- 크로마토그래피의 원리
크로마토그래피는 미량으로 얻어진 물질의 분리와 정제를 위하여 가장 흔하게 사용되는 방법입니다.
우리가 흔히 어떤 물질의 용해도를 예견할 때나 녹일 때에, 비슷한 것은 비슷한 것을 녹인다 (Like dissolves like.)라는 표현을 많이 씁니다. 마찬 가지로 극성은 극성끼리 비극성은 비극성끼리 잘 섞인다는 사실이 크로마토그래피의 기본 원리입니다.
- 크로마토그래피의 구성
크로마토그래피는 고정상과 이동상으로 구성되어 있습니다.
Stationary phase (고정상) : 쉽게 말하자면 크로마토그래피에 분리나 정제될 물질이 올려질 고체 지지제로 일종의 흡착제입니다. 고정상은 일종의 흡착제이므로, 크로마토그래피에 올려진 물질이 흡착제와 친화력이 큰(잘 섞이는) 물질이라면 이동이 잘 되지 않을 것입니다. 반대의 경우는 이동이 잘 될 것입니다.
Mobile phase (이동상) : 고정상에 올려질 물질을 이동시키기 위한 수단입니다. 보통 혼합용매를 사용하며 전개제라고도 불립니다.
- Rf 값
분리나 정제하려는 물질을 적당한 용매에 녹인 후 이동상을 따라서 이동하게 할 때, 그 물질이 고정상에 흡착되는 차이에 의하여 이동이 잘되거나 안 되게 되어 물질의 분리가 일어나게 되는 것 입니다.
이 현상은 모든 조건이 동일하게 이루어진다면, 다음번에도 같은 이동의 결과가 얻어지는 재현성(모든 과학에서는 재현성이 중요)이 있게 됩니다.
즉 일정한 온도와 압력하에서 같은 물질이 같은 이동상에서 같은 용매(전개제)로 전개 시켰을 때 같은 거리를 이동한다는 것입니다.
이 이동거리는 이동상이 움직인 길이가 짧으면 차이가 적게 나타나지만, 길면 차이가 많이 납니다. 이 차이는 비례적으로 나타나게 되며, 이 비례는 항상 일정하며 rate of flow (Rf값)라고 부릅니다.
이해를 돕기 위하여, 님이 중고교시 실험한 “백묵에 의한 컬럼크로마토그래피”를 예를 들어 설명을 해보겠습니다.
백묵에 잉크 띠를 두르고 물을 부은 샤렛에 백묵을 세워두면, 물이 백묵을 따라 올라가면서 잉크 띠가 이동하는 실험을 경험하였을 것입니다.
이때 백묵에 두른 띠는 물의 수면 위에 있어야만 합니다. 밑에 있는 경우는 번져버리겠지요.
이처럼 잉크의 띠를 백묵에 두르는 경우를 우리는 loading이라고 표현합니다.
여기서 백묵은 고정상이 됩니다.
잉크를 loading한 백묵을 물이 담긴 샤렛에 살짝 올려놓으면 백묵을 따라 물이 올라갑니다.(전개) 이때 물이 이동상, 즉 님이 질문한 전개용매가 됩니다.
물이 백묵의 끝부분에 다다를 때쯤 샤렛에서 백묵을 꺼내어 물이 마르기 전에(아주 빠름) 물이 올라간 부분을 표시를 합니다.
이때 잉크 띠가 처음 loading된 위치를 기준선으로 하여, 전개가 끝난 후 잉크 띠가 이동하여 위치한 선까지의 거리를 B, 용매인 물이 이동한 거리를 A라고 하면
Rf = B/A입니다.
우리는 처음 물질을 고정상에 싣는 것을 GC나 HPLC에서는 loading, TLC에서는 spotting 또는 loading이라는 표현을 씁니다.
- TLC, GC, HPLC
이 것들의 모든 기본 원리는 님이 중고교에서 행한 백묵에 의한 잉크성분을 분리하기 위한 컬럼크로마토그래피와 같습니다.
크로마토그래피는 님이 분리와 정제 실험을 많이 하면 할수록 수많은 이름을 접하게 됩니다.
님은 약자로 된 기법의 full name만을 기억하시고, 방법은 대학원에서 전공으로 하시거나 실험 중에 보조수단으로 사용시면 됩니다. 당연히 많은 노력과 시간이 필요하겠지요.
# TLC (thin layer chromatography ; 박층 크로마토그래피)
고정상의 흡착제를 얇은 유리, 알류미늄, 프리스틱판에 발라놓고 용매를 전개제로 사용하는 방법입니다.
(1) 고정상 : 주로 사용되는 흡착제(absorbent)로는 범용적으로 제일 많이 쓰이는 것이 실리카겔이고, 그 다음이 알루미나, 드물게 셀룰로오스가 쓰입니다. 이 설명은 범용적으로 쓰일 때의 순서이고, 취급하고자 하는 물질의 성질에 따라 다릅니다.
(2) 이동상 : 전개제(developer)라고도 부르며, 전개용매라고 흔히 부릅니다. 보통 극성용매와 비극성용매를 적절한 비율로 혼합하여 사용합니다.
전개용매는 초기 경험자는 교재나 문헌 등을 찾아 결정하고, 많은 실험을 거치면 경험적으로 용매의 종류와 혼합비율을 찾을 수 있습니다.
(3) Detect : 대부분의 분리하고자 하는 물질은 발색단을 지니고 있지 않아 육안으로 이동한 위치를 찾기가 불가능합니다.
그러므로 보통 UV 단파장과 장파장(두 파장이 같이 장착된 램프를 구입)으로 이동된 spot을 확인하고 iodine 증기가 포화된 chamber에 집어넣어 확인합니다.
UV lamp는 형광을 띄는 것으로 판단하며,
Iodine은 포화 탄화수소와 alkyl halide를 제외한 거의 모든 유기물과 complex를 이루어 갈색을 나타냅니다. 이외에 범용으로 anisaldehyde를 사용합니다.
특수한 경우는 카르보닐기(ketone, aldehyde)가 있는 화합물을 detect 하기 위한 2,4-dinitrophenylhydrazine, amine기가 있는 화합물을 위한 ninhydrin이 사용되기도 합니다.
# GC (gas chromatography ; 기체 크로마토그래피)
(1) 고정상 : 고정상이 완전 고체이냐, 비활성 고체의 표면에 고정시킨 액체냐에 따라 GSC(기체-고체 크로마토그래피)와 GLC(기체-액체 크로마토그래피)로 분류하나 거의 GLC를 사용하며, 일반적으로 GC라 하면 GLC를 의미합니다. 고정상은 긴 capillary tube에 충진되어 사용되며, column이라고 부릅니다. 특수한 경우에는 충진을 하여 사용하지만 충진이 어렵기 때문에 기기회사에서 제작하여 판매하는 컬럼을 씁니다.
(2) 이동상 : He, 질소, 수소와 같은 비활성 기체를 사용한다.
GC에서 이동상은 분리하고자 하는 물질과 상호작용을 하지 않으며, 관을 통하여 이 분자들을 이동시키는 기능만을 합니다. TLC와 같이 Rf의 개념이 도입되지만 거리데신 시간으로 표현됩니다.
(3) Detect : GC에서는 시료를 기체의 상태로 넣어줍니다. 그러므로 시료 주입구는 고온으로 유지되며, 고정상이 충진된 컬럼은 오븐 속에서 실험자가 설정한 온도를 유지하여야 하고, 이동상은 상압 이상으로 실험자가 설정한 유속으로 유지되어야 합니다. 현재 판매되고 있는 대부분의 GC는 이것들의 조절이 콘트롤판넬에서 컴퓨터에 의해서 이루어집니다.
문제는 기화된 기체를 컬럼 출구에서 어떻게 확인하느냐는 것입니다.
GC는 분리보다는 정량분석을 위한 수단으로 주로 사용되기 때문에, 정확한 정량분석을 위해서는 정밀한 detecter가 필요하고 많은 종류의 detecter가 개발되었습니다.
. FID (flame ionization detector ; 불꽃 이온화 검출기) : GC에서 가장 널리 사용되고 있으며, 일반적으로 응용되고 있는 검출기입니다. 컬럼에서 나온 분리된 물질을 연소하여 전기를 운반할 수 있는 전자와 이온들을 만든 후 전류를 흘려주어, 흐르는 전류를 측정하는 방법입니다.
. TCD (thermal conductivity detector ; 열전도도 검출기)
컬럼에서 나온 분리된 물질이 이동상으로 사용된 불활성 기체에 존재함으로서 생기는 열전도도 변화를 측정하는 것입니다.
. 그 외에
SCD (sulfur chemiluminescence detector ; 황 화학발광 검출기)
ECD (electron capture detector ; 전자포착 검출기)
AED (atomic emission detector ; 원자방출 검출기)
TID (thermionic detector ; 열이온 검출기)
FPD (flame photometric detector ; 불꽃 광도법 검출기)
# HPLC (high performance liquid chromatography ; 고성능 액체 크로마토그래피)
이 기법은 detecter의 감도가 좋고, 정량분석이 쉽고, 비휘발성 물질이나 열에 불안정한 물질을 쉽게 분리할 수 잇기 때문에 가장 많이 사용하는 방법입니다.,
(1) 고정상 : 주로 길고 가는 유리관에 흡착제를 충진하여 사용합니다.
고정상이 무엇이냐에 따라 분배 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피로도 세분화됩니다.
(2) 이동상 : 이동상이 액체로 분리 효능을 높여주기 위하여 고압으로 전개용매를 컬럼에 흘려줍니다.
용매를 사용하는 기법에 따라, 일정한 조성의 단일 용매를 사용하여 분리하면 isocratic elution (등용매 용리), 극성이 아주 다른 두 세 가지 용매를 사용하여 분리하면 gradient elution(기울기 용리)로 분류되기도 합니다.
HPLC에서는 액체를 고압으로 흘려주기 위하여 수백기압의 pumping을 할 수 있는 펌프가 꼭 있어야 합니다.
GC와 마찬가지로 컬럼은 일정 온도를 유지해 주어야 하고, 전개용매도 일정 유량으로 흘려주어야 합니다.
(3) Detect : 현재는 GC처럼 다양한 검출기가 개발되지 않았습니다.
보통 이동상으로 사용된 용액에 분리할 물질이 있을 경우 용액의 굴절률이나 밀도, 유전상수의 변화가 있으며 이를 검출하는 방법과, 분리하고자 하는 물질이 지닌 UV 흡수, 형광 등의 성질을 이용하여 검출하는 방법이 있습니다.
- TLC의 종류가 4개
질문이 잘못된 것 같습니다.
보통의 질문은 이동상이 액체인 크로마토그래피를 4가지로 분류하기도 하는데, 이도 분류하는 사람에 따라 조금씩 다릅니다.
partition chromatography ; 분배 크로마토그래피
ion chromatography ; 이온 크로마토그래피
adsorption chromatography ; 흡착 크로마토그래피
size-exclusion chromatography ; gel permeation(겔 투과), gel filtration