테트라스파닌 염색과 제타 전위 분석을 통한 엑소좀의 품질 평가

[With위드인스트루먼트]

테트라스파닌 염색과 제타 전위 분석을 통한 엑소좀의 품질평가

Authors: Dr. Sascha Raschke, Dr. Christina Klasen, Dr. Henry Dehne, Dr. Lena Ball,

Particle Metrix GmbH, Inning, Germany

개요

세포외소포(EV)가 연구를 위해 정제되거나, 생물 의학 표준으로 생산되거나, 특정 세포에서

안전하고 효과적인 치료제를 상용화될 때, 몇 가지 품질 속성이 보장되어야 합니다.

나노입자추적분석(NTA)은 단일 입자 수준에서 작동하기 때문에 EV 품질 관리에 매우 적합합니다.

그러나 형광(Fluorescence) 모드 분석이 아닌 산란(Scatter) 모드 기반 NTA를 통한 표면 분자의

구성이 다른 입자의 비율(성분이 다른 입자의 비율, Subpopulations)의 분석만으로는

정확하게 다른 입자들을 구분할 수 없습니다.

따라서, 이 연구에서는 HansaBiomed의 HEK293 EV를 과발현하는 CD63 e-GFP 샘플을

형광 기반 NTA(F-NTA, Fluorescence-NTA)로 특성화하여 총 입자 수 내에서 CD63 e-GFP

양성 비율을 명확하게 분석하였습니다. CD63 e-GFP 양성 EV의 50%보다 조금 더 검출할 수

있었기 때문에, 엑소좀 마커 CD9, CD63 및 CD81에 대한 항체를 기반으로 하는

Particle Metrix F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520을 사용하여 분석의 특이성을

더욱 높였습니다. 이 키트에서는 세 가지 표면 마커를 모두 동일한 형광체(PAN staining)와

결합하여 일반적인 엑소좀을 특이적으로 검출했습니다.

따라서, F-NTA 및 Subpopulations 기능을 통해 CD63 e-GFP 양성 입자의 하위 집단을

PAN staining된 엑소좀과 구별할 수 있었습니다.

자세히 설명하면, Zetaview® 기기에서 단일 측정 프로토콜을 사용하여

개별적으로 형광 표지된 EV 하위 집단의

크기 분포(Size Distribution) 농도 (Concentration)

이중염색분석 (Colocalization) 제타 전위 (Zeta potential)

를 분석하기 위해 심층적인 EV 특성화를 수행했습니다.

PAN 염색 결과 엑소좀이 매우 효율적으로 검출되었습니다. PAN 및 e-GFP로 이중 라벨링된

입자는 산란 기반 NTA로 평가한 전체 입자 집단(122.1nm)에 비해 더 작은 직경(105.8nm 및

92.1nm)을 보였고, 이중염색분석(Colocalization) 측정 결과 CD63 e-GFP 및 PAN 염색에

대해 양성 반응을 보인 입자가 45%인 것으로 나타났습니다. 또한, 두 형광 채널에서 검출된

엑소좀은 전체 입자 수(-24.2mV)에 비해 다른 제타 전위(-19.5mV)를 나타냈습니다.

Particle Metrix F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520을 사용하여 형광 표지된 엑소좀과

CD63 e-GFP 양성 EV 비율을 명확히 구별할 수 있었습니다.

제타 전위 분석의 경우, 특성화된 EV 표준의 콜로이드 안정성을 입증하는 추가적인 차별화 품질

마커를 제공하기 위해 PAN 엑소좀 테트라스파닌 염색이 필요한 것으로 밝혀졌습니다.

서론

세포외소포(EVs)는 엔도솜(Endosomes), 엑소좀(Exosome) 및 세포막 유래 미세 소포(Cell

membrane-derived microvesicles)를 포함하는 이질적인 막 결합 나노 입자 그룹입니다.

세포 간 통신에서 중요한 역할을 하기 때문에 다양한 질병에서 핵심 역할을 하는 것으로 입증되어

생물 의학 연구에서 점점 관심이 높아지고 있습니다.

그러나 약물 운반체로도 간주되므로 치료적 잠재력에 대해 집중적으로 연구되고 있습니다.

주로 미세 소포 및 세포 사멸체와 달리 크기가 30~150nm인 소형 EV에 속하는 EV의 하위분획인

엑소좀에 초점이 맞춰져 있습니다. 엑소좀이 연구용 또는 의료용(치료제)으로 사용되는 경우

정제된 입자의 품질과 양을 평가하는 것은 필수적입니다.

따라서 크기와 농도와 같은 생물물리학적 특성의 포괄적인 정량화는 EV의 특성화의 특성화 이후

엑소좀의 사용에 필수적인 요소입니다. 지난 10년 동안 나노입자추적분석(NTA)은 엑소좀과

세포외소포의 크기 및 농도 측정을 위한 가장 일반적인 방법이 되었습니다.

하지만, 과거의 NTA분석은 주로 산란 모드(Scatter mode)로 사용되었기 때문에 EV와 비슷한

크기의 단백질 응집체나 세포 파편(Cell debris)과 같은 다른 나노 입자를 구별할 수 없었습니다.

Particle Metrix GmbH(Germany, 독일)사의 ZetaView® 모델 PMX-130, PMX-230 및

PMX-430과 같은 더욱 발전된 NTA 장비는 고전적인 NTA 분석기로 단일 입자 수준에서의

EV 분석만을 하는 기능을 뛰어 넘어 형광 NTA 분석(F-NTA, Fluorescence Nano particle

Tracking Analysis)을 통해 항체로 염색된 개별 EV 하위 집단을 크기와 농도 측면에서 특성화할

수 있도록 기능이 확장되었습니다.

특정 형광 표지 항체로 염색된 EV를 분석할 수 있는 형광 염색 입자의 종류, 개수는 레이저 및

형광 필터 채널 개수를 늘림으로써 4 종류의 형광 입자까지 측정할 수 있습니다.

또한, Colocalization NTA(C-NTA)는 단 한 번의 측정으로 샘플 내에서 표현형이 다른 EV의

다양한 형광 신호를 신속하게 검출하여 생물학적으로 더욱 더 특정적인 정보를 제공합니다.

NTA 방법의 추가 확정 단계를 통해 결정할 수 있는 EV의 추가 물리적 특성 중 하나는 제타 전위

(ZP, Zeta Potential)라고 불리우는 표면 전하입니다. ZP는 현탁액에서 EV의 안정성과 무결성을

평가하기 위한 추가 요소로서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다.

EV의 제타 전위는 표면 화학에 의해 결정되므로 주로 지질 및 단백질 구성의 영향을 받습니다.

최소 ±30mV의 전하는 완전한 콜로이드 안정성을 나타냅니다. 따라서 제타 전위는 콜로이드

안정성을 연구하는 데 탁월한 도구이며 생물학적 과정에서 EV의 품질을 조사하는 유망한 방법입니다.

우리는 Particle Metrix F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520으로 모든 입자를 라벨링한 후

크기, 농도 및 제타 전위를 측정하여 HansaBiomed의 HEK293 EV standard(EV 표준 샘플)을

과발현하는 CD63 e-GFP의 종합적인 특성화를 수행했습니다.

F-NTA를 사용하여 입자의 하위 집단을 개별 형광 채널(Fluorescence Channer)과 산란 신호

(Scattering signal)를 통해 서로 명확하게 구별할 수 있었습니다.

제타 전위 분석에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. Colocalization 측정 결과 EV의 45%가

CD63 e-GFP와 PAN 엑소좀 염색의 다른 표면 마커 중 하나 이상에 대해 양성이었습니다.

이러한 결과를 통해 우리는 시료의 구성을 크기와 크기 분포를 정확하게 측정할 수 없고 단일 입자

수준에서 표면 전하를 분석하여 콜로이드 안정성에 대한 통찰력을 제공하지 않는 고전적인

유세포 분석법(Flow cytometery) 보다 훨씬 자세히 분석할 수 있었습니다.

실험 방법

사용된 세포외소포 :

이 연구에서는 HansaBiomed(#HBM-HEK-EGFP63)에서 제공한 HEK293 세포(CD63 e-GFP)

의 동결 건조 형광 EV를 사용했습니다. EV 100㎍을 초순수 증류수 100㎕로 재구성하여

추가 사용 시까지 제조업체의 관장 사항에 따라 보관했습니다.

형광 라벨링 :

형광 표지를 위해 Particle Metirx F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520을 사용했습니다.

용해된 EV 1㎕ 라벨링 키트에 제공된 지침에 따라 염색했습니다. 그러나 보다 정확한 제타 전위

측정을 위해 100% PBS 대신 10% PBS를 사용했습니다.

Detergent controls는 테트라스파닌 PAN 염색과 동일한 방식으로 준비했습니다.

그러나 배양 후, 표지 된 EV 10㎕ 분액에 1% NP-40 용액 10㎕을 보충하여 최종 농도가 0.5%

NP-40이 되도록 했습니다.

실온에서 30분 동안 암실 배양(Incubation)한 후, 각 시료에 980㎕ 10% PBS를 보충하여 최종

측정 부피가 1,000㎕가 되도록 하였습니다.

NTA, Colocalization 및 제타 전위 측정 :

크기 및 농도, Colocalization 및 제타 전위에 대한 NTA 측정은 ZetaNavigator 소프트웨어

버전 1.4.7.6, Particle Explorer 소프트웨어 버전 4.3.4.4 및 Particle Metrix Software Suite

(PMSS) 1.4가 설치된 Particle Metrix ZetaView® PMX-430 QUATT 기기를 사용하여

수행했습니다.

실험 결과

크기 및 농도 측정을 통한 EV 특성화

산란 모드에서 HEK293 CD63 e-GFP EV의 NTA 측정 결과 피크 직경은 122.1nm이고

총 농도는 ml당 5.4x10^10개 입자였습니다(그림 1A+B 참조). 크기와 농도 측면에서

EV 표현형을 구체적으로 특성화하기 위해 F-NTA를 통해 샘플을 분석했습니다.

488F500 채널에서 검촐된 CD63 e-GFP 양성 부분은 피크 직경이 105.8nm(그림 1A)이고

농도는 ml당 3x10^10개 입자였습니다(그림 1B). 이는 제조업체에서 제공한 농도와

잘 일치하며 산란 모드(Scatter mode)에서 총 입자 수에 대한 e-GFP 양성 입자의 비율이

54.2%에 해당합니다(그림 1C). 결과는 HansaBiomed에서 언급한 형광 입자 수율 40-60%

와 매우 일치합니다.

EV-전형적 표면 마커인 CD9, CD63 및 CD81을 사용한 테트라스파닌 PAN 염색은

520F550 형광 채널에서 분석되었으며 92.1nm의 피크 직경을 나타냈고(그림 1A) ml당

5.2x10^10개의 입자가 나타났습니다(그림 1B). 이는 e-GFP 양성 입자에 비해 상당히

높은 입자 수이며 산란 신호에 비해 95.2% 표지 된 EV에 해당됩니다(그림 1C). 이는 엑소좀

표준 샘플의 우수한 순도를 증명합니다. 일반적으로 형광 집단은 산란 모드에서 감지된 총

입자 집단보다 크기가 작았으며, 이를 통해 EV가 아닌 더 큰 입자가 존재했음을 예상할 수 있습니다.

그림 1A	e-GFP EV와 형광 테트라스파닌 PAN 염색된 EV의 피크 직경. 산란 모드에서 총 입자 수는 F-NTA보다 약간 더 큰 입자를 보여줍니다.
그림 1B	e-GFP 양성 EV 비율과 형광 테트라스파닌 PAN 염색에 양성인 EV의 입자 농도.
그림 1C	e-GFP 및 테트라스파닌 PAN 염색 EV의 크기 분포. e-GFP 및 PAN 염색 EV는 산란 신호에 비해 54.2%와 95.2%의 분율을 보입니다.

C-NTA를 통한 Colocalization 연구

CD63 e-GFP 및 PAN 염색 EV를 나타내는 입자 비율에 대한 더 자세한 분석을 위해

F-NTA에서 보다 발전된 기능인 C-NTA(Colocalization-NTA, 다중형광염색 나노입자

추적분석)를 통한 EV 특성화를 위한 추가 접근 분석을 수행했습니다.

이 연구는 CD63 e-GFP의 공존을 검출하고 다른 한편으로는 F-NTA EV Tetraspanin

Detection Kit 520으로 염색된 CD9, CD63 및 CD81을 검출하는 것을 뜻합니다.

총 828개 입자 수를 기준으로 C-NTA는 형광 EV의 45% CD63 e-GFP를 발현하며,

적어 CD9, CD63 또는 CD81은 양성 PAN 염색 신호로 발현하는 것으로 나타났습니다.

두 형광 채널을 개별적으로 살펴보면 46%와 9%가 각각 CD63 e-GFP와 테트라스파닌

PAN 염색에 대해 단일 양성인 것으로 나타낫습니다(그림 2).

그림 2	테트라스파닌으로 표지 된 HEK293 CD63 e-GFP EV의 Colocalization 분석 결과를 보여주는 원형 차트. 형광 입자의 45%는 e-GFP 및 PAN 염색에 대해 이중 양성으로 간주되는 반면, 46% 또는 9%는 각각 PAN 염색 또는 e-GFP에 대해 단일 양성으로 나타납니다.

제타 전위 분석을 통한 EV의 특성화

분리된 EV 샘플의 품질을 추가로 조사하기 위해 제타 전위 측정을 수행했습니다. EV의

콜로이드 분산과 같은 분산 시스템에서 제타 전위로 표시되는 나노 입자의 순 표면 전하는

치료적 접근 방식을 포함한 Downstream EV 응용 분야에 중요한 요소인 안정성을 결정

하는 데 중요한 매개변수입니다. 형광 표지 된 엑소좀의 전기 영동 이동성을 결정함으로써,

개별 형광 채널에서 감지된 두 하위 집단 모두에서 제타 전위가 -19.5mV인 것으로 나타

났습니다(그림 3). 반면, 산란 모드에서 전체 입자 집단은 -24.2mV의 상당히 낮은

제타 전위를 나타냈습니다. 이 결과는 F-NTA를 갤별 형광 채널에서 엑소좀의 제타 전위

측정과 함께 사용하면 산란 모드에서 검출된 총 입자 농도에서 CD63 e-GFP 양성 EV와

CD9, CD63 또는 CD81에 대해 양성 반응을 나타내는 테트라스파닌 PAN 염색 입자를

명확히 구별할 수 있음을 보여줍니다.

그림 3	두 형광 채널(488F500 및 520F550)에서 검출된 e-GFP 및 PAN 염색 양성 EV하위 집단과 산란 모드에서 분석된 샘플의 전체 입자의 제타 전위. 형광에서 실제 EV의 하위 분은 산란 모드에서 검출된 전체 입자 집단보다  상당히 높은 제타 전위를 보여줍니다.

요약 및 결론

크키 및 농도

Particle Metrix의 ZetaView® 모델을 사용한 나노입자추적분석은 특히 생의학 연구에서

형광 및 Colocalization 분석의 구현으로 상당한 도약을 이루었습니다. 이 기술적 발전 이후로

총 입자 수를 추정할 수 있는 단순한 산란광 측정의 한계는 더 이상 존재하지 않습니다.

이제 EV의 개별 하위 집단(Subpopulation)은 형광 염색 후 여러 형광 채널을 사용하여

구체적으로 분석할 수 있습니다. 전기 영동 이동성 분석을 통해 나노 입자의 제타 전위를

결정하는 기능과 결합하여 ZetaView®를 사용한 현재 나노 입자 분석을 크기, 농도, 표면 마커

스크리닝 및 콜로이드 안정성을 통한 EV의 포괄적 특성화에 완벽하게 적합합니다.

이 연구에서는 HansaBiomed의 상용 EV 표준을 사용하여 NTA를 사용하여 단일 입자

수준에서 엑소좀을 심층적으로 특성화했습니다. EV는 이미 CD63에서 e-GFP를 발현했기

때문에 488F500 형광 채널에서 54.2%의 분율로 Subpopulation을 명확하게 볼 수 있었습니다.

F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520(PAN 염색)으로 대조 염색하면 샘플 특성화

범위가 넓어지고 일반적인 테트라스파닌 마커인 CD9, CD63 및 CD81과 관련하여 입자의

표현형이 더욱 구체화되었습니다. 산란 신호에 비해 PAN 염색에 양성 반응을 보인 입자의

95.2% 비율은 520F550 형광 채널에서 두 번째 하위 집단으로 감지할 수 있었기 때문에 실제

엑소좀으로 간주할 수 있습니다. 따라서 F-NTA EV Tetraspanin Staining Kit 520은

EV 표준의 매우 높은 비율이 내재적 CD63 e-GFP 신호만으로는 감지할 수 없는 엑소좀으로

구성되어 있음을 보여주었습니다. CD9 및 CD81 양성 막 입자 외에도 F-NTA EV Tetraspanin

Detection Kit 520으로 표지하는 데는 아마도 e-GFP가 없어 형광 채널 488F500에서

검출할 수 없는 CD63 양성 엑소좀 염색도 포함되었을 가능성이 큽니다. 따라서 e-GFP 양성이

아닌 CD63 표면 분자도 검출하기 위해 F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520으로

PAN을 대조 염색하는 것이 정당화됩니다. 일반적으로 이러한 결과는 F-NTA를 통해 측정한

CD63 e-GFP 양성 입자의 백분율이 HansaBiomed에서 제공한 데이터(40%-60% CD63

e-GFP 양성)와 일치한다는 것을 보열줄 뿐만 아니라 CD9, CD63, CD81 PAN 염색을 사용된

샘플이 매우 높은 순도의 EV 표준이라는 증거를 제공합니다.

Colocalization

NTA 기술에서 비교적 새로운 성과는 Colocalization 측정(C-NTA)입니다. 기본적으로

C-NTA는 한 번의 실행으로 분석한 한 입자에 두 마커가 공존한다는 것을 증명하는 능력을

나타냅니다. Colocalization 이벤트는 두 가지 다른 형광 라벨을 지닌 입자가 특정 근접 범위

내에서 두 채널 모두에서 검출을 유도할 때 발생합니다. 이 연구에서 수행한 Colocalization

분석은 PAN 염색의 형광 신호로 감지할 수 있는 하나 이상의 추가 테트라스파닌 전형 마커를

지닌 CD63 e-GFP 양성 EV의 수에 따라 HansaBiomed의 EV 표준의 특성화 범위를 확장합니다.

이러한 실험은 막 표면의 분자 구성에 대한 정보를 제공하므로 표면 마커의 공존 측면에서

어떤 하위 집단이 존재하는지에 대한 추가 할당이 가능합니다. 형광 표지된 모든 EV 중 CD63

e-GFP와 CD9, CD63 및 CD81 PAN 염색에 대해 이중 양성인 45%를 검출할 수 있었습니다

(그림 2 참조). 세 가지 전형적인 EV 마커가 동일한 형광체에 결합되었기 때문에 F-NTA EV

Tetraspanin Detection Kit는 샘플에서 엑소좀을 특별히 검출하고 스크리닝하고 다른 비

EV 입자와 구별하도록 설계되었기 때문에 어떤 EV 하위 집단이 개별 마커를 가지고 있는지에

대한 보다 정확한 결과를 얻을 수 없습니다. 그러나 엑소좀 집단의 약 45%가 이미 CD63

e-GFP 양성이기 때문에 대부분의 Colocalization 이벤트는 테트라스파닌 EV PAN 염색에서

CD63 항체를 가지고 있는 입자에서 발생한다고 추정합니다(그림 2 참조).

제타 전위

세포외소포의 막(Membrane)은 EV와 세포외 환경의 상호 작용을 담당하는 매우 역동적이고

상호 작용적인 표면입니다. 따라서 세포 기원에 따라 EV의 제타 전위는 크게 다르며 지질,

단백질 및 탄수화물의 함량과 분포에 의해 결정됩니다. EV에서 검출된 대부분 음전하는

아스파르트산(Aspartate), 리신(lysine), 아르기닌(Arginine) 및 히스티딘(Histidine)과 같은

다양한 리간드(Ligand) 및 수용체의 곁사슬(Receptor)과 관련이 있는 것으로 추정됩니다.

488F500 및 520F550 형광 채널에서 -19.5mV의 제타 전위를 사용하여 실험적 접근 방식에서

실제 세포외소포를 표면 전하뿐만 아니라 산란 모드에서 검출된 전체 입자 집단(-24.2mV)과도

명확하게 구별할 수 있었습니다(그림 3). 일부 연구에서는 pH, 입자 농도, EV 분리 및 전반적인

콜로이드 안정성과 같은 보관 조건의 제타 전위 효과도 입증하였습니다.

이러한 매개변수는 EV 기반 의료 제품의 생산 정제 및 보관 중에도 고려해야 합니다. 일반적으로

±15mV의 제타 전위는 응집의 한계값으로 간주되는 반면, ±30mV는 콜로이드 시스템이 완전히

안정되는 한계값으로 간주됩니다. 15mV와 30mV 사이에서 시스템은 응집되거나 분산될 수

있습니다. 따라서 제타 전위 측정 결과는 EV 표준의 부분적으로 안정된 용액을 나타내며 명확한

경향은 분산됩니다. 또한 생물의학 분야에서 제타 전위의 변화를 측정하면 다양한 질병에서 세포

반응과 세포의 악성 변성을 위한 생리적 및 분자적 생물학적 마커로 사용할 수 있습니다[26, 27].

실험적으로 제타 전위는 사용된 용매의 pH, 염 함량 및 이온 강도에 크게 의존합니다[26, 28].

이와 관련된 것은 분산 매체의 전도도인데, 이는 EV 사이의 반발력을 변경하여 막의 이중층의

안정성에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 이는 분자 규모에서 작용하는 힘(예: 반데르발스 힘[28])

으로 인한 입자 간 상호 작용을 증가시켜 EV의 콜로이드 시스템의 안정성을 방해합니다.

비교 가능성과 재현성의 이유로 사용된 용매의 pH, 이온 강도 및 염 농도와 같은 매개변수에 대한

지식은 하위 집단에서 EV의 콜로이드 안정성을 평가하기 위해 항상 동일한 완충액을 사용해야

한다는 사실만큼 필수적입니다.

요약하자면, 이 연구에서는 단일 입자 수준에서 NTA를 통해 상업적으로 이용 가능한 EV 표준에

대한 포괄적인 특성화를 제시했습니다. Particle Metrix F-NTA EV Tetraspanin Detection

Kit 520은 각각의 형광 표지된 입자들의 크기와 농도를 조사하여 F-NTA를 통해 PAN 염색된

엑소좀과 CD63 e-GFP 양성 입자 비율을 명확하게 구분했습니다.

또한, F-NTA EV Tetraspanin Detection Kit 520을 사용하면 Colocalization NTA에서 막 표면의

분자 구성에 대한 보다 자세한 정보를 제공하는 데 도움이 되는 대조 염색 도구로 사용할 수 있으며,

따라서 표면 마커의 공존 측면에서 어떤 하위 집단이 존재하는지에 대한 추가 할당이 가능하다는

것을 보여주었습니다. PAN 테트라스파닌 염색은 또한 제타 전위 분석에 필요한 도구로 사용하여

콜로이드 안정성 평가 및 EV 특성화를 위한 추가 차별화 품질 마커를 얻을 수 있습니다. 따라서

특정 EV 마커를 사용한 면역 표지(Immunolabelling)는 단일 NTA 측정 스크립트를 사용하여

크기, 분포, 농도, Colocalization 및 제타 전위에 대해 EV의 우수한 품질의 분석을 제공할 수 있습니다.

보충 자료

Detergent Control

e-GFP를 사용한 형광 염색과 EV membrane에서 Tetraspanin PAN staining이 F-NTA

측정에서 실제 EV를 식별했는지 확인하기 위해 0.5% NP-40 용액으로 세제 용해(Detergent

lysis)를 수행했습니다. 세제 용해 후 실제 EV와 관련된 형광 신호가 사라질 것으로 예상했습니다.

그림 4	0.5% NP-40 처리 후 e-GFP 및 테트라스파닌 PAN 염색 EV의 상당한 감소.

그림 4에 볼 수 있듯이, NP-40 처리 결과 e-GFP와 테트라스파닌 PAN 염색 EV가 각각 11.4%와

25.8%로 상당히 감소했습니다. 이는 산란 모드에서 검출된 총 입자 농도가 57.8%로 감소하여

실제 막 엑소좀이 파괴되었음을 나타냅니다.

NTA 이전의 스필 오버 제어

사용된 두 형광염색체 모두 두 개의 인접한 형광 채널(488F500의 e-GFP, 520F550의 테트라스파닌

PAN 염색)에서 검출 가능하므로 다른 형광 채널로 스필 오버가 없는지 테스트했습니다. 이를 위해

CD63 e-GFP가 없지만 테트라스파닌 PAN 염색으로 표지된 HCT116 EV와 CD63 e-GFP HEK293

EV를 두 형광 채널에서 분석했습니다(그림 5).

그림 5	488F500 및 520F550 형광 채널에서 사용된 형광체의 과잉은 감지되지 않았습니다.

Tetraspanin PAN 염색 HCT116 EV는 488F500 형광 채널에서 신호를 보이지 않았습니다.

또한 HEK293-CD63 e-GFP EV의 e-GFP 신호가 520F550 채널에서 감지되지 않는다는

것을 입증할 수 있었습니다.

표 1: 형광, Colocalization 및 산란 측정에 사용되는 측정 사양(MS) 1-4.

표 2: 형광 및 산란 모드에서 제타 전위 측정에 사용되는 측정 사양(MS) 5-7.

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