C-NTA(Colocalization-NTA) QUATT Zetaveiw®를 통한 다중 염색 혈소판에서 유래된 MSC-EV …

[With위드인스트루먼트]

C-NTA(Colocalization-NTA) QUATT Zetaveiw®를 통한 다중 염색 혈소판에서 유래된 MSC-EV (중간엽 줄기세포 세포밖소포체)의 분석

안녕하세요.

독일 Particle Metrix GmbH 사의 국내 단독 대리점, 위드인스트루먼트 입니다.

지난 5월 19일 ISEV2023 (International Society for Extracellular Vesicles,

국제 세포밖소포체학회)에서 QUATT Zetaveiw® 시스템을 통한 Colocalization에 대해

Dr. Clemens의 발표가 있었습니다.

작년 하반기에 Twin Zetaview® 시스템을 통한 Colocalization 기능이 발표된지

얼마 되지 않아 레이저 4개가 동시 장착된 QUATT Zetaveiw® 모델로 3개 이상의

Multi-Staining된 입자를 분석할 수 있게 되었습니다.

이는 다른 NTA 판매사와는 다르게 Particle Metrix사가 2005년 초기 장비 개발

이후부터 현재까지 직접 다양한 연구 개발을 하면서 Zetaveiw® 시스템을 지속적으로

업그레이드를 하고 있다는 증거입니다.

산란 모드(Scatter mode) 방식의 NTA에서 형광(fluorescence)모드,

공초점화(Colocalization)모드 방식의 F-NTA, C-NTA로의 발전으로 인한

보다 EVs만을 타겟화하는 정확한 분석법으로 하시는 연구에 보다 도움이 되셨으면 합니다.

이번 포스팅에서는 PMX-430 QUATT Zetaveiw® 시스템을 사용하여

다중 염색된 MSC-EV의 C-NTA 분석에 대해 설명드리겠습니다.

개요

Colocalization Nanoparticle Tracking Analysis(C-NTA)는

기존 형광-NTA(F-NTA) 방법에 비해 상당히 의미있는 발전입니다.

C-NTA는 형광 표지 된 입자의 크기와 농도를 측정하는 것 외에도

단일 세포밖소포체, EV에서 일치하는 두 개 이상의 형광이 레이블링된 입자를

신속하게 감지할 수 있는 기능을 제공합니다.

다중 레이저 및 형광 필터의 선택을 통해 개별 형광 하위 집단뿐만 아니라

서로 다른 표면 마커에 대해 이중 양성인 입자를 정량화할 수 있습니다.

Keywords

Colocalization, Multi-staning, Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), extracellular vesicles, CD41, CD9, CMDR, Cell Mask Depp Red, antibody, 항체, 형광, membrane staining, NP-40, C-NTA, F-NTA, 형광NTA

연구 배경

선택된 MSC 유래의 세포외소포(EV)는 중요한 치료 잠재력 때문에

최근 집중적으로 연구되고 있습니다. 세포밖소포는 분리 전 세포에 따라

분류할 수 있지만, 최근 연구에 따르면 특정 EV 등급 내에서도 높은 이질성이 나타납니다.

EV 연구의 주요 목표 중 하나는 정제된 EV 샘플, 특히 크기가 200nm 미만인

샘플 내에서 불균일성을 확실하게 감지할 수 있는 방법을 설정하고 정의하는 것입니다.

그러나, 더 작은 EV를 분석하기 위해 현재 사용 가능한 대부분의 방법이 시간이 많이

소요되거나 제한된 매개변수 세트만 정량화할 수 있다는 사실로 인해 여전히 어려움을

겪고 있습니다.

F-NTA 방법보다 발전된 C-NTA는 하나의 샘플에서 서로 다른 EV 표현형의

다중 형광 신호를 포착함으로써 다켓 바이오 마케들을 검출, 측정할 수 있을 뿐 아니라,

단일 소포 수준에서 신속한 1회 측정으로 바이오 마커의 일치성을 보여줍니다.

이번 실험에서는 MSC-EV는 Cell Mask™ Deep Read(CMDR) membrane staining dye

및 Pacific Blue와 Alexa Fluor™ 488과 결합된 anti-CD9, anti-CD41 항체가

다중 염색되었습니다.

각각의 C-NTA 채널에서 상당한 양의 EV가 검출되고 정량화되었습니다.

또한, antibody/dye 염색 준비의 순서가 colocalization 비율에 영향을

미치지 않는다는 것을 보여줍니다.

실험 방법

MSC-EV의 세포 배양 및 정제 :

EV는 PEG 침전 절차를 통해 인간 혈소판 - 용해물의 존재 하에 성장된

MSC 조절 배지로부터 분리되었습니다.

Fluorescence labelling :

항체 레이블링을 위해, (i) 측정 농도가 4.2x10^11 particles/ml인 MSC-EV 1㎕를

anti-HuCD9PB의 1:25 희석액 5㎕ 및 (iv) CMDR 혈장 막 염색의 1:250 희석액 1㎕와

혼합합니다.

Pre-labeled된 두 antibodies, 항체 모두 EXBIO, Vestec(체코), CMDR(Thermo Fisher

Scientific, Schwerte, Germany)로부터 제공받았습니다.

EV와 두 항체는 실온 암실에서 1시간 동안 Incubation되었습니다.

항체 인큐베이션 후, CMDR을 첨가하고 추가로 1시간 더 인큐베이션하여

2시간 암실 보관하였습니다. 최종 인큐베이션 샘플은 Zetaview, NTA 분석을 위해

PBS 버퍼로 최종 1ml에 맞춰 희석되었습니다.

EV의 membrane을 깨는데 사용되는 Calbiochem, Merck, Darmstadt(독일)의

비이온성 세제 NP-40 Alternative(일명 NP-40)로 세제 컨트롤을 준비했습니다.

인큐베이션 후, 0.5% NP-40 용액(입자가 없는 PBS에 희석) 12uL를 라벨링된

EV일에 첨가하여 최종 농도 0.25% NP-40을 얻은 후, 실온에서 30분 incubation 하였습니다.

용해된 샘플은 Zetaview, NTA 분석을 위해 1ml의 PBS로 희석했습니다.

NTA 및 Colocalization 측정

크기 및 농도의 NTA 측정 및 Colocalization 측정은 Particle Metrix사의

Zetaview 소프트웨어와 Zeta Navigator 소프트웨어가 장착된 QUATT Zetaveiw®,

PMX-430 모델로 진행되었습니다.

EVs의 Colocalization ratio의 결정을 위해 3개의 형광 채널(405nm, 488nm, 640nm

레이저 및 형광 필터)이 사용되었습니다.

크기 및 농도 측정

Zetaveiw 시스템을 사용하여 산란 모드에서 표준 NTA 측정 결과 중간 직경(X50)

은 117nm이고 농도는 ml당 2.5x10^11 입자였습니다.

표 1) PMX-430 QUATT Zetaveiw® 모델의 Colocalization 측정 파라미터

샘플의 EV를 구체적으로 표현하기 위해 입자는 Pacific Blue의 anti-CD9,

AF488의 anti-CD41 및 멤브레인 연료 Cell Mask™ Deep Red로 다중 표지되었습니다.

형광 색소(Fluorochromes)의 특정 선택은 개별 형광 채널의 유출(spill-over)을

방지해야 하는 우리의 필요성을 반영합니다.

그림 1) MSC-EVs의 입자 크기 히스토그램 - Scatter 모드(회색), 형광 모드

(파란색 : anti-CD9 Pacific Blue, 녹색 : anti-CD41 AF488, 빨간색 : Cell Mask™ Deep Red)

C-NTA 측정은 QUATT Zetaveiw® 기기를 사용하여 3개의 모든 형광 채널에서

EVs의 이중 양성 검출을 산출했습니다.

CD9 양성 EV는 128.8nm의 중간 직경(X50)과 3.3x10^10 particles/ml의

농도로 측정되었습니다. 대조적으로 CD41 양성 EV의 평균 직경은 136.6nm로

다른 형광 산란 모드에서 검출된 입자보다 약간 더 컸습니다.

CD41 양성 EV의 측정 농도는 3.05x10^10 particles/ml이었습니다.

CMDR에 대해 양성인 EV는 X50이 124.8nm이고 농도가 7.57x10^10 particles/ml

인 것으로 분석되었습니다.

CMDR의 농도값은 CD9 및 CD41 개체군보다 2배 이상 크며,

이는 이러한 Tetraspanin(테트라스파닌)이 없는 추가 EV 및 또는

기타 지질 막 입자의 존재를 시사합니다.

청색, 녹색 및 적생 형광 채널에서 검출된 CD9, CD41 및 CMDR 양성 EV의

비율은 각각 13.3%, 12.2%, 및 30.28%인 것으로 나타났습니다.

CMDR 결과는 샘플이 정제되지 않았기 때문에 EV 외에 다른 나노 입자를

포함할 가능성이 있다는 점을 감안할 때 이 Dye가 EV만을 특이적으로 염색하지

않고 오히려 다른 지질 또는 막을 포함한 구조도 staining하여 640nm 형광 채널에서

분석되었기 때문일 것으로 예상되었습니다.

그림2) Membrane staining을 막기 위해 0.5% NP-40으로 처리된 EVs의

           다중 염색된 입도 분포

NP-40의 사용으로 산란(Scatter) 모드에서 입자 수가 50.8% 감소했으며,

형광(Fluorescence)모드에서는 입자가 없음을 보여주었습니다.

입자의 약 50%가 산란 모드에서 관찰 가능하게 남아 있다는 사실은

샘플 모집단의 절반이 세제에 내성이 있는 막을 형성하지 않은 비막 입자를

포함하고 있음을 나타냅니다.

Colocalization 연구

C-NTA를 사용하면 동일한 양의 형광 표지된 입자가 매우 빠르게 산란광을

나타내거나 세가지 다른 파장의 레이저가 차례로 조사되고 해당 필터를 사용하여

형광 신호가 연속적으로 감지됩니다 (표1 참조).

다중 염색된 EV의 C-NTA는 39%-41%(그림 3 A-C 참조)이며 CD9-CD41에

검출된 EV에서 가장 높은 특이성을 나타냈는데, 이는 두 쌍의 항체가 검출되었기 때문입니다.

또한, 두 쌍의 CD9-CMDR 및 CD41-CMDR은 비슷한 Colocalization 비율

(41%(+/-2) 및 38%(+/-4.5))을 보여줍니다.

특히나 CMDR을 사용한 염색은 모든 지질 막 입자에 대한 결합으로 인해

Antibody labeling을 사용하는 것만큼 표적화되지 않습니다.

2개의 레이저를 사용한 Colocalization과 관련한 이전 포스팅과 달리

이번 실험에서는 CD9-CD41(58.5% 대 39%)의 Colocalization 비율이 더

낮아진 것으로 분석되었습니다.

이는, 아마도 다른 배치의 MSC-EV가 사용되었기 때문일 것입니다.

예상대로 0.5% NP-40을 사용하는 세제 대조군에서는 Colocalization 현상이

관찰되지 않았습니다. (그림3 D-F 참조)

그림 3 : CD9 PB, CD41 AF488 항체 다중 염색 및 CMDR 염색으로 해당 형광 채널 쌍에서

검출된 MSC-EV의 Scattering 분석된 x-y 중심 좌표의 대표적인 섹션

각 파란색, 녹색, 및 빨간색 점은 각각 CD9, CD41 및 CMDR에 대한 EV 양성을 나타냅니다.

이중 양성 이벤트는 파란색 십자가로 강조 표시되고 각 플롯의 오른쪽 하단에 백분율로 표시됩니다.

A-C : 해당 이중 형광 채널에서 감지된 EV의 Colocalization 결과

D-F : 0.5% NP-40 용액을 첨가한 후 세제 대조군에서 Colocalization 현상이 관찰되지 않은 결과

다양한 EV-labelling 순서

C-NTA에 사용되는 염료 또는 항체가 많을수록 다른 Dye를 추가할 수 있는

순서가 더 다양해집니다.

Colocalization 비율이 antibody와 membrane label이 추가된 순서에

의존하지는 여부를 조사하기 위해 MSC-EV에서 4종의 다른 염색 순서로 시험해보았습니다.

그 결과는 그림 4에 나와 있으며, 적어도 이 label의 혼합물을 사용하여 염색 순서가

달라지더라도 Colocalization 결과에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았음을 보여줍니다.

그림 4 )

A : MSC-EV의 다중 라벨링을 위해 4가지 다른 염색 순서를 조사했습니다. 대괄호 안의 라벨은

먼저 MSC-EV와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음 추가 인큐베이션 시간과 함께

세 번째 라벨을 추가했습니다. 염색 순서 4를 2시간 동안 직접 배양했습니다.

B : 다른 염색 순서에 대한 Colocalization 비율의 의존

FMO 컨트

FMO(Fluorescence minus one) 컨트롤은 음성 모집단에서 양성을

식별할 때 중요합니다.

데이터를 획득할 때 형광 확산(spill-over)이 있을 수 있으며, 특히 더 밝은

형광체(fluorophore)의 경우 보정(이 연구에서는 필요하지 않음) 및 교차 레이저

여기(excitation) 후에 눈에 띌 수 있습니다.

새로운 다색 실험을 시작했을 때 패널의 모든 형광체에 대해 FMO 컨트롤이

수행되었습니다.

염색하는 동안 하나의 염료 또는 항체가 생략되었지만 Colocalization은 여전히

사용 가능한 모든 형광 채널에서 테스트되었습니다(그림 5 참조).

그 결과, 염료의 조함에 따라 Colocalization이 관찰되는 한 쌍의 형광 채널만

존재하였습니다.

그림 5 : MSC-EV의 FMO 컨트롤

왼쪽 열은 세 번째 표지(항체 또는 CMDR)를 건너뛴 이중 염색을 보여줍니다.

열 2~4는 레이블이 지정된 EV가 감지되는 각각의 이중 형광 채널을 나타냅니다.

FMO 대조군은 하나의 형광단을 생략할 때 사용된 형광 채널 중 한쌍에서만

Colocalization을 보여주었습니다.

요약

이 연구에서는 C-NTA를 사용하여 3종 multi-labeled EVs의 characterization 및

phenotyping을 처음으로 설명합니다.

여러 개의 레이저와 형광 필터 결합을 사용하여 CD9/CD41, CD9/CMDR 및

CD41/CMDR 이중 양성 EV의 비율을 빠르고 재현 가능하게 감지할 수 있었습니다.

각 C-NTA 측정 중에 브라운 운동도 추적되기 때문에 단일 측정 중에 모든 형광 EV 하위 집단의

정확한 크기 분포 및 농도 정보를 colocalization 데이터와 동시에 사용할 수 있습니다.

False-positive 검출 및 인공물은 detergent 컨트롤로 방지되었습니다.

또한, 이러한 제어는 공초점화(colocalized)된 입자가 실제로 EV임을 확인했습니다.

FMO 대조군은 인접한 채널에서 형광 확산을 나타내지 않았으므로 (i) 라벨링 및

(ii) 사용된 형광 채널에 대한 형광 포어(fluorophore)의 특이성을 입증했습니다.

Labelling sequences(라벨링 순서)에 대한 가능한 순열(permutations)은 각각의 추가 라벨과

함께 크게 증가하므로 다른 염색 순서를 테스트했으며 staining sequence(염색 순서)가

여기에서 조사된 colocalization 비율에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다.

이전 포스팅의 연구에서와 같이 모든 구성 요소를 포함하는 음성 대조군(negative controls)이

MSC-EV 없이 준비되었지만 양성 샘플에 비해 입자 수가 현저히 감소했으며 입자의 직경은

거의 동일하게 유지되었습니다.

고도로 표적화된 C-NTA 실험의 사용은 항체와 막 염색의 조합이 관심 EV의 양을

결정할 수 있음을 보여줍니다.

또한 C-NTA는 정확한 크기 및 농도 측정의 이점을 포함하여 단일 측정 내 단일 입자 수준에서

바이오마커(biomarker)를 감지하고 식별하기 위한 정확한 도구임이 입증되었습니다.

따라서 C-NTA는 흥미진진한 EV의 세계에 남아 있는 수수께끼를 풀 수 있도록 돕기 위해

고도로 Targeting된 접근 방식을 제공합니다.

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감사합니다.