에 걸린 마우스의 장내 미생물 군집에 상당한 영향을 미칩니다.

The βHB-associated gut microbiota protects from disease

Having shown that βHB impacts the gut microbiota, we next tested the impact of fecal microbiota transplantation (FMT) on EAE phenotypes. We fed 6- to 8-week-old female CONV-R C57BL/6J mice an HFD or HFD-KE for 3 days prior to receiving a commonly used antibiotic cocktail (AVNM: ampicillin, vancomycin, neomycin, and metronidazole) for 1 week to deplete the baseline microbiota.41,42 FMT was performed daily by oral gavage for 7 days prior to and after EAE induction from 6- to 8-week-old CONV-R female donor mice fed an HFD or HFD-KE for 1–3 weeks (two donors, four recipients per donor, two cages per group; Figure 4A).

βHB 관련 장내 미생물 군집이 질병을 예방합니다

βHB가 장내 미생물에 영향을 미친다는 것을 확인한 후,

우리는 분변 미생물 이식(FMT)이 EAE 증상에 미치는 영향을 테스트했습니다.

6~8주령의 CONV-R C57BL/6J 암컷 마우스에게 HFD 또는 HFD-KE를 3일간 급여한 후,

기준 미생물군을 소모시키기 위해 일반적으로 사용되는

항생제 칵테일(AVNM: 아목시실린, 반코마이신, 네오마이신, 메트로니다졸)을

1주간 투여했습니다.41,42

FMT는 EAE 유도 전후 7일간 매일 경구 투여를 통해 수행되었습니다. 실험은 6~8주령의 CONV-R 암컷 기증 마우스(HFD 또는 HFD-KE를 1~3주간 급여)를 대상으로 진행되었으며, 기증 마우스는 2마리, 수혜 마우스는 기증 마우스당 4마리, 그룹당 2마리씩 배정되었습니다(그림 4A).

Figure 4 The βHB-altered gut microbiota is sufficient to protect from disease

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FMT from HFD-KE donors significantly reduced EAE severity compared to HFD donors, regardless of the diet of the recipient mice. Recipients of HFD-KE FMT had lower disease scores and incidence rates than those receiving HFD FMT (Figures 4B and 4C). However, maximum disease scores (Figure 4D) and score distributions (Figure 4E) were similar between groups. 16S-seq analysis of the recipient mice revealed that the donor gut microbiota had a significant impact on the gut microbiota that overwhelmed the baseline differences by recipient diet (Figures 4F–4I). This effect was likely due to the repeated oral gavage over 2 weeks. The protective impact of KE was less pronounced than in previous experiments (Figure 2), possibly due to antibiotic pretreatment or variability in disease severity between experiments.20,30

HFD-KE 기증자로부터의 FMT는 수혜 마우스의 식이 요인과 무관하게 HFD 기증자로부터의 FMT에 비해 EAE의 중증도를 유의미하게 감소시켰습니다. HFD-KE FMT를 받은 수혜 마우스는 HFD FMT를 받은 수혜 마우스보다 질병 점수와 발생률이 낮았습니다 (그림 4B 및 4C). 그러나 최대 질병 점수 (그림 4D)와 점수 분포 (그림 4E)는 그룹 간 유사했습니다. 수혜 마우스의 16S-seq 분석 결과, 기증자 장내 미생물군이 수혜 마우스의 장내 미생물군에 유의미한 영향을 미쳤으며, 이는 수혜 마우스의 식이 차이로 인한 기저 차이를 압도했습니다(그림 4F–4I). 이 효과는 2주 동안 반복된 경구 투여 때문일 가능성이 높습니다. KE의 보호 효과는 이전 실험(그림 2)보다 덜 두드러졌으며, 이는 항생제 사전 투여나 실험 간 질병 중증도의 변동성 때문일 수 있습니다.20,30

Next, we performed a similar FMT experiment using our transgenic mice deficient in intestinal βHB production. Donor Hmgcs2WT and Hmgcs2ΔIEC mice (two donors per group) were fed a KD for 3 days prior to FMT. Recipient mice of both genotypes were given AVNM via drinking water for 7 days prior to daily gavage for 1 week prior to and following EAE induction (Figure 4J). Disease was tracked for 22 days. Consistent with our KE FMT experiment (Figures 4B–4E), we found that FMT from an Hmgcs2ΔIEC donor led to significantly higher disease scores irrespective of the genotype of the recipient mice (Figure 4K). Disease incidence was similar in most groups with the exception of a trending lower incidence in the Hmgcs2WT FMT to Hmgcs2WT recipient (Figure 4L). Maximum disease scores of mice that developed disease were lower in mice that received Hmgcs2WT FMT compared to Hmgcs2ΔIEC FMT, with 38% and 47% of the Hmgcs2ΔIEC recipients developing maximum disease (Figures 4M and 4N).

Unlike the diet FMT experiment, some effects of host genotype persisted despite having distinct FMT donors. Hmgcs2WT FMT into Hmgcs2WT recipients led to significantly lower disease scores over time compared to Hmgcs2WT FMT into Hmgcs2ΔIEC mice (Figure 4K). However, irrespective of the recipient genotype, Hmgcs2ΔIEC FMT resulted in worsened disease over time (Figure 4K). The combined results across both FMT paradigms suggest that intestinal βHB alters the gut microbiota in a manner that ameliorates the EAE model.

다음으로, 장 내 βHB 생산이 결핍된 전유전자 마우스를 사용한 유사한 FMT 실험을 수행했습니다. 기증자 Hmgcs2WT 및 Hmgcs2ΔIEC 마우스(각 그룹당 2마리)는 FMT 전 3일간 KD를 섭취했습니다. 두 유전형의 수혜 마우스는 EAE 유도 전 1주간 매일 경구 투여 전 7일간 음용수에 AVNM을 투여받았습니다(그림 4J). 질병은 22일 동안 추적되었습니다. KE FMT 실험 결과(그림 4B–4E)와 일치하게, Hmgcs2ΔIEC 기증자에서 유래한 FMT는 수혜 마우스의 유전자형에 관계없이 질병 점수가 유의미하게 높았습니다(그림 4K). 질병 발생률은 대부분의 그룹에서 유사했으나, Hmgcs2WT FMT를 받은 Hmgcs2WT 수혜 그룹에서 경향적으로 낮은 발생률을 보였습니다(그림 4L). 질병을 발병한 마우스의 최대 질병 점수는 Hmgcs2WT FMT를 받은 마우스에서 Hmgcs2ΔIEC FMT를 받은 마우스보다 낮았으며, Hmgcs2ΔIEC 수혜자의 38%와 47%가 최대 질병을 발병했습니다(그림 4M과 4N).

식이 FMT 실험과 달리, 호스트 유전자형의 일부 효과는 FMT 기증자가 서로 다른 경우에도 지속되었습니다. Hmgcs2WT FMT를 Hmgcs2WT 수혜자에게 투여한 경우, Hmgcs2ΔIEC 마우스에 Hmgcs2WT FMT를 투여한 경우보다 시간 경과에 따라 질병 점수가 유의미하게 낮았습니다(그림 4K). 그러나 수혜자 유전자형에 관계없이 Hmgcs2ΔIEC FMT는 시간 경과에 따라 질병이 악화되었습니다(그림 4K). 두 가지 FMT 패러다임의 결합된 결과는 장 내 βHB가 장 미생물군집을 변화시켜 EAE 모델을 완화하는 방식으로 작용함을 시사합니다.

Identification of immunomodulatory bacteria linked to diet

Our prior work demonstrated a reproducible decrease in bifidobacterial abundance in both humans and mice fed a KD, resulting in decreased intestinal Th17 activation.16 However, only a single ASV within the Bifidobacterium genus was detected in our initial experiment (Figure S5), which was not significantly altered in response to diet. Furthermore, a pilot experiment in which we orally gavaged Bifidobacterium adolescentis strain BD1 to CONV-R mice fed a KD did not significantly impact the EAE phenotype, prompting us to design an unbiased approach to screen for bacteria of interest that could mediate the protective effect of a KD.

Given that previous studies have implicated a range of microorganisms capable of impacting EAE,43 we aimed to take a reductionist approach to narrow in on members of the microbiota contributing to the protective effect of a KD and KE supplementation. We utilized a method for generating stable in vitro communities (SICs) that was initially established using the human gut microbiota.27 Stool samples from a representative mouse fed the HFD, HFD-KE, or KD collected 7 days post immunization were passaged three times in rich bacterial medium (n = 4–5 SICs/donor; Figure S6A). 16S-seq was used to assess the microbial communities remaining in each SIC. Multiple differences between donor samples persisted despite three rounds of passaging in vitro. The KD SICs had significantly lower Shannon diversity than HFD SICs (Figure S6B). Despite a marked divergence from the donor samples (Figure S6C), the SICs from the KD and KE donors were both significantly different from the HFD SICs (Figures S6C and S6D). Overall richness was quite low after passaging, with just 16 unique ASVs detected in the SICs at the endpoint (4–10 ASVs/SIC; Figures 5A and S6E; Table S2) compared to 41, 109, and 128 ASVs in the donor HFD, HFD-KE, and KD samples, respectively. Three ASVs were both abundant and common across all 13 SICs, including Enterococcus (ASV4), Bacteroides (ASV2), and Parasutterella (ASV9). The remaining ASVs were variable between samples and diet groups.

식이와 관련된 면역조절 세균의 식별

우리의 이전 연구는 KD를 섭취한 인간과 쥐에서 bifidobacterial 풍부도가 재현 가능하게 감소했으며, 이는 장 내 Th17 활성화 감소로 이어졌음을 보여주었습니다.16 그러나 초기 실험에서 Bifidobacterium 속 내 단일 ASV만 검출되었으며, 이는 식이 변화에 따라 유의미하게 변화하지 않았습니다(그림 S5). 또한, KD를 섭취한 CONV-R 마우스에 Bifidobacterium adolescentis 균주 BD1을 경구 투여한 시범 실험에서 EAE 표현형에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 이 결과는 KD의 보호 효과를 매개할 수 있는 관심 미생물을 선별하기 위해 편향되지 않은 접근법을 설계하도록 이끌었습니다.

이전 연구에서 EAE에 영향을 미치는 다양한 미생물이 보고되었기 때문에,43 우리는 KD와 KE 보충제의 보호 효과에 기여하는 미생물군집의 구성원을 특정하기 위해 환원주의적 접근법을 채택했습니다. 인간 장 미생물군집을 기반으로 개발된 안정적인 in vitro 공동체(SIC) 생성 방법을 활용했습니다.27 HFD, HFD-KE, 또는 KD를 섭취한 대표 마우스의 면역화 후 7일차 분변 샘플을 풍부한 세균 배지에서 3회 배양했습니다(n = 4–5 SICs/donor; Figure S6A). 16S-seq을 사용하여 각 SIC에 남아 있는 미생물 군집을 평가했습니다. 3회 배양 후에도 기증자 샘플 간의 다중 차이가 지속되었습니다. KD SIC는 HFD SIC보다 Shannon 다양성이 유의미하게 낮았습니다(그림 S6B). 기증자 샘플과의 명확한 차이를 보였음에도 불구하고(그림 S6C), KD 및 KE 기증자에서 유래한 SIC는 모두 HFD SIC와 유의미하게 달랐습니다(그림 S6C 및 S6D). 전달 후 전체 풍부도는 매우 낮았으며, 최종 시점의 SIC에서 16개의 고유 ASV만 검출되었습니다(4–10 ASV/SIC; 그림 5A 및 S6E; 표 S2). 이는 기증자 HFD, HFD-KE, KD 샘플에서 각각 41, 109, 128개의 ASV와 비교됩니다. 13개 모든 SIC에서 풍부하고 공통적으로 발견된 ASV는 Enterococcus (ASV4), Bacteroides (ASV2), 및 Parasutterella (ASV9)의 3종이었습니다. 나머지 ASVs는 샘플 및 식이 그룹 간에 변동성이 있었습니다.

Figure 5 Lactobacillus sequence variants are associated with decreased Th17 activation

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Th17 cells play an important role in the pathogenesis of both human MS and the EAE model.44,45,46,47 Thus, we used a Th17 skewing assay48,49 to assess the immunomodulatory potential of each SIC. In brief, splenic CD4+ T cells were isolated and skewed to Th17 fate in the presence of cell-free supernatants from our SICs. After 4 days, cells were restimulated before supernatants were collected for IL-17a quantification via ELISA. All of the HFD-derived SICs induced IL-17a, whereas none of the KD-derived SICs had an effect in this assay (Figure 5A); the HFD-KE SICs were mixed, with four out of five inducing IL-17a. Three ASVs were significantly associated with IL-17a levels (Figure 5A), including two negatively associated ASVs annotated as Lactobacillus (ASV3 and ASV24; Figures 5B and 5C) and the positively associated Parasutterella (ASV9; Figure S6F). Lactobacillus was recently renamed Ligilactobacillus; however, we opted to refer to it as Lactobacillus for consistency with previous studies.50,51,52

Th17 세포는 인간 다발성 경화증(MS) 및 EAE 모델의 병리 발생에 중요한 역할을 합니다.44,45,46,47 따라서 우리는 각 SIC의 면역 조절 잠재력을 평가하기 위해 Th17 편향 검정법48,49를 사용했습니다. 간략히 설명하자면, 비장 CD4+ T 세포를 분리하여 우리 SIC의 세포 무함유 상청액 존재 하에서 Th17 운명으로 편향시켰습니다. 4일 후, 세포를 재자극한 후 상청액을 수집하여 ELISA를 통해 IL-17a를 정량화했습니다. 모든 고지방 식이(HFD) 유래 SIC는 IL-17a를 유도했지만, KD 유래 SIC는 이 실험에서 효과를 보이지 않았습니다(그림 5A); HFD-KE SIC는 혼합된 결과를 보였으며, 5개 중 4개가 IL-17a를 유도했습니다. IL-17a 수준과 유의미하게 연관된 3개의 ASV가 확인되었습니다(그림 5A), 이 중 Lactobacillus로 주석이 달린 2개의 음의 연관 ASV(ASV3 및 ASV24; 그림 5B 및 5C)와 양의 연관 Parasutterella(ASV9; 그림 S6F)가 포함되었습니다. Lactobacillus는 최근 Ligilactobacillus로 재명명되었으나, 이전 연구와의 일관성을 위해 Lactobacillus로 표기했습니다.50,51,52

A Lactobacillus isolate and metabolite protect from disease

We sought to isolate a representative Lactobacillus strain from our SICs to enable more controlled experiments. We anaerobically plated a KD-SIC (Figure 5A) on Lactobacillus-selective medium (MRS). Identification by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry revealed two colonies that matched the L. murinus/animalis fingerprint; a representative isolate was validated by full-length 16S-seq (Table S3). Multiple lines of evidence suggested that this isolate matched ASV24 from the SICs: (1) ASV24 was the only ASV assigned to Lactobacillus in the source SIC (KD-SIC replicate 4); and (2) the 16S rRNA gene sequence was 100% identical, with 100% coverage (NCBI BLASTN), to the representative sequence from ASV24 (Table S3). We designated this isolate L. murinus KD6.

Lactobacilli, including L. murinus, convert tryptophan (Trp) to indole-3-lactate (ILA), which inhibits Th17 cell production of IL-17a.51,53 To assess whether L. murinus KD6 had genes involved in ILA production, we generated a finished genome using a hybrid of short- and long-read sequencing. Trp is deaminated via aromatic amino acid aminotransferases (ArATs) to form indole-3-pyruvate (IPYA) which is then dehydroxylated by phenyllactate dehydrogenases (FldH) or D-lactate dehydrogenases (D-LDH) to make ILA50,52,53,54 (Figure 6A). We identified four genes homologous to aminotransferases in the L. murinus KD6 genome. This includes a putative aspartate aminotransferase (AspAT) with significant homology to an annotated AspAT from known ILA-producing species, including Clostridium sporogenes, Lactobacillus reuteri, and L. murinus (Figure 6B; Tables S4 and S5). We also detected four putative LDH genes in the L. murinus KD6 genome, including a candidate D-lactate dehydrogenase (D-LDH) with significant homology to genes found in ILA producers (Figure 6B; Tables S4 and S5). We then used targeted liquid chromatography-mass spectrometry to confirm‎ the production of ILA from L. murinus KD6 and the positive control strain L. reuteri ATCC2327250 (Figure 6C). As expected,51,53 ILA inhibited the production of IL-17a by Th17 cells in our skewing assay (Figure 6D).

Lactobacillus 분리주와 대사산물이 질병으로부터 보호합니다

우리는 SIC에서 대표적 Lactobacillus 균주를 분리하여 더 통제된 실험을 수행하기 위해 노력했습니다. KD-SIC (그림 5A)를 Lactobacillus 선택적 배지 (MRS)에 무산소 조건에서 배양했습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(MALDI-MS)을 통한 식별 결과, L. murinus/animalis 지문과 일치하는 두 개의 콜로니가 확인되었으며, 대표 분리주는 전체 길이의 16S-seq(표 S3)를 통해 검증되었습니다. 여러 증거가 이 분리주가 SICs에서 유래한 ASV24와 일치함을 시사했습니다: (1) ASV24는 원천 SIC(KD-SIC 복제 4)에서 Lactobacillus에 할당된 유일한 ASV였으며; (2) 16S rRNA 유전자 시퀀스는 ASV24의 대표 시퀀스와 100% 동일했으며, 100% 커버리지(NCBI BLASTN)를 나타냈습니다(표 S3). 이 분리체를 L. murinus KD6로 명명했습니다.

Lactobacilli, 특히 L. murinus는

트립토판(Trp)을 인돌-3-락테이트(ILA)로 전환하며,

이는 Th17 세포의 IL-17a 생산을 억제합니다.51,53   

L. murinus KD6가

ILA 생산에 관여하는 유전자를 보유하고 있는지 평가하기 위해

단일 염기 서열 분석과 장 염기 서열 분석을 결합한 하이브리드 방법을 사용하여 완성된 게놈을 생성했습니다.

트립토판은

아로마틱 아미노산 아미노전달효소(ArATs)에 의해 트립토판-3-피루베이트(IPYA)로 탈아미노화되며,

이는 페닐락테이트 탈수소효소(FldH) 또는 D-락테이트 탈수소효소(D-LDH)에 의해 탈수소화되어

ILA를 생성합니다.50,52,53,54 (그림 6A). 

L. murinus KD6 게놈에서 아미노전달효소와 동족인 네 개의 유전자를 식별했습니다. 이 중에는 알려진 ILA 생성 종(Clostridium sporogenes, Lactobacillus reuteri, L. murinus 등)의 주석이 달린 AspAT와 높은 동족성을 보이는 추정 아스파르트산 아미노전달효소(AspAT)가 포함됩니다(그림 6B; 표 S4 및 표 S5). 또한 L. murinus KD6 유전체에서 LDH 유전자 4개를 탐지했으며, 이 중 하나는 ILA 생성 종에서 발견된 유전자와 높은 동질성을 보이는 D-젖산 탈수소효소(D-LDH) 후보 유전자입니다(그림 6B; 표 S4 및 표 S5). 우리는 표적 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하여 L. murinus KD6 및 양성 대조주 L. reuteri ATCC2327250 (그림 6C)에서 ILA의 생산을 확인했습니다. 예상대로,51,53 ILA는 우리 편향 실험에서 Th17 세포의 IL-17a 생산을 억제했습니다 (그림 6D).

Figure 6 A Lactobacillus murinus isolate and metabolite decrease disease severity on an HFD

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We next tested the impact of L. murinus KD6 and ILA on EAE. HFD-fed mice were orally gavaged with a vehicle, L. murinus (108 CFU), or ILA (20 mg/kg) every other day for the duration of the experiment. EAE was induced 4 days after the first gavage, and disease was tracked. Disease scores over time were significantly lower in response to both L. murinus and ILA relative to vehicle controls (Figure 6E). Disease incidence was highest in the HFD group (Figure 6F). The probability of survival in the HFD group (28% by day 18) was significantly lower than in the L. murinus (74%) and ILA (68%) treated groups (Figure 6G). 72% of the HFD controls reached a disease score >4.5, whereas the other two groups were mixed (Figures 6H and 6I). These data suggest that L. murinus protects mice during EAE due to the production of the anti-inflammatory metabolite ILA.

We next wanted to assess whether ILA-producing microbes and/or ILA are changed in response to a KD and/or βHB-KE supplementation. We leveraged our previous 16S-seq dataset from mice fed an HFD, HFD-KE, or KD (Figure S5). While there was no difference in ASV23 L. murinus abundance between groups, there was a significant increase in the abundance of ASV24 L. reuteri, another known ILA producer,55 in both HFD-KE and KD groups compared to HFD (Figure 6J). The abundance of ASV24 L. reuteri was also significantly higher in mice with mild or no disease symptoms compared to mice with more severe disease (score of >2.5) (Figure 6K). Additionally, we quantified fecal levels of ILA in SJL/J mice on an HFD, HFD-KE, or KD (from Figures 2G–2J) at days 7, 21, and 28 post EAE induction. At days 7 and 28, mice on HFD-KE had significantly higher fecal ILA than HFD-fed mice, while KD mice showed no difference at any time point (Figures S7A–S7C). These data suggest that KD and βHB-KE enrich for known ILA producers and that βHB-KE supplementation is sufficient to elevate fecal ILA level during disease.

Lactobacilli are not the only source of ILA within the gut microbiota. ILA production has been observed in diverse bacterial species spanning multiple phyla.56 We investigated the impact of βHB on the levels of ILA-producing microbes by reanalyzing published data for human ex vivo stool communities cultured with or without βHB for 24 h.16 We defined ILA-producing microbes as microbes with fold change of ≥4 over controls by mass spectrometry.56 The relative abundance of ILA-producing microbes was significantly increased in response to βHB (Figures S7D and S7E). We hypothesized that βHB increased the abundance of ILA-producing microbes by selective growth promotion. Supporting this hypothesis, treatment with 12.5 mM βHB resulted in improved growth of L. murinus compared to control bacteria, B. adolescentis BD1, as measured by shifted growth curves (Figures S7F and S7G) and decreased time to reach mid-exponential growth in monocultures grown in brain heart infusion (BHI) medium (Figure S7H). At higher concentrations, 50 mM βHB inhibited growth of both L. murinus and B. adolescentis (Figures S7F and S7G); however, L. murinus growth was less inhibited than that of B. adolescentis as measured by an increased carrying capacity and increased growth rate compared to no treatment (Figures S7I and S7J). Together, these data suggest that βHB directly shapes the microbiota composition to favor ILA-producing microbes by having a stronger growth-inhibitory impact on non-ILA-producing members of the microbiota communities. These data provide a potential mechanism for how a diet-responsive host metabolite βHB shapes the microbial community structure.

Notably, multiple studies support the clinical relevance of ILA whereby ILA is one of the most depleted serum metabolites in MS compared to controls,57,58 and MS patients have a decreased abundance of ILA-producing gut bacteria.58 We wanted to investigate these findings in an independent cohort of MS subjects (iMSMS) using our metric for ILA-producing microbes. ILA-producing microbes were significantly decreased in MS subjects compared to healthy controls, driven by the untreated MS patients; treated subjects had levels of ILA-producing bacteria similar to those of controls (Figure 6L). ILA-producing bacteria were inversely associated with disease severity (Figure 6M). Taken together, these findings support the clinical relevance of our results.

다음으로 L. murinus KD6 및 ILA가 EAE에 미치는 영향을 평가했습니다. 고지방 식이(HFD)를 섭취한 쥐에게 실험 기간 동안 2일 간격으로 경구 투여를 통해 대조군(차량), L. murinus (108 CFU), 또는 ILA (20 mg/kg)를 투여했습니다. EAE는 첫 번째 투여 후 4일에 유도되었으며, 질병 진행을 추적했습니다. 시간에 따른 질병 점수는 L. murinus 및 ILA 모두에서 차량 대조군에 비해 유의미하게 낮았습니다 (그림 6E). 질병 발생률은 HFD 그룹에서 가장 높았습니다 (그림 6F). HFD 그룹의 생존 확률 (18일차 기준 28%)은 L. murinus (74%) 및 ILA (68%) 처리 그룹에 비해 유의미하게 낮았습니다 (그림 6G). HFD 대조군 중 72%가 질병 점수 >4.5에 도달한 반면, 다른 두 그룹은 혼합된 결과를 보였습니다(그림 6H 및 6I). 이 데이터는 L. murinus가 EAE 동안 쥐를 보호하는 것이 항염증 대사산물 ILA의 생산 때문임을 시사합니다.

다음으로, KD 및/또는 βHB-KE 보충에 대한 반응으로 ILA를 생산하는 미생물과/또는 ILA가 변화하는지 평가하고자 했습니다. 우리는 이전에 HFD, HFD-KE, 또는 KD를 섭취한 쥐에서 수집한 16S-seq 데이터셋을 활용했습니다(그림 S5). ASV23 L. murinus의 풍부도는 그룹 간 차이가 없었지만, ILA 생성 미생물로 알려진 ASV24 L. reuteri의 풍부도는 HFD-KE 및 KD 그룹에서 HFD 그룹에 비해 유의미하게 증가했습니다(그림 6J). ASV24 L. reuteri의 풍부도는 질병 증상이 경미하거나 없는 쥐에서 질병 증상이 더 심한 쥐(점수 >2.5)에 비해 유의미하게 높았습니다(그림 6K). 또한, EAE 유도 후 7일, 21일, 28일에 SJL/J 마우스의 HFD, HFD-KE, KD 식이 조건 하에서 분변 내 ILA 수준을 정량화했습니다(그림 2G–2J 참조). 7일차와 28일차에 HFD-KE를 섭취한 쥐의 분변 ILA 수준은 HFD를 섭취한 쥐보다 유의미하게 높았으며, KD를 섭취한 쥐는 모든 시점에서 차이를 보이지 않았습니다(그림 S7A–S7C). 이 결과는 KD와 βHB-KE가 알려진 ILA 생성균을 풍부하게 하며, βHB-KE 보충이 질병 기간 동안 분변 ILA 수준을 증가시키는 데 충분함을 시사합니다.

Lactobacilli는 장 미생물군집 내 ILA의 유일한 원천이 아닙니다. ILA 생산은 다양한 세균 종에 걸쳐 다중 문에 걸쳐 관찰되었습니다.56 우리는 인간 ex vivo 분변 공동체에 βHB 유무로 24시간 배양한 기존 데이터를 재분석하여 βHB가 ILA 생성 미생물의 수준에 미치는 영향을 조사했습니다.16 우리는 질량 분석을 통해 대조군 대비 ≥4배의 변화율을 보이는 미생물을 ILA 생성 미생물로 정의했습니다.56 ILA 생성 미생물의 상대적 풍부도는 βHB에 반응하여 유의미하게 증가했습니다(그림 S7D 및 S7E). 우리는 βHB가 선택적 성장 촉진을 통해 ILA 생성 미생물의 풍부도를 증가시켰다고 가설을 세웠습니다. 이 가설을 뒷받침하는 결과로, 12.5 mM βHB 처리 시 L. murinus의 성장 곡선이 대조군 세균인 B. adolescentis BD1에 비해 개선되었으며(그림 S7F 및 S7G), 뇌심장 배지(BHI)에서 단일 배양 시 중간 지수 성장 단계에 도달하는 시간이 단축되었습니다(그림 S7H). 더 높은 농도인 50 mM βHB는 L. murinus와 B. adolescentis의 성장을 억제했습니다(그림 S7F 및 S7G); 그러나 L. murinus의 성장은 B. adolescentis에 비해 덜 억제되었으며, 이는 처리되지 않은 경우와 비교하여 증가된 수용 능력과 성장 속도로 측정되었습니다(그림 S7I 및 S7J). 이러한 결과는 βHB가 미생물군집의 구성에 직접적으로 영향을 미쳐 ILA 생성 미생물을 선호하도록 조절하며, 이는 비-ILA 생성 미생물 군집 구성원에 대한 성장 억제 효과가 더 강하기 때문임을 시사합니다. 이 데이터는 식이 반응성 호스트 대사산물인 βHB가 미생물 군집 구조를 형성하는 잠재적 메커니즘을 제공합니다.

특히, 여러 연구에서 ILA의 임상적 관련성이 입증되었으며, ILA는 대조군에 비해 다발성 경화증(MS) 환자에서 가장 감소된 혈청 대사체 중 하나이며,57,58 MS 환자는 ILA 생성 장내 세균의 풍부도가 감소했습니다.58 우리는 우리만의 ILA 생성 미생물 측정법을 사용하여 독립적인 MS 환자 코호트(iMSMS)에서 이러한 결과를 조사하고자 했습니다. ILA 생성 미생물은 건강한 대조군에 비해 MS 환자에서 유의미하게 감소했으며, 이는 치료를 받지 않은 MS 환자에서 주로 관찰되었습니다. 치료를 받은 환자의 ILA 생성 세균 수준은 대조군과 유사했습니다(그림 6L). ILA 생성 세균은 질병 중증도와 역상관 관계를 보였습니다(그림 6M). 이러한 결과는 우리 연구의 임상적 관련성을 뒷받침합니다.

Discussion

We provide evidence that a microbiome-dependent pathway mediates the protective effects of a common dietary intervention against a neuroinflammatory disease. Building on previous human6,7,8 and mouse9,10,11 studies, we confirmed that a KD mitigates disease in the EAE mouse model. Our findings highlight the importance of considering individual variations in gut microbiota in future research to better understand the differing responses to KD seen in MS patients6,7,8 and mouse9,10,11 studies.

Surprisingly, we discovered that oral delivery of a βHB-KE can mimic the protective effects of a KD. If this finding holds in humans, βHB supplementation alone could offer a viable therapeutic alternative to the full KD. The translational implications are profound, as KDs are difficult to maintain and can have negative side effects.59 Our identification of βHB as a key player provides a way to circumvent these barriers and provides a more general proof of concept for the ability to distill the activity of a complex diet down to a single bioactive molecule.

Our data from transgenic mice lacking intestinal Hmgcs2 expression‎ highlight the need to study tissue-specific production of βHB and other diet-dependent metabolites. Surprisingly, local GI βHB production was essential for the full neuroprotective effect of a KD, even without changes in circulating βHB levels. While other tissues such as the liver may also contribute to βHB levels, these findings suggest that GI βHB levels are more indicative of the effective KE dose. Previously, we found that GI βHB tissue levels rose similarly with KE supplementation and KD, while serum and gut lumen levels were higher with KD.16 These results enhance the understanding of gut-neuroinflammation interactions, showing how a host metabolite can signal the brain via a microbial effector.

We identified that a Lactobacillus isolate, L. murinus KD6, and the Lactobacillus-produced metabolite ILA are each sufficient to rescue disease. Prior studies showed that supplementation with L. murinus reduced EAE disease severity in mice on a high-salt diet and that ILA inhibits Th17 cells in vitro.51 Our data extend this work by showing that: (1) ILA protects against EAE; (2) βHB-KE treatment elevates fecal ILA levels; and (3) ILA contributes to the protective effects of βHB. As the genes for bacterial ILA production are known,50,52,53,54 follow-up studies of isogenic L. murinus or other bacterial strains varying in ILA production would help dissect the host response in EAE. These engineered bacteria could even enable more controlled MS patient trials, given the potential broad impacts of probiotics for MS.

There are several potential ways the gut microbiota can influence MS. While segmented filamentous bacteria (SFB or Candidatus arthromitus) and an Allobaculum isolate worsen EAE by activating Th17 cells,22,24 Bacteroides fragilis offers protection by increasing Foxp3+ regulatory T cells.60 Inspection of our 16S-seq data did not reveal these EAE-associated species, suggesting they do not influence our results. Future studies in gnotobiotic mice are needed to explore how these and other immunomodulatory gut bacterial species interact under different diets.

Our study integrates and extends multiple prior observations. This includes data linking a ketogenic diet to protection from MS,6,7,8,9,10,11 the KD to shifts in the gut microbiota,16,17 the production of ILA by Lactobacillus,51,53 the suppression of Th17 cells by ILA,51 and the key role for Th17 cells in MS pathogenesis.44,45,46,47 Thus, it is critical to consider both host and microbial metabolism, including key bioactive compounds such as βHB and ILA. Our findings add to the growing literature on other diets that elevate βHB, including intermittent fasting and caloric restoration, which have shown some efficacy in MS patients and mouse models.9,61,62,63,64 Targeting bioactive compounds such as βHB and ILA could help surmount potential issues of a lack of long-lasting effects of dietary intervention in MS subjects.65 The pathway we have identified herein provides a common mechanism through which these diverse dietary interventions may impact MS. More broadly, our results set the stage to perform similar studies in other autoimmune diseases and for alternative dietary interventions, providing new insights into the complex mechanisms that link diet, the gut microbiome, and host immunity.

논의

우리는 미생물군집에 의존하는 경로가 신경염증성 질환에 대한 일반적인 식이 개입의 보호 효과를 매개한다는 증거를 제공합니다. 이전 인간6,7,8 및 마우스9,10,11 연구를 바탕으로, 우리는 KD가 EAE 마우스 모델에서 질환을 완화한다는 것을 확인했습니다. 우리의 결과는 MS 환자6,7,8 및 쥐9,10,11 연구에서 관찰된 KD에 대한 다양한 반응을 이해하기 위해 미래 연구에서 장 미생물군집의 개인 차이를 고려하는 것이 중요함을 강조합니다.

놀랍게도, 우리는 βHB-KE의 경구 투여가 KD의 보호 효과를 모방할 수 있음을 발견했습니다. 이 결과가 인간에서 확인된다면, βHB 보충제 단독으로도 완전한 KD의 대체 치료법으로 유망한 대안이 될 수 있습니다. 이 연구의 번역적 함의는 깊습니다. KD는 유지가 어렵고 부정적인 부작용을 가질 수 있기 때문입니다.59 βHB를 핵심 요소로 식별한 것은 이러한 장벽을 우회하는 방법을 제공하며, 복잡한 식단의 활동을 단일 생물활성 분자로 추출할 수 있는 더 일반적인 개념 증명(proof of concept)을 제공합니다.

장 내 Hmgcs2 발현이 결여된 유전자 변형 마우스에서의 데이터는 βHB 및 기타 식이 의존성 대사물의 조직 특이적 생산을 연구할 필요성을 강조합니다. 놀랍게도, 순환 βHB 수준 변화 없이도 장 내 βHB 생산은 KD의 완전한 신경 보호 효과를 위해 필수적이었습니다. 간과 같은 다른 조직도 βHB 수준에 기여할 수 있지만, 이 결과는 GI βHB 수준이 효과적인 케톤체(KE) 용량을 더 잘 반영한다는 것을 시사합니다. 이전 연구에서 우리는 KE 보충과 KD 모두에서 GI βHB 조직 수준이 유사하게 증가했지만, 혈청 및 장 내강 수준은 KD에서 더 높았다는 것을 발견했습니다.16 이 결과는 장-신경 염증 상호작용에 대한 이해를 심화시키며, 호스트 대사물이 미생물 효과체를 통해 뇌에 신호를 전달하는 메커니즘을 보여줍니다.

우리는 Lactobacillus 균주 L. murinus KD6와 Lactobacillus가 생성한 대사산물 ILA가 각각 단독으로 질병을 회복시키는 데 충분함을 확인했습니다. 이전 연구에서 L. murinus 보충이 고염분 식이 섭취 마우스의 EAE 질환 심각도를 감소시켰으며, ILA가 in vitro에서 Th17 세포를 억제한다는 것이 보고되었습니다.51 본 연구는 다음과 같이 이 결과를 확장합니다: (1) ILA는 EAE로부터 보호합니다; (2) βHB-KE 치료는 분변 ILA 수준을 증가시킵니다; (3) ILA는 βHB의 보호 효과에 기여합니다. 박테리아 ILA 생산 유전자가 알려져 있기 때문에,50,52,53,54 ILA 생산량이 다른 동형 L. murinus 또는 다른 박테리아 균주를 대상으로 한 후속 연구는 EAE에서의 호스트 반응을 분석하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 공학적으로 설계된 박테리아는 프로바이오틱스의 MS에 대한 잠재적 광범위한 영향을 고려할 때, MS 환자 임상 시험을 더 통제된 환경에서 수행하는 데 기여할 수 있습니다.

장 미생물이 MS에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 잠재적 경로가 있습니다. 분절형 필라멘트 세균(SFB 또는 Candidatus arthromitus)과 Allobaculum 분리주는 Th17 세포를 활성화하여 EAE를 악화시키지만, Bacteroides fragilis는 Foxp3+ 조절 T 세포를 증가시켜 보호 효과를 제공합니다.60 우리 16S-seq 데이터 분석 결과, EAE와 관련된 종이 발견되지 않았으며, 이는 이러한 종이 우리 결과에 영향을 미치지 않았음을 시사합니다. 무균 마우스 모델을 활용한 추가 연구가 필요하며, 이는 다양한 식이 조건 하에서 이러한 면역 조절 장내 세균 종들이 어떻게 상호작용하는지 탐구해야 합니다.

본 연구는 이전 관찰 결과를 통합하고 확장합니다. 이는 케토제닉 식이와 다발성 경화증(MS) 보호 사이의 연관성을 보여주는 데이터,6,7,8,9,10,11 케토제닉 식이와 장 미생물군 변화 사이의 연관성,16,17 Lactobacillus에 의한 ILA 생산,51,53 ILA에 의한 Th17 세포 억제,51 및 Th17 세포의 MS 병리학에서의 핵심 역할을 포함합니다.44,45,46,47 따라서 호스트와 미생물의 대사 과정, 특히 βHB와 ILA와 같은 핵심 생물활성 화합물을 모두 고려하는 것이 중요합니다. 우리의 연구 결과는 βHB를 증가시키는 다른 식이 요법, 즉 간헐적 단식과 칼로리 복원 요법이 MS 환자 및 마우스 모델에서 일부 효과를 보였다는 기존 문헌에 기여합니다.9,61,62,63,64 βHB 및 ILA와 같은 생물활성 화합물을 표적으로 삼는 것은 MS 환자에게서 식이 요법의 장기적 효과 부족이라는 잠재적 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.65 본 연구에서 식별한 경로는 이러한 다양한 식이 개입이 MS에 영향을 미치는 공통된 메커니즘을 제공합니다. 더 넓게 보면, 우리 결과는 다른 자가면역 질환 및 대체 식이 개입에 대한 유사한 연구를 수행하는 기반을 마련하며, 식이, 장 미생물군집, 호스트 면역 사이의 복잡한 메커니즘에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

Limitations of the study

There are several limitations to our study deserving of follow-on work. While βHB inhibits microbiota growth,16 the mechanism and implications are unknown. We focused on the gut microbiome, but the dietary benefits for MS likely involve βHB’s direct effects on the host,32 such as inflammasome inhibition.33,34 The inflammasome shapes the microbiota’s immunomodulatory potential,66,67,68 offering another way βHB might affect host-microbiome interactions. Importantly, βHB can cross the blood-brain barrier and have immune effects in the central nervous system.69 Tryptophan metabolites, including ILA, influence Th17 responses through the aryl hydrocarbon receptor (AHR).70,71,72 Therefore, it will be important in future studies to investigate the role of host factors including the inflammasome and/or AHR in the mediation of the protective effect of a KD and KE supplementation.

Investigating other immunomodulatory effects of KD- or KE-altered microbiota could reveal additional insights, as Th17 cells are not the sole contributors to MS and EAE. It is also essential to examine other Th17-skewing models, such as IL-23 and IL-1β, implicated in EAE pathogenesis.73 Additionally, diet-induced changes in immune function could impact the gut microbiota. Future studies in humans and mouse models with varied diets and therapies will be important for exploring the translational relevance of ketone bodies, lactobacilli, and ILA. While βHB-KE raises fecal ILA during disease, no change was observed with a complex KD, possibly due to differences in timing, metabolism, or other factors that remain to be explored.

Resource availabilityLead contact

Further information and requests for resources and reagents should be directed to and will be fulfilled by the lead contact, Peter Turnbaugh (peter.turnbaugh@ucsf.edu).

Materials availability

This study does not contain newly generated materials.

Data and code availability

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All data are available in the main text, the supplemental tables, datasets, or deposited as listed below. This paper does not report original code. Any additional information required to reanalyze the data reported in this paper is available from the lead contact upon request.

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16S-seq and L. murinus whole-genome sequence are deposited under NCBI Bioproject: PRJNA1032118.

Acknowledgments

We would like to acknowledge the UCSF Gnotobiotics Core Facility (gnotobiotics.ucsf.edu) and the Parnassus Flow Cytometry CoLab RRID:SCR_018206 supported in part by the DRC grant NIH P30 DK063720. We also acknowledge the UCSF Quantitative Metabolite Analysis Center for their help quantifying ILA levels. We thank Dr. Michael Kattah for generously donating the VillinER/Cre mice. We thank BHB Therapeutics for providing the ketone ester. Funding was provided from the National Institutes of Health: R01DK114034, R01HL122593, R01AR074500, and R01AT011117 to P.J.T.; F32AI14745601, K99AI159227, and R00AI159227-03 to M.A.; K08HL165106 to V.U.; K08AR073930 to D.O. and R.R.N; R01AG067333 to J.C.N.; and R01DK091538 and R01AG069781 to P.A.C. P.J.T is a Chan Zuckerberg Biohub-San Francisco Investigator and was a Nadia’s Gift Foundation Innovator supported, in part, by the Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRR4216). Model figures were created with BioRender.com.

Author contributions

Conceptualization: M.A. and P.J.T.; data curation: M.A., V.U., L.R., R.R., and K.T.; formal analysis: M.A. and V.U.; funding acquisition: R.N., M.A., P.J.T., and J.C.N.; investigation: M.A., V.U., and Q.Y.A.; methodology: M.A., V.U., Q.Y.A., P.P., P.A.C., R.R., D.O., L.R., J.A.T., and C.W.; project administration: P.J.T.; resources: P.J.T., P.A.C., and J.C.N.; software: V.U.; supervision: P.J.T., R.N., J.C.N., P.A.C., and A.P.; validation: M.A. and V.U.; visualization: M.A. and V.U.; writing – original draft: M.A.; writing – review & editing: P.J.T.