항원 항체에 관하여

[영범이]

항원과 항체

1.서론

체액성 면역에 의해 숙주가 방어되는 효과는 당단백질인 항체에 의해 이루어진다. 항체는 항원과 결합했을 경우에만 생물학적 활성을 갖게 된다. 항체는 효소가 아니기 때문에 특별한 경우를 제외하고는 항체와 결합하는 항원의 구조를 변화시키지 못한다. 항원과의 비공유결합(non-convalent binding)에 의해 반응하는 항체는 한 종류의 항원에만 특이적으로 결합하며 때에 따라 결합력도 강하다. 면역반응시 특이적인 면역체계에 의해서 항원을 인식하는 세 종류의 분자는 항체, 주조직적합성복합체 및 T 림프구 항원수용체로 구성되어 있다. 항체는 B 림프구로부터 막에 부착된 형태(membrane form)로 생성되며, 이 막부탁형의 항체가 항원에 대한 B 림프구 수용체의 기능을 갖는다. B 림프구상의 막부착형 항체가 갖는 항원과의 상호작용이 바로 체액성 면역의 인식단계(recognitive phase)가 된다. 항원자극에 대한 반응으로 분화된 B 림프구 자손으로부터 분비형(secreted form) 항체가 생성되기도 한다. 이들 분비형 항체가 항원과 결합하게 되면 수많은 면역계의 실행기능(effector function)이 생겨난다.



2.항체의 분자구조


1) 항체분자의 분포 및 순수정제


혈액이나 혈장이 응고되고 남은 액체부분에 항체가 함유되어 있는데, 이것을 혈청(serum)이라한다. 대부분 항체가 함유된 혈청을 항혈청(antiserum)이라고 한다. 더 이상의 결합이 일어나지 않게 될 때까지 연속희석(serial dilution)하여 특정항원과 결합하는 혈청 내 항체 분자의 수를 측정할 수 있다. 혈장이나 혈청내 당단백질은 용해도에 따라 알부민과 글로불린으로 나누어지고, 전기영동에 의한 이동도에 따라 더 세부적으로 나눈다. 대부분의 항체가 이동도가 빠른 세 번째 분획인 γ-globulin분획에 들어있다. 항체를 뜻하는 또 다른 명칭은immunoglobulin인데 이는 γ-globulin 분획 중에는 면역성이 부여되어 있기 때문이다.


2) 항체구조


전체적인 구조면에서 모든 항체분자는 비슷한 모양을 가지고 있어 일반적으로 전하나 용해도 등의 물리화학적 특성이 동일하다. 모든 항체는 두 개의 동일한 경쇄(약 24KD)와 두 개의 동일한 중쇄(55KD 혹은 70KD)로 구성되는 공통의 구조를 가진다. 항체분자들은 전체적 모양은 유사하지만 크기, 전하, 용해도, 그리고 항원으로서의 행동 등 물리화학적인 특성상작은 차이점을 가지고 있으므로 항체분자를 종(class) 및 아종(subclass)으로 세분한다. 사람의 경우 항체분자의 종에는 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 다섯 가지가 있으며, 이것을 동종형(isotype)이라 한다. 모든 동종형의 중쇄는 그리스 알파벳 문자로 표기하는데, 즉 IgA은 α1, IgA2은 α2, IgD는 δ, IgE은 ε, IgG1은 γ1, IgG2는 γ2, IgG3는 γ3, IgG4는 γ4, 그리고 IgM은 μ로 표기한다. 이들 중쇄는 특정한 세포 표면 수용체나 보체와 같은 다른 거대분자에 결합하여 특정 면역의 실행기능을 활성화 한다. 경쇄에는 κ와 λ라는 두가지 동종형이 있다. 그러나 경쇄 항체의 실행기능에 영향을 미치거나 중개하는 않는다. 각각 독특한 아미노산 서열을 갖기 때문에 서로 다른 항원과 결합할 수 있는 약 1x107개보다 많은 약 109 정도의 서로 다른 항체분자를 모든 사람이 가지고 있다. 아미노산 서열의 차이가 항원결합에 변화를 주는 것이기 때문에 이러한 구조적인 극도의 다양성은 향원에 결합하는 항체의 특이성이 거의 무한하다는 것을 의미한다. 이론적으로 아미노산 서열의 극도의 다양성은 단백질의 3차원적 구조가 아미노산 서열에 의해 결정된다. 아미노 말단분역을 가변부위(variable region, V)라고 하고, 보다 일정한 서열로 이루어진 각 사슬의 나머지 부분을 불변부위(constant region, C)라 한다. 또 가변부내 극도로 다양한 서열부위를 과변이부위(hypervariable region)라 하고, 서열이 거의 변하지 않고 보유되는 가변부내 나머지 부분을 골격부위(framework region)라 한다.

면역글로불린은 각 경쇄내 세 군데의 과변이부위, 각 중쇄내 세 군데의 과변이부위가 서로 3차원적 공간을 형성하여 항원결합부위를 구성한다. 결합된 항원의 표면과 3차원적인 상보성을 갖는 공간이 이러한 서열에 의해 구성되기 때문에 과변이부위를 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDRs)라고도 부른다. 즉 중쇄와 경쇄의 V부위는 항원을 인식하고, 중쇄의 불변부위는 실행기능, 즉 생물학적 활성을 지닌 부위이다.


3) 항체의 세부구조


(1) 경쇄의 구조

사람의 경우 κ나 λ의 경쇄를 갖는 비율은 50:50이지만, κ를 포함하는 항체와 λ를 포함하는 항체 사이에는 기능상 아무런 차이점도 없다. κ나 λ에 관계없이 각 경쇄는 접혀져 각각 폴리펩타이드의 아미노 말단과 카복시 말단에 상응하는 불리된 V분역과 C분역을 이룬다. 각 분역은 약 110개의 아미노산으로 구성된다. 서로 다른 경쇄간 아미노산 서열의 변이도는 V 부위의 분리된 세 위치에 의해서 주로 생겨난다. 이 세 과변이 부위 즉 CDR은 약 10개의 아미노산 서열의 길이를 갖는다. 아미노 말단쪽으로부터 이 과변이부위을 CDR1, CDR2, CDR3이라 한다. CDR3은 나머지 CDR보다 더 변이가 크다. 항체 표면구조의 변화들은 항원에 대한 특이성을 결정짓는 것으로 생각된다.

(2) 중쇄의 구조

경쇄에서처럼 아미노 말단의 가변부위, 즉 VH는 중쇄 주에 큰 변이도를 보이며, 또 CDR1, CDR2, CDR3이라 부르는 세 개의 짧은 돌출부에 극도의 변이도가 집중되어있다. 중쇄의 나머지 부분을 불변부위를 구성하는데 각 동종형간의 차이를 갖는다. CH1과 CH2사이에는 움직일수 있는 부위로 이 부위를 경첩(hinge)부위라고 부르며, 이 경첩부로 인해 IgG아종(subclass)의 불변부간에는 커다란 차이가 있게 된다. 모든 중쇄는 마지막 CH분역 카복시 말단의 아미노산 서열 차이에 의해 분비형 아니면 세포막 결합 항체로 발현된다. 혈장에서 발견되는 분비형의 카복시 말단은 전하를 띤 친수성의 아미노산과 결합된다. 항체생산 B 림프구의 막에만 존재하는 막부착형은 26개의 전하를 띠고있지 않은 소수성 아미노산에 세포질 분획을 만드는 아미노산이 연결된 특징적인 카복시 말단을 가지고 있다.

(3) 경쇄와 중쇄의 결합

모든 항체분자들은 각 경쇄가 하나의 중쇄와 결합한 후 중쇄가 다른 중쇄와 결합하여 쌍을 이루는 기본결합 양상을 나타낸다. Fab(fragment, antigen binding) : 항원과 결합하는 부위, Fc(fragment, crystalline) : CH2와 CH3로 구성되는 서로 간의 결합될 뿐아니라 격자를 구성하여 결정화되는 성질을 가진다.




3.항원항체 결합

1) 생물학적인 항원의 구조


항원(antigen)이란 항체분자나 T 림프구 수용체와 특이하게 결합하는 물질로 정의한다. 현재 복합 탄수화물, 인지질, 핵산 단백질 등의 거대분자 뿐 아니라 간단한 중간대사산물, 당, 지방, 자능성 약물(autocoid), 호르몬을 포함하여 모든 종류의 생물학적 분자들이 항원으로 제공된다. 그러나 단지 거대분자 만이 항체반응을 일으키는 림프구를 활성화시킬 수 있다. 이러한 면역반응을 유발시킬 수 있는 분자를 면역원(immunogen)이라고 한다. 작은 분자에 특이적인 항체를 생산하기 위해서는 면역접종전에 작은 분자에 거대분자를 결합시켜야 한다. 이러한 경우 작은 분자를 햅튼(불완전 항원, haten)이라 하고, 외래 단백질인 이 거대 분자를 담체(운반체, carrier)라고 한다. 거대분자는 항체분자의 항원결합부위보다 일반적으로 훨씬 크기 때문에 항체분자는 거대분자의 어느 특정 부분, 즉 항원결정기(determinant 또는 epitope)에만 결합한다. 거대분자에 부착된 햅튼은 거대분자 입장에서 보면 항원결정기라고 볼 수 있다. 전형적으로 거대분자에는 많은 항원결정기가 있어 각각에 항체가 결합할 수 있다. 단백질은 공통적으로 항원 결정기가 공간적으로 떨어져 있기 때문에 동일 항원분자에 각각의 항체분자가 서로 영향을 미치지 않고 결합할 수도 있다. 다수의 항원결정기를 가진 항원을 다가항원이라 한다. 단백질의 경우 공유결합으로 연결된 아미노산 잔기들에 의해 형성되는 항원결정기를 선형 항원결정기(linear determinant)라고 부른다. 단백질 항원의 경우 특이항체와 결합하는 선형 항원결정기는 대략 6개의 아미노산 길이의 크기를 갖는다. 자연상태인 구조에서의 선형 항원결정기는 항체와 결합하지 않지만 변성시켰을 때 결합하는 경우가 있다.

구조형 항원결정기(conformational determinant)는 단백질의 포개진 부분이 공간적인 구조를 형성하여 선형 아미노산 서열에서 떨어져 있는 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 인산화(phosphorylation)나 특별한 단백질 가수분해에 의해 단백질을 공유결합으로 변화(covalent mnodification)시킬 수 있다. 공유결합을 바꾸는 이 변화로 형성된 새로운 항원결정기를 신항원결정기(neoantigenic determinant) 혹은 신항원(neoantigen)라 하는데 특이항체에 의해 인식되는 것으로 보인다.

2) 항원결합의 구조적 원리


항체분자의 제한적 단백질 가수분해(limited proteolysis)로 항체의 항원결합기가 Fab분획에 있음을 알게 되었다. 이러한 기능을 하는 정확한 위치가 과변이부위에 있는 것으로 알려져 있다. 가장 많이 접촉한 부위는 변이도가 큰 세 과변이부위 중 세 번째 과변이부위라는 것을 알 수 있다. 항원-항체 복합체를 분석한 결과에 의하면 단백질 항원은 틈이 아닌 약간 평면적(planar)인 항원결합기와 상호 작용하는 것으로 나타났다. 항체에 의한 항원의 인식을 비공유성 가역적 결합이다. 즉 항원인식 후 처리됨을 의미한다. 단일가 항원과 단일항체 결합부위간의 결합력을 친화력(affinity)이라 한다. 이것은 실험적으로 측정이 가능하다. 친화력은 보통 용액상태에서 항체결합부위의 1/2을 점유하는데 필요한 항원의 해리상수를 말한다. 보다 작은 Kd값은 보다 강하거나 보다 높은 결합능을 의미한다. 자연항원에 대한 특이적인 항체의 Kd 값은 10-7 - 10-10M사이의 값을 갖는다. 자연상태의 혈청에는 특이항원에 대해 일차적으로 CDR의 정확한 아미노산 잔기의 서열에 따라 여러 종류의 친화력을 가진 항체들이 혼합되어 있다. 어떤 항체집단의 평균 친화력은 반복면역에 의해 상승된다. 이와 같은 현상을 친화력 포화(affinity maturation)라 한다



4. 항체의 기능


1) B 림프구 하원수용체로서의 막부착형 항체


특이적인 B 림프구에 항원의 결합은 B 림프구의 증식과 항체생산의 신호이다. 항원의 인식은 B 림프구 표면에 있는 부착형 항체에 의해 시작된다. B 림프구가 성숙하는 단계에 따라 각기 다른 중쇄의 동종형이 발현된다. 예컨대 미성숙 B 림프구는 IgM을 발현하고 자극받은 일이 없는 B 림프구는 IgM과 IgD를 발현한다. 그리고 자극 받은 B 림프구는 각종 동종형이나 아형을 발현한다. 다가항원과 세포 표면 항체와의 교차결합은 B 림프구 활성화의 중요한 신호라는 것을 제시하고 있다. 막부착형 항체분자는 신호발생에 관여하는 다른 두 종류의 단백질(Igα와 Igβ)과 결합되어 있다.


2) 분비형 항체에 의한 항원의 중화


분비형 항체는 해로운 인자들의 표면 결정기와 결합하여 인자들의 작용을 차단한다. 그 결과 독소 혹은 감염인자를 중화시킨다.


3) 동종형에 따른 항체의 기능


B 림프구는 중쇄 동종형 전환(heavy chain isotype switching)되어 다른 시간대에 동일한 항원결합 특이성을 갖는 다른 동종형을 생산한다.

(1) IgG와 IgM에 의한 보체의 활성화

보체계는 단계적인 단백질의 가수분해가 이루어져 실행분자가 만들어지는 일종의 혈청단백질(serum protein)이다. 보체란 의미는 어떤 표적세포를 용해시키며 열에 안정된 항체의 기능을 보조해 주는 열에 약한 혈청내 요소를 지칭한다. 보체계는 체액성 면역의 여러 가지 세포용해작용이나 염증반응을 중개한다. 여기서 고전경로를 통해서 보체를 활성화시키는 사람의 동종형 항체에 대해 언급한다. 고전경로는 C1q가 세포 표면에 결합하거나 면역복합체 형성에 관여하는 IgG1, IgG3의 Cγ2에, 또는 IgM항체의 Cμ3분역에 결합하여 활성화가 개시된다.

(2) 식균작용을 증가시키는 항체에 의한 옵소닌화

단핵식균세포는 IgG분자의 Fc부위에 대한 수용체가 발현된다. 사실 이들 세포에는 최소한 세가지의 다른 Fc 수용체가 발현되며, 이들 각 수용체는 각기 다른 IgG 아형에 대해 친화력 및 기능이 다르다. 백혈구상에서 발현되는 이 세가지 종류의 IgG수용체(FcγR)들 모두는 면역글로불린과 같은 영역을 포함하고 있어서 면역글로불린 유전자 초집단(Ig gene superfamily)에 속한다. FcγRs수용체가 식균작용에 관여하여 이들 수용체에 가장 잘 결합하는 IgG1과 IgG3같은 IgG아형이 식균작용을 증강하는데 가장 효과적이다. 보체의 세 번째 구성요소인 C3에서 유리된 C3b 역시 백혈구상의 C3b 수용체와의 결합을 통해 외래물질을 옵소닌화하여 식균작용을 증진시킨다.

(3) 항체의존성 세포매개 세포독성

세포용해성 T 림프구외에 호중구, 호산구, 단핵식균세포, 그리고 특히 자연살해(natural killer, NK)세포등 몇가지 다른 백혈구 집단은 여러 표적세포(target cell)를 용해시킨다. 많은 경우에 표적세포를 죽이는 것은 표적세포가 특이적인 IgG에 의해 미리 둘러싸여 있어야 하는데 그러한 용해과정을 항체 의존적 세포매개 세포독성(antibody dependent cell mediated cytotoxicity ADCC)이라 한다. FcγRIII혹은 CD16이라는 백혈구상의 Fcr에 대해 저친화력의 수용체에 결합된 항체를 통해서 표적물질을 인식한다. ADCC기능을 갖는 대표적인 세포인 자연살해세포의 경우 IgG에 의해 인식기능과 활성화(종양괴사인자, 감마 인터페론)을 제공 받는다. 기생충은 호산구의 과립내에 들어 있는 염기성 과립에 의해서는 용해될 수 있으며, 이 경우에 호산구는 IgE항체에 대한 고친화력을 가진 FcεR1을 표현하고 있기 때문에 IgG보다 오히려 IgE가 인식과 작동세포의 활성화를 제공하는 기본적인 동종형 항체이다.

(4) IgE에 의한 즉시형 과민반응

비만세포나 호염구는 IgE 분자의 Fc부위에 대해 친화력이 높은 수용체를 발현한다. FcεRI은 높은 친화력으로 인해 항원이 없는 상태에서도 IgE 단량체에 점유되는데 이는 ADCC에 관여하는 FcRγIII와는 크게 차이나는 것이다. 특이항원이 도입되면 결합된 IgE 분자와 수용체간의 응집을 일으킨다. IgE와 수용체의 응집은 비만세포 혹은 호염구로부터 염증반응과 혈관 활성 인자 히스타민의 유리, 지질 유래의 매개인자(leukotriene, prostaglandin, PDF)의 합성과 분비 및 사이토카인을 방출시킨다. 방출된 이들 매개인자로 인하여 혈관 및 염증반응을 즉시형 과민반응이라 한다.

(5) IgA에 의해 매개되는 점막내 면역

여러 동종형 항체 중 IgA 혼자만이 선택적으로 점막차단층(mucasal barrier)을 통과하여 점막층을 구성한 기관의 내강으로 들어간다. 정상인의 IgA는 다른 동종항체보다 많이 합성되지만 주로 점막 림프조직에서 생산되어 점막강으로 이송되며, 혈장의 1/4보다 적은 양이지만 효과적이다. 소장과 같은 기관의 상피세포는 IgA의 이량체에 대해 특이적으로 결합하는 Fc수용체를 발현한다. 이 IgA 수용체를 폴리(poly Ig)수용체 또는 분비성분(secretory component)이라 한다. 분비성분과 결합한 IgA는 소포운반(vesicular transport)에 의해 세포를 통해 점막 표면으로 이동한다. 분비점액에서 IgA는 감염성 인자를 중화시키고 FcαR를 가진 작동세포에 의해 ADCC효과를 발휘한다.

(6) 모체 IgG에 의해 매개되는 신생아 면역

IgG는 모유로 분비되어 신생아가 섭취하여 신생아의 장내에서 증식하려는 병원성 미생물을 중화시킨다. IgA 분비의 반대방향으로 IgG는 특이적으로 장으로 흡수되어 신생아의 혈류로 들어간다.

(7) IgG에 의한 면역반응의 되먹임 억제

IgG의 집합체 혹은 IgG를 포함한 항체-항원 복합체가 B 림프구(FcγRII)상의 FcγR 수용체에 결합하는 것으로 이들은 항체 되먹임(antibody feedback)이란 과정으로 의해 B 림프구의 활성화를 억제하는 것으로 보인다.

5. 항체를 이용한 실험



임상진단 및 임상연구시 항체가 하나의 도구로서 어떻게 이용되는가를 알아보자. 항체의 이용성은 항체가 특이항원과 결합하여 면역복합체를 형성하는 능력에 달려있다. 면역화학(immunochemistry)에서 이러한 면역복합체가 용액 내에 형성되는 여부를 빛의 산란을 이용하여 측정함으로써 항원을 검출한다. 화학물질을 사용하여 항체를 침전시키거나 원심분리시켜 특정 면역복합체를 분리해 내는 것으로 이 방법으로 여러 물질이 섞여 있는 혼합용액 내의 특이항원을 정제할 수 있다. 항원이 존재하면 젤상에서 항원-항체의 침전반응이 일어나 항원의 존재여부를 알 수 있다.


1) 항원의 정량


방사면역 측정법(radioimmunoassay, RIA) : 방사선 동위원소를 사용하여 지시분자를 표지하여 신틸레이션 계수기 내에서 붕괴되는 방사선양을 측정하여 지시분자의 농도를 정량할 수 있다.

효소결합면역 측정법(enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) : 효소에 지시계 분자를 공유결합시키고, 여기서 기질을 가하여 효소에 의한 기질의 분해 생성물을 분광광도계를 측정하여 농도를 계산한다.

면역결합 분석법을 기본으로 하여 임사에 응용되는 방법은 환자의 가검물내의 어떤 미생물(virus, bacteria)에 대한 특이항체의 존재여부는 감염의 지표가 된다. 이러한 경우는 동물유래의 항체를 미량정량 플레이트(microplate well)의 지지체에 중복되도록 부착시킨 후, 한쪽은 표준 항원의 포화용액을 다른 한쪽은 환자의 혈청을 단계적으로 희석하여 첨가하여, 세척으로 결합하지 않는 항체를 효소결합 항체 또는 방사성 동위원소로 표지한 항체에 의해 확인된다. 이결과는 혈청의 최대 희석액에서 특이항체의 존재를 확인할 수 있다.


2) 단백질 항원의 동정과 특성


단백질 항원의 동정과 특성의 규명을 위해 면역화학에서 주로 이용되는 두 가지 방법에는 면역침전법(immunoprecipitation)과 웨스턴블라팅(western blotting)이 있다.

(1) 면역침강법(immunoprecipitation)

한 종류으 단백질 항원에 대한 항체를 이용하여 혼합액에 들어 있는 특이항원을 분리하는 데 면역침강법이 이용된다. pH를 변화시키거나 결합의 친화력을 감소시키는 용매로 특이항원을 항체로부터 유리시킬 수 있다.

(2) 웨스턴브라팅(Western blotting)

만일, 확인하려는 단백질 항원이 다른 항원들과 섞여 혼합액 내에 들어 있다면 처음에는 젤 내에서 분자 크기에 따라 단백질들의 분리 위치가 달라지는 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동과 같은 전형적인 분석적 분리 방법을 사용하여 분리한다. 분리된 단백질을 모세관작용 혹은 전기영동상에 의해 분리젤로부터 지지막으로 옮길 수 있다(blotting). 대부분의 웨스턴브라팅법은 항체를 결합시켜 실시하는 분석법이므로 면역브라팅(immunoblot)이라고도 한다.


3) 세포 표면 표지법과 분리법


세포집단을 분리 확인하고 동정하기 위해 항체가 주로 이용된다. 이를 위해 항체를 방사성 동위원소로 표지하거나 효소를 결합시키거나 혹은 일반적으로 형광을 띠는 물질로 표지하는 방법들이 이용된다.


4) 조직이나 세포내 항원의 존재부위


면역형광법(immunofluorescence)이라 불렸던 이 방법에서 형광물질로 항체를 표지하고 단층세포나 조직의 동결박절편에 결합시켜 염색된 세포나 조직을 형광현미경으로 관찰하여 항체의 존재를 확인한다.