고성능(압력) 액체크로마토그래피

[jonjon]

화합물 중에는 충분히 휘발하지 못하는 물질이나 컬럼을 통과할 수 없는 물질, 그리고 물질이 분리조건하에서 열적으로 불안정하거나 열적 분해를 일으키는 물질이 많기 때문에 기체 크로마토그래피에 의한 분리는 약 20%에 지나지 않는다. 고성능 액체 크로마토그래피는 시료의 휘발성이나 열적 안정성에 제한받지 않고, 거대분자와 이온화학종, 불안정한 천연물질 고분자물질과 다른 큰 분자량을 가지는 다중 작용기의 다양한 화합물을 분리할 수 있다. 액체 크로마토그래피에서의 분리는 기체 크로마토그래피 이동상에서는 본질적으로 존재하지 않는 시료분자와 정지상 및 이동상 간에 독특한 상호작용에 의존한다. 액체 크로마토그래피는 정지상을 더욱 다양하게 제공함으로써 이들의 선택적 상호작용에 큰 다양성을 주어 분리 가능성을 더 높여 준 것이다.

액체 크로마토그래피의 이동상

액체 크로마토그래피 분석에서 성공적인 분리 여부는 주어진 시료에 대해 적당한 컬럼과 최적의 이동상을 선택하는 데 달려 있다. 이동상의 선택시 용매의 물리적 성질, 시료 분자와의 화학적 작용 및 극성 등을 고려해야 한다.

1. 물리적 성질 : 이동상으로서 갖추어야 할 조건은 용매가 사용하려는 검출기에 적당하여야 하고, 사용하는 데 큰 위험이 없어야 하고, 불순물을 최대한으로 제거한 순수한 것이어야 한다. 또한 시료와의 반응성이 없어야 하고, 점도가 크지 않아야 한다.

2. 시료 분자와의 상호작용 : 시료 분자와 용매간의 주된 상호작용은 분산, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 수소결합 및 시료와의 전기적 상호작용 등이다. 분산 상호작용은 인접한 분자사이에는 항상 있을 수 있는 것으로 시료분자가 순간적으로 쌍극자 모멘트를 가지게 되면 인접한 용매 분자의 전자를 밀어 내어 용매분자에 쌍극자를 유도하고 결과적으로 두 분자는 전기적인 인력을 가지게 된다.

3. 용매세기와 극성 : 분산, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 수소결합, 전기적 상호작용등은 복합적인 작용들 이며, 그 복합적 작용이 클수록 시료 분자와 용매간의 인력이 크다. 시료와 용매가 위의 네가지 힘에 의해 상호 작용을 할 수 있는 능력을 통틀어서 극성(polarity)이라 부른다. 극성이 강한 용매는 극성이 강한 시료에 대해 인력이 크고 잘 용해시키므로, 정상 액체 크로마토그래피에서는 극성이 클수록 용매의 세기가 크고, 역상 액체 크로마토그래피에서는 반대로 극성이 큰 용매 일수록 용매의 세기가 작다.

4. 용리법(Elution) : 크로마토그래피 실험조작에 있어서 이동상을 흘려주는 방법 중 가장 많이 이용되는 것은 용리법(elution)이다. 용리법은 혼합성분의 각각의 분리 및 분석이 가능한 조작법이다. 이 방법의 특징은 정지상이 이미 이동상으로 포화된 상태에서 시료를 소량 주입하고 이동상을 흘려주면 시료가 두상에 대해서 상호작용으로 인해 일정한 분리 계수를 갖게 되어 상호 분리가 된다. 이 방법에서는 흘려주는 이동상을 용매 혹은 용리액(elution)이라고 부르며, 분리관을 통해 나온 용액을 용출액(eluate or effluent)이라고 부른다.

5. 등용매 용리(Isocratic Elution) : 등용매 용리에서는 시료가 주어진 컬럼에 주입되고 시료성분들이 컬럼으로부터 용출되는 데 걸리는 시간 동안 이동상이 변화되지 않는다. 어떤 단일 등용매 용리도 좋은 검출감도로써 합리적인 시간 안에 적절한 분리능으로 복잡한 혼합물을 분리할 수 없게 된다. 값이 광범위하게 변하는 시료의 등용매 분리는 일찍 용리되는 피크의 분리능은 나쁘고, 나중에 용리되는 피크의 검출은 곤란하게 하며, 불필요하게 긴 용리시간을 필요로 한다. 인력이 약하거나 강한 물질을 모두 포함하는 시료를 적절히 다루기 위해서는 개개의 피크 이동속도가 용매 프로그래밍에 의하여 크로마토그래피 실험 도중에 변경되어야만 한다.

6. 기울기 용리(Gradient Elution) : 기울기 용리라고 불리는 용매 프로그램은 용출과정에서 단계적 혹은 연속적으로 이동상의 조성을 변화시킨다. 보통 모든 시료 성분들이 초기에는 컬럼의 상부에 머무른다. 기울기 용리가 시작되면 이동상의 용리액 세기는 증가한다. 결국 제일 먼저 용출되는 성분의 값이 충분히 작아져서 그 성분이 컬럼 밖으로 나올 때까지 이동은 더욱 더 빨라지게 된다. 같은 형태가 다음에 용출되는 성분에 대해서도 반복되고 나머지 성분에 대해서도 같은 형태의 이동이 뒤따르게 된다. 등용매 용리와 비교할 때에 기울기 용리는 좀 더 피크 나비들이 동등해지고 전체적인 분리를 더욱 신속하게 한다. 등용매 용리에 비하여 기울기 용리는 이것이 필요치 않은 시료에 대해서도 감도면에서 2배 이상의 증가를 달성할 수 있다. 등용매 용리에서 피크의 꼬리끌림현상이 있는 경우에, 시간에 따라 모든 용량 인자값이 감소하는 것은 피크의 앞 부분보다 더 작은 을 갖는 영역에서 피크의 꼬리가 연속적으로 이동함을 의미한다. 여기서 피크는 좁아지고 감도는 증가하게 된다. 그러므로 기울기 용리에서는 시료 내의 모든 용질에 대한 최대 분리능과 감도를 모두 다 얻을 수 있다.

7. 시료의 전처리 : 크로마토그래피는 어떤 시료든지 분리할 수 있는 것은 아니다. 컬럼의 종류에 따라 분리시료가 다르고 분리형태가 다르다. 따라서 컬럼에서 시료가 분리될 수 있도록 시료의 형태를 만들어 주어야 하는데 이 과정이 시료의 전처리이다. 시료 전처리시에는 분석하고자 하는 시료성분의 종류 및 포함되어 있는 시료의 양을 미리 알고, 성분이 포함되어 있는 matrix를 알고 있어야 한다. 시료 전처리 과정을 되도록 단순화시키고, 모든 시료는 여과하여 입자가 제거된 상태로 주입시킨다. 시료 전처리 방법에는 원심분리, 여과, 선택 침전, 액액 추출, 증류 및 고상 추출에 의한 방법 등이 있다.

액체 크로마토그래피의 시료주입장치와 컬럼

  시료주입장치와 컬럼은 크로마토그램에서 피크의 폭이 넓어지는 것을 최소화하기 위해서 간단해야 하고, 고압에서의 작동이 원활하고 시료나 용매와의 화학반응이 없고, 재현성을 가져야 한다.

1. 주사기 주입기(Syringe Injector) : 탄성경막(septum)을 이용하기 때문에 간단하고, 주로 1500psi보다 작은 압력에서만 사용한다. on-line 주입기는 가장 간단하며 시료를 컬럼에 직접 주입하며, 보통 1500psi 이상 압력에서 사용할 수 없으며 보통 20회 주입마다 격막을 교환해야 한다. stop-flow 주입기는 이동상의 흐름을 멈추고 시료를 주입하며 1500psi이상에서 사용이 가능하다.

2. 밸브 주입기(Valve Injector) : 액체 크로마토그래피에서 시료주입의 방법 중 가장 널리 사용하며, 필수적이고 중요한 부분이다. 5∼500ml의 시료 크기의 범위를 제공하며, 전형적인 시료 루프(sample loop)로 주입하고 시료의 정확성은 매우 높다.

3 펌프(Pump) : 이동상은 광범위한 유속과 압력으로 컬럼에 운반된다. 여러 종류의 유기 . 무기용제를 사용할 수 있도록 펌프, 밀폐기 및 모든 연결부분이 이동상에 대하여 화학적으로 내성이 있는 물질로 만들어져야 한다. 시스템에 펄스가 걸린다면 펄스 제동기가 필요하다. 용매로부터 생성된 공기나 다른 기체를 제거하기 위하여 기체 제거기가 필요하다. 펌프는 최소한 100atm(1500psi)까지 작동할 수 있어야만 한다. 그러나 400기압(6000psi)이 좀 더 바람직한 압력 한계이다. 많은 분석 컬럼에 대해서는 0.5∼2ml/min정도의 낮은 유속을 유지시키는 일이 필요하다. 내경이 아주 작은 컬럼은 분당 마이크로리터 정도로 낮은 흐름속도가 요구된다. 용매를 용이하게 바꿀 수 있는 일은 기울기 용리에서나 최적용매를 선정할 때에 중요한 사항이다. 펌프는 차지하는 부피가 작아야 한다. 왕복 피스톤 펌프(reciprocating piston pump)는 가장 널리 사용되는 펌프이며 값이 싸고 광범한 유속을 이용할 수 있다. 이들 펌프는 자동 조작용으로 사용되는 장치에서 특히 유용하다. 펌프의 작은 내부부피는 기울기 용리를 수행할 때와 용매 선정시에 용매를 신속하고 정확하게 교환할 수 있게 해준다. 왕복펌프의 단점으로는 피스톤의 전 . 후진 운동시 흐름펄스가 발생되기 때문에 펄스 제동기가 필요하게 된다. 그리고 주사기형 펌프(syringe pump)는 일정한 속도로 기계적으로 운전되는 피스톤에 의하여 발생되는 용매 변동을 통해서 작동한다. 250∼500ml 정도의 용매를 저장할 수 있으며, 펄스가 없어 안정한 유속을 얻을 수 있으며 기울기 용리에 적합하다. 용량이 작고 용매가 바뀔때는 불편한 단점이 있다. 그리고 일정 압력 펌프는 큰 피스톤을 통해서 운반된 기체 실린더로부터의 압력이 이동상을 운반한다. 이 시스템은 펄스가 없고 연속적인 펌프작동과 제조용 응용을 위한 높은 유속 등을 제공한다. 이 형태는 충진컬럼에 유용하지만 용매의 기울기 용리에는 불편하다.

4. 컬럼 : 컬럼은 두꺼운 벽과, 유리코팅을 한 금속관이나 스테인리스관으로 만들어졌으며 고압(680atm)과 이동상의 화학작용에 견딜 수 있어야 한다. 관의 내부는 매우 균일한 내경을 가지고 있다. 직선 컬럼이 선호되며 수직위치로 놓고 작동된다. 컬럼끝의 조임과 연결은 틈새 공간이 없도록 설계되어야 하고 충진물은 컬럼 끝에 끼워넣는 스테인리스강 혼합관에 의하여 보통 지지된다. 가장 일반적인 길이는 10-30cm이다. 배제 크로마토그래피에서는 컬럼 길이가 50 100cm이다. 컬럼내에서 사용되는 충진제의 크기는 보통 3-5마이크로미터이고 구형이나 여러 가지 모습의 형태가 있고 많이 이용되는 충진제는 다음과 같다.

액체 크로마토그래피의 검출기

액체 크로마토그래피용으로 민감한 만능 검출기가 아직까지 고안되어 있지 않다. 그러므로 분석에 알맞는 검출기를 선정하는 일이 필요하며, 다양한 분리를 수행하기 위해서는 하나 이상의 검출기가 필요할 수 있고, 몇 개의 검출기가 직렬로 배열될 수도 있다. 용질이 없는 이동상과 용질이 있는 이동상의 물리적 성질의 전체적 변화를 비교하는 굴절률 검출기(refractive index detector)는 비교적 검출이 민감하지 못하고, 매우 정밀한 온도 조절을 필요로 한다. 용질 성질 검출기는 순수한 이동상에는 보이지 않는 용질의 물리적 성질에 대하여 응답한다. 이들 검출기는 1000배나 그 이상으로 민감해서 10-1g이나 그 이하의 시료에 대해서도 검출신호를 보인다. 흡광도, 형광 및 전기화학적 검출기가 보편적이며 전치 컬럼과 후치 컬럼 유도체들에도 그들이 응용될 수 있다. 검출기의 응답시간 는 엄격하며 시간 단위로 적어도 피크 나비의 10배보다 작아야만 한다. 그런 경우만 피크 면적이 일그러지지 않는다. 0.3초 이하의 시간상수를 가진 검출기는 고효율의 작은 입자컬럼에 바람직하다. 사용 조건은 잡음이 적어야 하고, 유속, 온도, 압력에 안정해야 하고, 기울기 용리가 가능해야 한다. 신호 대 잡음비가 높고, 사용 목적에 따라 선택성이 있어야 한다.

1. 자외선-가시선 분광광도계(UV-vis. Spectrophotometer) : 광원에서 특정 파장의 장치를 거쳐 검출실의 시료에 투사되면 일부는 흡수되고 일부는 통과하게 되는데 특정한 시료는 특정 파장의 빛에 대한 흡광도가 높아서 시료를 투과하는 빛의 강도는 상대적으로 작아지게 된다. 총 투사량에서 투과량을 뺀 빛의 양이 흡광도로 표시되면서, 이 크기가 전기적 신호로 나타난다.

2. 형광 검출기(Fluorescence Detector) : 시료 분자 구조가 형광성을 띄거나 형광 유도체를 만들었을 때 이용하며, 시료에서 발광하는 빛의 양은 시료의 양(농도)에 비례한다. 발광량에 따른 전기적 신호의 크기가 정량의 척도가 된다. 여기필터(excitation filter)를 통과한 빛은 시료셀(sample cell)에 존재하고 있는 시료분자를 바닥상태에서 들뜬상태로 만들어 주고, 들뜬 상태의 분자가 바닥상태로 떨어지면서 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을방출하게 된다. 사용범위는 생화학, 의학, 약리학, 석유화학분야 등에 이르고 있고 일반적으로 UV검출기보다 100배∼1000배 선택성이 있다.

3. 굴절율 검출기(Refractive Index Detector) : 기준셀(reference cell)과 시료셀에 포함된 시료와 용매의 굴절률의 차이에 의하여 검출한다. 온도, 밀도, 청결상태에 영향을 받는다. 사용범위는 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용한다. 굴절률 차이에 의한 분석이므로 온도가 일정하고 기준셀과 시료셀이 잘 세척된 상태에서 측정해야 바탕선 안정화를 쉽게 이룰 수 있다.

4. 전기화학적(전류법) 검출기(Electrochemical Amperometric Detector) : 옴(ohm)의 3개 파라미터인 전위센서, 전도성, 전위일정 및 전류측정 중 마지막 파라미터인 전위일정 및 전류측정을 이용하여 전극 표면에서 산화 . 환원반응을 일으킨 후 반응시의 전류값을 측정한다. 산화 . 환원이 쉽게 일어나는 물질과 이온시료 분석 등에 많이 이용한다.

5. 전도도 검출기(Conductivity Detector) : 이온교환 크로마토그래피에서 양이온, 음이온 등 이온성 화합물 분석에 이용한다. 전해질의 이온들은 용액 전체를 통하여 전하(전류의 전도)를 운반한다. 열 에너지 때문에 용매 분자와 용매화된 이온들은 계속하여 충돌하므로 속도와 방향이 자주 변하면서 불규칙하게 움직인다. 전기장이 용액에 적용될 때에 이온들은 반대 전하를 띤 전극 쪽으로 끌려 간다. 전도도값은 온도에 따라 변하므로 온도가 일정해야 바탕선의 안정화를 쉽게 이룰 수 있다.