아미트라즈에 노출된 여왕들... 꿀벌의 짝짓기 빈도 증가

[우성(旴成) 평택]

Elevated Mating Frequency in Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) Queens Exposed to the Miticide Amitraz During Development

꿀벌의 짝짓기 빈도 증가(수모충: 아편대) 개발 중 미토살 아미트라즈에 노출된 여왕들

Most honey bee (Apis mellifera Linnaeus, 1758) (Hymenoptera: Apidae) colonies in the United States have been exposed to the beekeeper-applied miticides amitraz, coumaphos, and tau-fluvalinate. Colonies are also often exposed to agrochemicals, which bees encounter on foraging trips. These and other lipophilic pesticides bind to the beeswax matrix of comb, exposing developing bees. We explored whether queen-rearing beeswax containing pesticides affects the reproductive health of mated queens. We predicted that queens reared in pesticide-free beeswax would have higher mating frequencies and sperm viability of stored sperm compared with queens reared in wax containing pesticides. Mating frequency and sperm viability are two traditional measurements associated with queen reproductive health. To test these hypotheses, we reared queens in beeswax-coated cups that were pesticide free or contained field-relevant concentrations of 1) amitraz, 2) a combination of tau-fluvalinate and coumaphos, or 3) a combination of the agrochemicals chlorothalonil and chlorpyrifos. We then collected queens once they mated to determine sperm viability, using a dual fluorescent cell counter, and mating frequency, genotyping immature worker offspring at eight polymorphic microsatellite loci. Sperm viability did not differ between control queens and those reared in pesticide-laden wax. However, queens exposed to amitraz during development exhibited higher mating frequency than queens reared in pesticide-free beeswax or beeswax containing the other pesticide combinations. Our results suggest that miticide exposure during development affects queen mating frequency but not sperm viability, at least in newly mated queens. This finding, which has practical implications for commercial queen rearing and overall colony health, calls for further study.

미국의 대부분의 꿀벌(Apis melifera Linnaeus, 1758) 군락은 양봉업자가 적용한 진정제 아미트라즈, 쿠마포, 타우 플루발산에 노출되어 있다. 군락은 또한 벌들이 먹이를 구하는 여행에서 마주치는 농약에 자주 노출된다.

이 살충제들과 다른 지방질 살충제들은 밀랍의 빗줄기와 결합하여 성장하는 벌들을 노출시킨다.

살충제가 함유된 여왕 사육 밀랍이 짝짓기 여왕의 생식 건강에 영향을 미치는지 조사했다.

무농약 밀랍으로 사육된 여왕은 농약을 함유한 왁스로 사육된 여왕에 비해 저장된 정자의 짝짓기 빈도와 정자 생존력이 더 높을 것으로 예측했다. 짝짓기 빈도와 정자 생존 가능성은 여왕의 생식 건강과 관련된 두 가지 전통적인 측정치이다.

이러한 가설을 테스트하기 위해, 우리는 1) 아미트라즈, 2) 타우 플루오린산과 쿠마포의 조합, 3) 농약 클로로탈로닐과 클로르피리포스의 조합의 현장 관련 농도를 함유한 밀랍 코팅 컵에서 여왕을 길렀다.

그런 다음 이중 형광 세포 카운터를 사용하여 정자 생존 가능성을 결정하기 위해 짝짓기를 한 후 여왕을 수집하여 8개의 다형성 미세 위성 위치에서 미성숙한 작업자 자손을 유전자형으로 분류했다. 정자생존성은 대조군 여왕과 농약이 풍부한 왁스에서 사육된 여왕 사이에서 차이가 없었다.

그러나 개발 중에 아미트라즈에 노출된 여왕은 무농약 밀랍이나 다른 농약 조합을 포함한 밀랍에서 사육된 여왕보다 더 높은 짝짓기 빈도를 보였다. 우리의 결과는 적어도 새로 짝짓기를 한 여왕의 경우 발달 중 진정제 노출이 여왕 짝짓기 빈도에 영향을 미치지만 정자 생존력에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 상업적 여왕의 사육과 전반적인 군체 건강에 실질적인 영향을 미치는 이 발견은 더 많은 연구가 필요하다.

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A landmark survey of commercial beekeeping operations in North America found that nearly all of the 250+ colonies sampled exhibited beeswax that was contaminated with pesticides, some at alarmingly high concentrations (Mullin et al. 2010). Among the 10 pesticides found in highest frequency and abundance were the miticides tau-fluvalinate, coumaphos, and amitraz, which were found in 98.1, 98.1, and 60.5 of sampled colonies, respectively (Mullin et al. 2010). Almost a decade later, Ostiguy et al. (2019) obtained similar results after conducting pesticide residue analysis of colonies from six apiaries in different parts of the United States, with coumaphos, fluvalinate, and amitraz products being among the highest detected pesticides in wax in the two different years that the study was conducted. Furthermore, the authors found many co-occurring pesticides in beeswax and pollen, including miticides, which creates the opportunity for many of these compounds to interact synergistically to cause sublethal effects to honey bees (Ostiguy et al. 2019). However, despite the real-world scenario of exposure, whereby bees commonly encounter several pesticides simultaneously, many studies have only examined the effects of individual pesticides in isolation from others. A relatively newer trend in the field of honey bee toxicology has been to examine pesticides that are commonly found in conjunction with each other to gain a more realistic view of pesticide exposure (Johnson et al. 2013a, Traynor et al. 2016), thereby taking hazard risks into consideration.

북미의 상업적 양봉업에 대한 획기적인 조사에 따르면 250개 이상의 군락 중 거의 모든 군락에서 농약에 오염된 밀랍이 나타났으며, 일부는 놀랄 정도로 높은 농도로 나타났다(Mullin et al. 2010).

농약이 가장 많이 검출된 10가지 살충제 중에는 완화제 타우 플루발산염, 쿠마포, 아미트라즈 등이 있는데, 이들은 각각 표본집단의 98.1, 98.1, 60.5에서 검출되었다(물린 외 2010). 거의 10년 후, Ostiguy 외 연구진(2019)은 미국 각지의 6개 APIaries에서 군집의 농약 잔류 분석을 수행한 후 유사한 결과를 얻었는데, 쿠마포, 플루발산, 아미트라즈 제품이 연구가 실시된 2년 동안 왁스 내 농약 검출량이 가장 높은 농약에 속했다.

게다가, 저자들은 밀랍과 꽃가루에서 많은 동시 발생 살충제를 발견했는데, 이 살충제들은 꿀벌에게 중범죄 효과를 일으키기 위해 시너지 작용을 하는 기회를 만든다(Ostiguy et al. 2019). 하지만, 벌들이 여러 살충제를 동시에 마주치는 실제 노출 시나리오에도 불구하고, 많은 연구들은 다른 것들과 격리된 채 개별 살충제의 영향만을 조사해왔다.

꿀벌 독성학 분야에서 비교적 새로운 경향은 농약 노출에 대한 보다 현실적인 관점을 얻기 위해 서로 함께 발견되는 농약을 검사하여 위험 위험을 고려하는 것이다(Johnson 등, 2013a, Traynor 등).

Beekeepers typically apply miticides directly to their colonies as a way to manage the ectoparasitic mite, Varroa destructor, which feeds on the fat bodies of developing and adult honey bees (Ramsey et al. 2019). Varroa mites are the leading drivers of colony mortality in the United States, causing death within 2 yr if infested colonies are left untreated (Guzmán-Novoa et al. 2010, Kulhanek et al. 2017, Steinhauer et al. 2018). In addition, the fungicide chlorothalonil and the insecticide chlorpyrifos, which are agricultural pesticides widely applied to cultivated crops, were found in 49.2 and 63.2% of the colonies sampled by Mullin et al. (2010), respectively. These highly lipophilic pesticides persist and accumulate in the beeswax comb over long periods of time, creating an opportunity for contaminated wax to deliver sublethal doses of multiple pesticides to developing and adult bees. Exposure can be through contact during development, or through consumption of contaminated brood food, or both (Wu et al. 2011). In general, colonies that are exposed to sublethal doses of these and other common bee-encountered pesticides cause delays in worker larval development and adult emergence, in addition to decreased longevity (Wu et al. 2011).

Pesticide contamination of commercial honey bee colonies has been correlated with high colony losses and major queen mortality events in the Eastern United States (Traynor et al. 2016). In particular, queens exposed to wax containing tau-fluvalinate and coumaphos during development are smaller and have shorter lifespans than nonexposed queens (Haarmann et al. 2002, Collins et al. 2004, Pettis et al. 2004). More recently, queens reared in wax-coated cups containing field-relevant concentrations of tau-fluvalinate, coumaphos, and amitraz were shown to attract smaller worker retinues and had lower egg-laying rates than queens reared in pesticide-free wax (Walsh et al. 2020). Additionally, queens that were exposed during development to wax containing either amitraz (Burley 2007) or a combination of tau-fluvalinate and coumaphos (Rangel and Tarpy 2015) had lower spermatozoa viability in their sperm storage organ (i.e., the spermatheca), compared with queens reared in pesticide-free beeswax. Despite these results, queens reared in wax containing a combination of tau-fluvalinate and coumaphos were not smaller in size compared with queens reared in pesticide-free wax, even though small body size has traditionally been considered a proxy for poor queen quality (Rangel and Tarpy 2015).

양봉가들은 일반적으로 성장 중인 꿀벌과 성충의 기름진 몸을 먹는 체외 기생충 진드기 바로아 파괴체를 관리하기 위한 방법으로 군집에 직접 진정제를 바른다(Ramsey et al. 2019).

바로아 진드기는 감염된 군체를 치료하지 않고 방치할 경우 2년 이내에 사망하는 미국에서 군체 사망의 주요 원인이다

(Guzman-Novoa et al. 2010, Kulhanek et al. 2017, Steinhauer et al. 2018).

이밖에 멀린 외 연구진(2010)이 표본 추출한 군락의 49.2%, 63.2%에서 재배작물에 널리 적용되는 농약인 살충제 클로로탈로닐과 살충제 클로로피리포스가 각각 검출됐다. 이러한 고유일성 살충제는 밀랍 빗에 오랜 시간 동안 지속되고 축적되어, 오염된 왁스가 개발 중인 벌과 성인 벌에게 여러 가지 살충제의 치사량을 전달할 수 있는 기회를 만든다.

노출은 개발 중 접촉, 오염된 먹이의 섭취 또는 둘 모두를 통해 이루어질 수 있다(Wu et al. 2011). 일반적으로 이러한 살충제와 다른 일반적인 꿀벌 농약의 치사량에 노출된 군집은 수명 감소 외에도 일벌의 애벌레 발달과 성체 출현을 지연시킨다(Wu et al. 2011).

상업용 꿀벌 군집의 살충제 오염은 미국 동부의 높은 군집 손실 및 주요 여왕 사망 사건과 관련이 있다(Traynor et al. 2016). 특히, 개발 중에 타우 플루발산과 쿠마포를 함유한 왁스에 피폭된 여왕은 비노출 여왕보다 작고 수명이 짧다(Haarmann et al. 2002, Collins et al). 2004년, 페티스 외 연구진 2004년) 보다 최근에는 현장 관련 타우 플루발산, 쿠마포, 아미트라즈 농도가 포함된 왁스 코팅 컵에서 사육된 여왕이 무농약 왁스로 사육된 여왕보다 더 작은 근로자 망막류를 유인하고 더 낮은 산란율을 보였다(Walsh et al. 2020).

또한 개발 중에 아미트라즈(Burley 2007)를 함유한 왁스에 노출되거나 타우 플루발산과 쿠마포(Rangel and Tarpy 2015)의 조합에 노출된 여왕은 무농약 밀랍에서 사육된 여왕에 비해 정자 저장 기관(즉, 정자)에서 정자 생존력이 낮았다. 이러한 결과에도 불구하고, 타우 플루발산과 쿠마포의 조합을 함유한 왁스로 사육된 여왕의 크기는 무농약 왁스로 사육된 여왕에 비해 작지 않았다.

개발 중 타우 플루발린, 쿠마포스, 아미트라즈에 노출된 성적으로 성숙한 드론은 미노출 드론(Fisher, Rangel 2018)에 비해 정자 생존력이 낮은 것으로 나타났다. 마찬가지로, 완화제에 국소적으로 (농약으로 외피를 닦아서) 또는 구강으로 (오염된 음식을 먹여서) 피폭된 성인 드론은 구걸하는 비노출 드론(Rinder et al. 1999, Burley 2007, Shoukry et al. 2013)에 비해 성적 성숙기에 도달하면 정자 생존력이 낮은 것으로 나타났다. 여왕에 의한 짝짓기 불량도 부분적으로 질이 떨어지는 드론과의 짝짓기 때문인지에 대한 의문이다.
Sexually mature drones exposed to tau-fluvalinate, coumaphos, and amitraz during development were shown to have lower spermatozoa viability compared with unexposed drones (Fisher and Rangel 2018). Likewise, adult drones that are exposed to miticides either topically (by brushing their exocuticle with the pesticide) or orally (by feeding them contaminated food) were also shown to have lower spermatozoa viability once they reached sexual maturity compared to unexposed drones (Rinderer et al. 1999, Burley 2007, Shoukry et al. 2013), which begs the question of whether poor mating by queens is in part due to mating with poor quality drones.

In addition to causing individual toxicities, agrochemicals such as fungicides can act synergistically with other pesticides, increasing the lethality of other miticides such as tau-fluvalinate and coumaphos (Johnson et al. 2010, 2013a,b; Sanchez-Bayo et al. 2016; Steinhauer et al. 2018). In particular, the fungicide chlorothalonil and the insecticide chlorpyrifos are often applied together in the United States via tank mixes to control pests and pathogens in agricultural crops. Tank mixing of these products is legal and has likely contributed to the application of ~4.75–6.5 million pounds of chlorpyrifos, and 10–11.5 million pounds of chlorothalonil per year in the United States between 2011 and 2017 in overlapping geographic regions (United States Geological Survey 2017). Both chlorothalonil and chlorpyrifos have combinatorial detrimental effects on honey bee health when mixed with other pesticides, sometimes by as much as doubling their lethality (Johnson et al. 2010, 2013a,b; Sanchez-Bayo et al. 2016). This may be due, at least in part, to the high synergistic tendencies of fungicides, which greatly increase pesticides’ hazard quotients when bees are exposed to combinations of other products (Sanchez-Bayo et al. 2016, Traynor et al. 2016). For instance, Zhu et al. (2014) found a nearly 30% decrease in survival of larvae after oral exposure to a combination of chlorothalonil and coumaphos, and up to a 71% decrease in survival after oral exposure to a combination of tau-fluvalinate and chlorpyrifos. Moreover, sexually mature drones that were reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos had significantly lower spermatozoa viability compared with unexposed drones (Fisher and Rangel 2018).

살충제와 같은 농화학 물질은 개별 독성을 유발할 뿐만 아니라 타우 플루발산염 및 쿠마포스와 같은 다른 완화제의 치사율을 증가시켜 다른 살충제와 시너지 작용을 할 수 있다(존슨 외 2010, 2013a,b; 산체스-바요 외 2016; 스타인하우어 외 2018).

특히 미국에서는 살충제 클로로탈로닐과 살충제 클로로피리포스가 탱크믹스를 통해 함께 도포되는 경우가 많아 농작물의 병해충과 병원균을 통제하고 있다.

이러한 제품들의 탱크 혼합은 합법적이며 2011년에서 2017년 사이에 미국에서 연간 약 4.75~650만 파운드의 클로로탈로닐과 10~1150만 파운드의 클로로탈로닐을 적용하는 데 기여했다(미국 지질조사 2017). 클로로탈로닐과 클로로피리포 모두 꿀벌의 건강에 조합적으로 해로운 영향을 미치며, 때로는 치사율이 두 배까지 증가하기도 한다(존슨 외 2010, 2013a,b; 산체스-바요 외 2016). 이는 부분적으로 꿀벌이 다른 제품의 조합에 노출될 때 살충제의 위험지수를 크게 증가시키는 살균제의 높은 시너지 효과 때문일 수 있다(Sanchez-Bayo et al. 2016, Traynor et al. 2016).

예를 들어, Zhu 외 연구진(2014)은 클로로탈로닐과 쿠마포의 조합에 경구 피폭된 후 유충의 생존율이 거의 30% 감소했고, 타우 플루발산과 클로르피리포스의 조합에 경구 피폭된 후 생존율이 최대 71% 감소했다는 것을 발견했다. 더욱이 클로로탈로닐과 클로로피리포스가 함유된 왁스에서 사육된 성숙한 드론은 미노출 드론(Fisher 및 Rangel 2018)에 비해 정조세포 생존력이 현저히 낮았다.

The ubiquitous presence of pesticides in comb is particularly troubling for the health and fitness of honey bee queens, which are typically produced by workers in special wax cells under two circumstances: during supersedure, when the workers replace the mother queen with a new, more vigorous queen, and during swarming, when a colony splits into a swarm colony headed by the mother queen while the remnant colony stays in the old nest and is headed by a new daughter queen (Winston 1987). Queen development from egg to adult takes approximately 16 d, after which a new queen emerges from her pupal cell to roam around the hive for several days until she begins to take orientation flights to learn the landmarks around the hive (Winston 1987). At 5–10 d post-emergence, the queen undertakes nuptial flights to drone congregation areas (DCAs), where thousands of drones gather for a chance to mate. Upon reaching a DCA, drones flock to the queen and mate with her in midflight. Queens typically return to their hives after mating with an average of 12–16 drones from nearby colonies (Tarpy et al. 2004), although hyperpolyandry, or extreme mating frequency by queens, has been shown to occur under certain circumstances (Delaplane et al. 2015, Withrow and Tarpy 2018). High genetic variability obtained through polyandry is considered a fitness gain for the colony, as it is associated with many advantages including greater resistance to pathogens (Seeley and Tarpy 2007), lower Varroa mite infestations (Delaplane et al. 2015), and higher colony productivity and better survival (Mattila and Seeley 2007). Furthermore, polyandry increases the queen’s attractiveness to caretaking workers (Tarpy 2003, Richard et al. 2007, Seeley and Tarpy 2007, Niño et al. 2012).

특히 꿀벌 여왕의 건강과 건강을 위해 어디서나 살충제의 존재는 문제가 되는데, 꿀벌 여왕은 특별한 밀랍 세포에서 생산된다: 대체 기간 동안, 일개미 여왕은 어미 여왕을 새롭고 더 왕성한 여왕으로 대체하고, 군집이 분열될 때. 어미 여왕이 이끄는 무리 군락은 남은 군락지가 오래된 둥지에 머무르고 새로운 딸 여왕이 이끌게 된다.

여왕이 알에서 성체로 성장하는 데는 약 16 d가 소요되며, 그 후 새로운 여왕이 번데기 세포에서 나와 벌집 주변의 랜드마크를 배우기 위해 오리엔테이션 비행을 시작할 때까지 며칠 동안 벌집 주변을 돌아다닌다.

출현 후 5~10일이 되면 여왕은 수천 마리의 드론이 짝짓기를 하기 위해 모이는 드론 집결지(DCA)로 결혼 비행을 한다. DCA에 도착하자마자 드론은 여왕에게 몰려가 비행 중 여왕과 짝짓기를 한다. 여왕벌은 보통 근처의 군락에서 평균 12~16마리의 드론과 짝짓기를 한 후 벌집으로 돌아온다.

2004년)는 여왕에 의한 극도의 짝짓기 빈도인 다항식이 특정 환경에서 발생하는 것으로 나타났다(Delaplane et al. 2015, Withrow and Tarpy 2018). 다원성을 통해 얻은 높은 유전적 다양성은 군체의 건강상의 이득으로 여겨지는데, 이는 병원체에 대한 내성이 더 크고(실리와 타피 2007), 바로아 진드기 감염이 더 낮으며(델라플레인 외 2015), 군체 생산성과 생존력이 더 높기 때문이다(매틸라와 실리 2007). 또한, 일부다원성은 여왕의 돌봄 종사자에 대한 매력을 증가시킨다(Tarpy 2003, Richard et al. 2007, Seley and Tarpy 2007, Ni뇨 et al. 2012).

After successful mating, a queen’s spermatheca can hold over 5 million spermatozoa collected from her drone mates, which she uses to fertilize 1,000–1,500 eggs that she lays every day throughout her 1- to 3-yr lifespan (Winston 1987). As the queen ages and uses up the sperm, each remaining spermatozoon has more space to uncoil and move longitudinally, albeit more slowly, than the spermatozoa in newly mated queens (Al-Lawati et al. 2009). If the spermatheca of a recently mated queen contains three million or fewer spermatozoa, that queen is considered to be poorly mated and is typically replaced by workers within weeks or months (Woyke 1962, Woyke et al. 1995, Cobey 2007). Interestingly, little is known about the effects of pesticide exposure during queen development on the number of drones that a queen mates with, or the viability of the spermatozoa that the queen stores in the spermatheca after mating.

In this study, we exposed queens during development to wax contaminated with field-relevant concentrations of tau-fluvalinate, coumaphos, amitraz, chlorpyrifos, and chlorothalonil. We then assessed the viability of spermatozoa in the adult queens’ spermathecae and inferred their offspring’s paternity to assess each queen’s mating frequency. We found that spermatozoa viability remained consistently high in all queen types, regardless of whether they were reared in pesticide-free or pesticide-laden beeswax. Surprisingly, however, we found that the observed and effective mating frequencies of queens reared in wax containing amitraz exceeded those of queens reared in miticide-free beeswax. Queens reared in beeswax contaminated with a combination of chlorothalonil and chlorpyrifos were not different from control queens in terms of the observed or effective mating frequency, however. Our findings could have major implications not only for queen health, but also for colony-level productivity, as intracolony genetic diversity can affect resistance to disease and may cause other health challenges in colonies managed by commercial beekeepers.

여왕개미의 정조세포는 짝짓기를 성공적으로 마친 후, 5백만 개 이상의 정조세포를 수용할 수 있으며, 여왕개미는 1년에서 3년 동안 매일 낳는 1,000~1,500개의 알을 수정하는데 사용한다(윈스턴 1987). 여왕이 나이를 먹고 정자를 다 사용함에 따라, 각각의 남아 있는 정자는 새로 짝짓기를 한 여왕의 정자보다 더 느리긴 하지만 더 많은 공간을 확보하고 세로 방향으로 움직인다.

2009년) 최근 짝짓기 한 여왕의 정조세포가 300만 개 이하의 정조세포를 포함하는 경우, 해당 여왕은 짝짓기가 잘 되지 않은 것으로 간주되며 일반적으로 몇 주 또는 몇 달 내에 근로자로 대체된다(Woyke 1962, Woyke et al. 1995, Cobey 2007). 흥미롭게도 여왕이 발달하는 동안 살충제 노출이 여왕이 짝짓기를 하는 드론의 수나 여왕이 짝짓기를 한 후 정조세포에 저장하는 정조세포의 생존 가능성에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 연구에서는 개발 중에 여왕을 현장 관련 타우 플루발산, 쿠마포, 아미트라즈, 클로르피리포스 및 클로로탈로닐 농도로 오염된 왁스에 노출시켰다.

그런 다음 성인 여왕의 정조세포에서 정조세포의 생존 가능성을 평가하고 각 여왕의 짝짓기 빈도를 평가하기 위해 자손의 친부를 추론했다.

무농약 밀랍이나 농약 밀랍에서 사육되는지 여부에 관계없이 모든 여왕 유형에서 정자 생존력이 지속적으로 높게 유지된다는 것을 발견했다. 그러나 놀랍게도 아미트라즈를 함유한 왁스에서 사육된 여왕의 관찰되고 효과적인 짝짓기 빈도가 무염소 밀랍에서 사육된 여왕의 짝짓기 빈도를 초과한다는 것을 발견했다.

클로로탈로닐과 클로르피리포의 조합에 오염된 밀랍에서 사육된 여왕벌은 관찰되거나 효과적인 짝짓기 빈도에서 대조군 여왕벌과 다르지 않았다. 우리의 발견은 군내 유전적 다양성이 질병에 대한 내성에 영향을 미칠 수 있고 상업적 양봉가들이 관리하는 군집의 다른 건강 문제를 야기할 수 있기 때문에 여왕의 건강뿐만 아니라 군체 수준의 생산성에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

Mean (± SEM) viability of spermatozoa in the spermathecae of mated queens reared in 2016 in Texas and Wisconsin, which belonged to one of four treatment groups. Queens were reared in plastic cups coated with molten beeswax that was either pesticide free (control group) or contained either (a) a combination of tau-fluvalinate and coumaphos, (b) amitraz alone, or (c) a combination of chlorothalonil and chlorpyrifos. Six queens were used per treatment group. See Materials and Methods for details on the queen-rearing process.2016년 텍사스와 위스콘신에서 양육된 짝짓기 여왕의 정조세포에서 정조세포의 평균(± SEM) 생존가능성은 4개의 치료 그룹 중 하나에 속했다. 여왕벌은 녹은 밀랍으로 코팅된 플라스틱 컵에서 길러졌는데, 이 밀랍은 (a) 타우 플루발산과 쿠마포스의 조합, (b) 아미트라즈만, (c) 클로로탈로닐과 클로르피리포스의 조합이 들어 있었다. 치료 그룹당 6마리의 여왕이 사용되었다. 퀸 양육 프로세스에 대한 자세한 내용은 재료 및 방법을 참조하십시오.

Observed Mating Frequency and Effective Paternity Frequency

We encountered a large range in primer amplification efficiency in the eight microsatellites we examined for paternity analysis in offspring from queens reared in Texas in 2017 (Table 1). For example, we obtained amplification sequences from 91% of the brood samples amplified at the Am052 locus, but only obtained amplification sequences from 40% of the brood samples amplified at the Am043 locus. Because of these inconsistencies in amplification success, brood samples that yielded amplification results from fewer than six microsatellites were excluded from the analysis.

관찰된 짝짓기 빈도 및 효과적인 친자 빈도
2017년 텍사스에서 양육된 여왕의 자손에서 친자 분석을 위해 조사한 8개의 미세 위성에서 프라이머 증폭 효율성의 광범위한 범위에 직면했다(표 1). 예를 들어 Am052 locus에서 증폭된 brood 샘플의 91%에서 증폭 시퀀스를 얻었지만 Am043 locus에서 증폭된 brood 샘플의 40%에서만 증폭 시퀀스를 얻었다. 증폭 성공에서 이러한 불일치로 인해 6개 미만의 마이크로 위성에서 증폭 결과를 산출한 브루드 샘플은 분석에서 제외되었다.

표 1.각 처리 그룹의 꿀벌 여왕에 대한 관찰되고 효과적인 짝짓기 빈도 추정치

Overall, we found a significant difference in observed mating frequency based on the queen-rearing treatment group (Table 1; χ 2 = 10.04, P = 0.02). In particular, queens reared in wax containing a combination of tau-fluvalinate and coumaphos had a significantly higher observed mating frequency than those reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos (Z-score = 2.17, P = 0.03). Queens reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos also had significantly lower observed mating frequencies than those reared in wax containing amitraz (Z-score = −2.34, P = 0.02). Observed mating frequency did not differ either between the brood from control queens and those reared in wax containing amitraz (Z-score = −1.66, P = 0.10) or between the brood from control queens and those reared in wax containing tau-fluvalinate and coumaphos (Z-score = 1.87, P = 0.06).

We found an overall significant difference in effective mating frequency based on the queen-rearing treatment group (χ 2 = 11.15, P = 0.01; Table 1). Unexpectedly, queens reared in amitraz-laden wax had significantly higher effective mating frequencies than queens reared in pesticide-free wax (Z-score = −2.79, P = 0.005) or those reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos (Z-score = −2.93, P = 0.0003). There were no differences in effective mating frequency between queens reared in wax containing tau-fluvalinate and coumaphos and either control queens (Z-score = 1.36, P = 0.17) or those reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos (Z-score = 1.68, P = 0.09), however. Lastly, queens reared in pesticide-free wax did not have significantly higher effective mating frequencies compared with those reared in wax containing chlorothalonil and chlorpyrifos (Z-score = −0.24, P = 0.81).

전체적으로 퀸 양육 치료 그룹에 따라 관찰된 짝짓기 빈도에서 유의미한 차이를 발견했다(표 1; ≤ 2 = 10.04, P = 0.02).

특히 타우 플루발산과 쿠마포스의 조합을 함유한 왁스에서 사육된 여왕은 클로로탈로닐과 클로르피리포스를 함유한 왁스에서 사육된 여왕보다 관찰된 짝짓기 빈도가 유의미하게 높았다(Z-score = 2.17, P = 0.03).

클로로탈로닐과 클로르피리포스를 함유한 왁스에서 자란 여왕은 아미트라즈를 함유한 왁스에서 자란 여왕보다 관찰된 짝짓기 빈도가 현저히 낮았다(Z-score = -2.34, P = 0.02). 관찰된 짝짓기 빈도는 대조군 퀸의 무리와 아미트라즈를 함유한 왁스(Z-점수 = -1.66, P = 0.10)에서 사육된 무리와 타우-플루엔산과 쿠마포를 함유한 왁스(Z-점수 = 1.87, P = 0.06)에서 사육된 무리에서 차이가 없었다.

여왕 양육 치료 그룹에 따라 유효 짝짓기 빈도에서 전체적으로 유의미한 차이를 발견했다(제2차 = 11.15, P = 0.01, 표 1). 의외로 아미트라즈 함유 왁스에서 사육된 여왕은 무농약 왁스(Z-점수 = -2.79, P = 0.005) 또는 클로로탈로닐 및 클로르피리포스를 함유한 왁스(Z-점수 = -2.93, P = 0.3)에서 사육된 여왕보다 유효 짝짓기 빈도가 상당히 높았다.

그러나 타우 플루발산과 쿠마포를 함유한 왁스에서 사육된 여왕과 대조군 여왕(Z-점수 = 1.36, P = 0.17) 또는 클로로탈로닐과 클로르피리포스를 함유한 왁스에서 사육된 여왕(Z-점수 = 1.68, P = 0.09) 사이에 효과적인 짝짓기 빈도에 차이가 없었다.

마지막으로 무농약 왁스로 사육된 여왕은 클로로탈로닐과 클로르피리포를 함유한 왁스로 사육된 여왕에 비해 유의미하게 높은 유효 짝짓기 빈도를 가지지 않았다(Z-score = -0.24, P = 0.81).

Discussion

In this study, we exposed developing honey bee queens to wax containing either a combination of the miticides tau-fluvalinate and coumaphos, the miticide amitraz alone, or a combination of the agrochemicals chlorothalonil and chlorpyrifos. Once those queens were sexually mature, we assessed their mating frequency and the viability of the spermatozoa stored in their spermathecae within a few weeks after mating. We chose to test these pesticides at those specific concentrations and combinations because of their ubiquity in the wax of colonies managed by commercial beekeeping operations across the United States (Mullin et al. 2010, Traynor et al. 2016, Ostiguy et al. 2019). We found no significant differences in spermatozoa viability between queens reared in pesticide-free wax and those reared in any of the pesticide treatment groups. Unexpectedly, however, queens reared in wax containing amitraz had significantly higher effective mating frequencies compared with queens reared in pesticide-free beeswax.

A similar study examining the effects of pesticide exposure on queen mating frequency found that queens reared in wax containing a combination of tau-fluvalinate and coumaphos mated with significantly more drones than queens reared in pesticide-free wax (Rangel and Tarpy 2015). The similar results of that study, which was conducted in North Carolina, and our study, done in Texas, support the conclusion that pesticide exposure in the wax matrix can affect the mating behavior of queens regardless of their rearing location. These studies differ somewhat in their findings regarding sperm viability, however. Rangel and Tarpy (2015) found that queens reared in pesticide-free wax had higher sperm viability than queens reared in wax containing tau-fluvalinate and coumaphos, which was not the case in our study. This discrepancy could be due to the different methods used to assess sperm viability, as a dual fluorescent microscope was used in Rangel and Tarpy (2015) and a Nexcelom cell counter was used in our study.

The reasons for our unexpected result of higher mating frequency in queens reared in amitraz-laden wax are still unknown. It is possible that queens reared in miticide-contaminated wax mate with more drones because they are compromised physiologically. Perhaps queens exposed to amitraz during development cannot fly at high speeds or altitudes, or are visually impaired (Liberti et al. 2019), both of which may allow more drones to successfully intercept and mate with those types of queens compared with queens reared in pesticide-free wax. Alternatively, queens reared in wax containing miticides may be physiologically unable to detect that they have collected enough semen from drones, and therefore they may take more, or longer, mating flights. Although the mechanisms by which honey bee queens regulate insemination volume is unknown, it has been hypothesized that queens use stretch receptors in their oviducts to provide negative feedback stimuli for further mating attempts, as in other insect systems (Ringo 1996, Richard et al. 2007). In the case of amitraz, this miticide may interfere with the queens’ stretch receptors or stretch receptor signaling pathways, potentially leading to queens taking more or longer mating flights, ultimately increasing their mating frequency.

본 연구에서 우리는 개발 중인 꿀벌 여왕을 진정제 타우 플루발산과 쿠마포스의 조합, 진정제 아미트라즈 단독 또는 농약인 클로로탈로닐과 클로르피리포스의 조합이 포함된 왁스에 노출시켰다.

일단 그 여왕들이 성적으로 성숙해지면, 우리는 그들의 짝짓기 빈도와 짝짓기 후 몇 주 안에 그들의 정자에 저장된 정조세포의 생존 가능성을 평가했다. 이러한 농약은 미국 전역의 상업적 양봉 사업장에 의해 관리되는 군락의 왁스에 편재하기 때문에 특정 농도와 조합에서 테스트하기로 결정했다(Mullin 등 2010, Traynor 등, Ostiguy 등 2019).

무농약 왁스로 사육된 여왕과 무농약 처리 그룹에서 사육된 여왕 사이의 정조 생존력에서 유의미한 차이를 발견하지 못했다. 그러나 의외로 아미트라즈를 함유한 밀랍으로 사육된 여왕은 무농약 밀랍으로 사육된 여왕에 비해 훨씬 더 효과적인 짝짓기 빈도가 높았다.

여왕의 짝짓기 빈도에 대한 농약 노출의 영향을 조사하는 유사한 연구는 여왕이 무농약 왁스에서 사육된 여왕보다 훨씬 더 많은 수의 드론과 짝짓기를 한 타우 플루발산과 쿠마포를 포함한 왁스에서 사육한 것을 발견했다(랑겔과 타피 2015).

노스캐롤라이나에서 수행된 이 연구의 유사한 결과와 텍사스에서 수행된 우리의 연구는 사육 위치와 관계없이 왁스 매트릭스의 농약 노출이 여왕의 짝짓기 행동에 영향을 미칠 수 있다는 결론을 뒷받침한다.

그러나 이 연구들은 정자 생존능력에 관한 발견에서 다소 차이가 있다. 랑겔과 타피(2015)는 무농약 왁스로 사육된 여왕이 타우 플루발산과 쿠마포를 함유한 왁스로 사육된 여왕보다 더 높은 정자 생존성을 가지고 있다는 것을 발견했는데, 이는 본 연구에서는 그렇지 않았다.

이러한 불일치는 이중 형광 현미경이 랑겔과 타피(2015)에 사용되었고 넥셀롬 세포 카운터가 연구에 사용되었기 때문에 정자 생존성을 평가하기 위해 사용된 다른 방법 때문일 수 있다.

아미트라즈가 가득한 왁스 속에서 사육된 여왕의 짝짓기 빈도가 더 높다는 예상치 못한 결과의 이유는 아직 밝혀지지 않았습니다. 여왕은 생리적 문제가 있기 때문에 더 많은 드론을 통해 살충제에 오염된 밀랍 교미를 키웠을 가능성이 있다.

개발 중에 아미트라즈에 노출된 여왕은 고속이나 고도에서 비행할 수 없거나 시각 장애가 있을 수 있다(리베르티 외. 2019). 두 가지 모두 무농약 왁스로 사육되는 여왕과 비교하여 더 많은 드론이 여왕을 성공적으로 요격하고 짝짓기를 할 수 있다.

또한, 진정제를 함유한 왁스로 사육된 여왕벌은 생리학적으로 드론으로부터 충분한 정액을 수집했다는 것을 감지할 수 없어 짝짓기 비행을 더 많이 하거나 더 오래 할 수 있다.

꿀벌 여왕이 수정량을 조절하는 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 여왕이 다른 곤충 시스템과 마찬가지로 추가적인 짝짓기 시도를 위한 부정적인 피드백 자극을 제공하기 위해 난관에 스트레치 수용체를 사용한다는 가설이 있다(Ringo 1996, Richard et al. 2007).

아미트라즈의 경우, 이 유사살인은 여왕의 스트레치 수용체 또는 스트레치 수용체 신호전달 경로를 방해하여 잠재적으로 여왕이 더 오래 짝짓기를 하게 하여 궁극적으로 짝짓기 빈도를 증가시킬 수 있다.

Higher queen mating frequency due to miticide exposure during development could also be a biological form of fitness compensation, in which less reproductively capable queens mate with more males so that they can still head healthy colonies. However, it is unclear whether queens can alter their mating number by regulating the number of mating flights or whether they can assess or control the volume of viable spermatozoa collected from their mates. Hayworth et al. (2009) attached weights to queens and found that heavier queens engaged in fewer mating flights and had lower mating frequencies than queens without weights attached, suggesting that queens alter the number and/or duration of their mating flights in response to energetic demands. More recently, however, Simone-Finstrom and Tarpy (2018) found that weighted queens did not display lower spermatozoa viability or lower effective mating frequencies. The authors speculated that their findings might have differed from those of Hayworth et al. (2009) because of differences in the placement of the weights on the queens’ thorax. Furthermore, Schlüns et al. (2005) suggested that the onset of oviposition, as opposed to taking additional mating flights, is governed by mating frequency rather than semen volume. However, other studies have reported that queens can take additional mating flights due to semen volume (Woyke 1962, Kocher et al. 2010), suggesting that spermatozoa volume can sometimes be correlated with other markers of queen quality such as pheromonal signatures or morphological measurements (Kocher et al. 2009, Delaney et al. 2011, Walsh et al. 2020). Interestingly, a study that included measurements from 29 queens found a negative correlation between mating flight duration and spermatozoa volume in the spermatheca, supporting the idea that queens continuously use cues about mating success in flight to adjust the duration of their mating flights (Koeniger and Koeniger 2007).

If miticides are harming the queen by interfering with signaling pathways for stretch receptor function, or are otherwise physiologically compromising queens, then other signaling pathways in the nervous system, brain circuitry, and/or reproductive system may also be affected by these pesticides. Additionally, it is unknown whether the higher effective mating frequencies that we found occurred, at least in part, because queens reared in amitraz-laden wax engaged in more or longer mating flights.

Comparing the reproductive behavior of queens exposed during development to ubiquitous agrochemicals may be a fruitful avenue of future research to further explain the findings from all the aforementioned studies. There is still much to discover about the noncorrelative relationships between honey bee queen mating flight behavior, effective mating frequency, semen volume, spermatozoa viability, and oviposition rate (Rueppell et al. 2008, Simone-Finstrom and Tarpy 2018), all of which affect queen reproductive quality and overall colony productivity.

Even though miticide exposure does not always equate with lower spermatozoa viability in mated queens, at least not when they are tested a few weeks after open mating (as was the case in this study), further research on the physiological and behavioral effects of these miticides on queen reproductive physiology is needed. In response to the low initiation rates of grafted larvae into beeswax-coated plastic cups, further studies may be more successful using alternative queen-rearing methods, such as dipping wax onto shaped dowel rods to produce experimental queen-rearing cups. Given that queens reared in wax containing amitraz also had lower egg-laying rates in a separate study (Walsh et al. 2020), research on the prolonged effects of miticide exposure during queen development on colony health deserves high priority in the research community and must be actively communicated to the beekeeping industry so that better pollinator management practices can be implemented, particularly in commercial queen-rearing operations.

발육 중 살충제 노출로 인한 여왕의 짝짓기 빈도가 높은 것도 생물학적 형태의 피트니스 보상이 될 수 있다. 그러나 여왕개미가 짝짓기 비행 횟수를 조절하여 짝짓기 횟수를 변경할 수 있는지, 짝짓기로부터 채취한 생존 가능한 정조류의 양을 측정하거나 조절할 수 있는지는 불분명하다.

헤이워스 외 연구진. (2009)는 퀸에게 체중을 부착했고 몸무게가 더 무거운 퀸이 체중을 부착하지 않은 퀸보다 더 적은 짝짓기 비행에 참여하고 짝짓기 빈도가 낮다는 것을 발견했으며, 이는 퀸이 에너지 수요에 따라 짝짓기 비행의 횟수 및/또는 기간을 변경한다는 것을 시사했다.

그러나 보다 최근에 Simone-Finstrom과 Tarpy(2018)는 가중치 퀸이 더 낮은 정조세포 생존력이나 더 낮은 유효 짝짓기 빈도를 나타내지 않는다는 것을 발견했다.

저자들은 그들의 발견이 헤이워스 등의 연구 결과와 다를 수 있다고 추측했다. (2009) 여왕 흉부에 가중치를 두는 위치의 차이 때문이다.

게다가 슐룬스 등은. (2005)는 추가적인 짝짓기 비행을 하는 것과 달리 난소의 시작은 정액 부피가 아닌 짝짓기 빈도에 의해 통제된다고 제안했다. 그러나 다른 연구에서는 여왕이 정액 부피 때문에 추가적인 짝짓기 비행을 할 수 있다고 보고(Woyke 1962, Kocher 등 2010)하여, 정액 부피가 페로몬 서명이나 형태학적 측정과 같은 여왕 품질의 다른 표지와 상관될 수 있음을 시사했다.

2009년, 델라니 외 2011년, 월시 외 2020년). 흥미롭게도, 29마리의 여왕의 측정을 포함한 연구는 짝짓기 비행 시간과 정조류 부피 사이의 음의 상관관계를 발견했는데, 이는 여왕이 짝짓기 비행 기간을 조절하기 위해 비행 중 짝짓기 성공 신호를 계속해서 사용한다는 생각을 뒷받침한다.

만약 살충제가 스트레치 수용체 기능을 위한 신호 전달 경로를 방해하여 여왕을 해친다면, 또는 다른 생리적으로 손상된 여왕은 신경계, 뇌 회로 및/또는 생식 시스템의 다른 신호 전달 경로도 이러한 살충제의 영향을 받을 수 있다.

게다가, 우리가 발견한 더 효과적인 짝짓기 빈도가 더 높은지 아닌지는 적어도 부분적으로는 여왕들이 아미트라즈가 가득한 왁스 안에서 짝짓기 비행을 더 많이 하거나 더 오래 했기 때문인지는 알려지지 않았습니다.

개발 중에 노출된 여왕의 생식 행동을 유비쿼터스 농화학 물질과 비교하는 것은 앞서 언급한 모든 연구의 발견을 더 설명하기 위한 미래 연구의 유익한 방법이 될 수 있다. 꿀벌 여왕의 짝짓기 비행 행동, 유효 짝짓기 빈도, 정액량, 정자생존성, 난소배치율(Rueppell et al. 2008, Simone-Finstrom and Tarpy 2018) 사이의 비상대적 관계에 대해서는 아직 밝혀낼 것이 많으며, 이 모든 것이 여왕의 생식 질과 전체 군집 생산성에 영향을 미친다.

비록 살충제 노출이 짝짓기 여왕의 낮은 정조생존성과 항상 일치하는 것은 아니지만, 적어도 짝짓기 몇 주 후에 시험될 때는(본 연구에서와 같이) 이러한 살충제가 여왕 생식 생리학에 미치는 생리학적, 행동적 영향에 대한 추가 연구가 필요하다.

밀랍으로 코팅된 플라스틱 컵에 접붙인 유충의 낮은 시작률에 대응하여, 실험적인 여왕 사육 컵을 만들기 위해 다월 막대에 왁스를 담그는 것과 같은 대체 여왕 사육 방법을 사용하여 추가 연구가 더 성공적일 수 있다.

아미트라즈를 함유한 왁스로 사육된 여왕이 별도의 연구에서 더 낮은 산란율을 보인다는 점을 고려하면(Walsh et al. 2020), 여왕 개발 중 감산제 노출이 군체 건강에 미치는 장기적인 영향에 대한 연구는 연구 커뮤니티에서 높은 우선 순위를 가질 자격이 있으며 더 나은 폴을 위해 양봉 산업에 적극적으로 전달되어야 한다.특히 상업적 퀸 양육 운영에서 라이너 관리 관행을 구현할 수 있다.

https://academic.oup.com/aesa/article/114/5/620/5998622

네이버 번역기를 이용해서 올립니다.

*drone(드론):숫벌

[꿀벌마을(대구최명도)]

살충제가 벌에 미치는 피해가 연구결과에 따르면
많은 문제점이 내포된 연구인것 같습니다
전세계 모든 농가가 살충제 피해을 벗어날수 있는 확고한 치료 방법이 절실 합니다