페리틴 나노입자 조성물 및 세포활성 조절방법 특허 내용

[루시엘]

US10786570B2 - Ferritin nanoparticle compositions and methods to modulate cell activity - Google Patents

US10786570B2 - Ferritin nanoparticle compositions and methods to modulate cell activity - Google Patents

페리틴 나노입자 조성물 및 세포 활성 조절 방법

요약
본 발명은 특정 세포 유형을 표적으로 하는 나노입자를 고주파를 이용하여 여기시킴으로써 세포 기능을 원격으로 제어하는 ​​방법 및 조성물을 제공한다. 나노입자는 표적 세포에 세포외적으로 적용되거나 세포내적으로 발현될 수 있다. 해당 세포 유형은 온도 감응 채널을 발현하며, 나노입자의 여기는 국소적인 온도 상승을 유발하고, 이는 세포 반응으로 변환된다. 이러한 세포 반응에는 예를 들어 하나 이상의 생리활성 단백질 생성을 유도하는 유전자 발현 증가가 포함될 수 있다. 이러한 단백질의 발현은 다양한 유전성 또는 후천성 질환이나 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 단백질 결핍과 관련된 모든 질환을 치료하는 일반적인 접근법을 제공한다.

설명
관련 출원 참조
본 출원은 2016년 5월 31일에 출원된 미국 특허 출원 제15/168,950호의 분할 출원이며, 이는 2014년 2월 18일에 출원된 미국 특허 출원 제14/239,427호의 계속 출원이고, 이는 2012년 8월 24일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2012/052391호의 미국 국내 단계 출원이며, 해당 국제 특허 출원은 2011년 8월 24일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제61/526,985호를 근거로 우선권을 주장하고 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서에 개시된 발명은 미국 국립보건원(NIH)의 NIH 보조금(RO1 GM095654호) 지원을 받아 개발되었다. 따라서 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 보유한다.

본 발명의 분야
본 발명은 특정 세포 유형을 표적으로 하는 나노입자를 여기시키기 위해 무선 주파수파를 사용하는 것을 기반으로 세포 기능을 원격으로 제어하는 ​​방법 및 조성물을 제공한다. 관심 있는 세포 유형은 온도에 민감한 채널을 나타내며, 나노입자의 여기는 국소적인 온도 상승을 유발하고, 이는 세포 반응으로 변환된다. 이러한 세포 반응에는 예를 들어 하나 이상의 생리 활성 단백질의 생성을 초래하는 유전자 발현의 증가가 포함될 수 있다. 이러한 단백질의 발현은 다양한 유전성 또는 후천성 질환이나 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 단백질 결핍과 관련된 모든 질병을 치료하기 위한 일반적인 접근법을 제공한다.
발명의 배경
특정 세포가 생리적 기능 및 특정 행동에 기여하는 방식을 분석하는 도구는 최근 몇 년 동안 발전해 왔다. 초기 연구에서는 전기적 및 화학적 병변을 사용하여 특정 영역의 뉴런과 섬유를 모두 제거했다. 이후 연구에서는 이식된 전극을 통한 직접 자극을 이용했지만, 활성화 정도의 차이, 영구적인 이식의 필요성, 조직 손상 등의 문제점이 있었습니다. 이러한 접근 방식의 대안으로, 최근에는 약물 유도 시스템을 이용하여 유전자 발현을 변화시키거나 이온 채널을 조절하여 세포 활동을 제어하는 ​​기술이 개발되었습니다(Lerchner et al., Neuron 54:35-49). 이온 채널은 양이온 또는 음이온의 선택적 통과를 허용함으로써 세포 내 이온 농도를 조절하고, 이는 세포 유형에 따라 세포 기능을 조절합니다. 이온 채널을 이용하는 방법은 여러 가지 장점이 있습니다. 이온 채널의 구조와 기능이 비교적 잘 알려져 있고, 활성화 시간이 빠르며, 포유류 및 비포유류 세포에 다양한 종류의 채널이 존재하여 세포 활동을 조절하는 최적의 방법을 찾는 데 활용될 수 있습니다. 이 접근법은 약물에 의해 활성화되는 채널을 유전자 변형하여 행동을 조절하는 방식으로 처음 검증되었지만, 리간드의 비가역적인 효과로 인해 효과가 나타나는 데 시간이 오래 걸렸습니다(수 시간에서 수일 소요). 최근, 광활성화 양이온인 비포유류 채널로돕신(ChR2) 유전자를 이용하여 청색광에 노출시켰을 때 분자적으로 정의된 뉴런을 신속하게 활성화하는 방법이 개발되었습니다(Boyden E S et al. 2005 Nat Neurosci 8: 1263-1268). 이 시스템은 해부학적 특이성과 시간적 제어를 제공하지만 몇 가지 한계점도 있습니다. 예를 들어, 활성화 방식이 두 가지 변형밖에 없어 조합 활성화 가능성이 제한적이며, 더욱 중요한 것은 생체 내 활성화를 위해서는 침습적이고 행동에 영향을 줄 수 있는 이식 장치를 통한 광섬유 광 전달이 필요하다는 점입니다.
본 발명은 특정 세포 유형을 표적으로 하는 나노입자를 여기시키기 위해 무선 주파수파를 사용하는 것을 기반으로 세포 기능을 원격으로 제어하는 ​​방법 및 조성물을 제공합니다. 본 발명은 나노입자 유도 회로 여기(NICE)를 이용하여, 예를 들어 이온 채널을 조절함으로써 특정 세포의 활성을 원격으로 비침습적으로 자극하는 방법을 제시합니다.

발명의 요약
본 발명은 나노입자 유도 회로 여기(NICE)를 활용하며, 이는 특정 세포의 활성을 원격으로 비침습적으로 자극하기 위해 개발된 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명은 특정 세포 유형을 표적으로 하는 나노입자를 여기시키기 위해 무선 주파수파를 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 해당 세포 유형은 온도에 민감한 채널을 나타내며, 나노입자의 여기는 국소적인 온도 상승을 유발하고, 이는 세포 반응으로 변환된다. 나노입자의 여기는 국소적인 온도 상승을 유발하고, 이는 예를 들어 유전자 발현 증가와 같은 세포 반응으로 변환된다. 이러한 유전자 발현 증가는 하나 이상의 생리활성 단백질의 생성을 초래할 수 있다. 이러한 단백질의 발현은 다양한 유전성 또는 후천성 질환이나 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 나노입자를 외부에서 적용하여 특정 세포 유형의 활성을 원격으로 자극하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) 특정 세포 유형에 선택적인 나노입자를 세포 집단에 투여하는 단계 및 (ii) 무선 주파수 자기장을 인가하여 나노입자를 원격으로 활성화하는 단계를 포함한다. 나노입자의 활성화는 특정 세포 유형의 활성을 자극한다.
또는, 세포를 유전적으로 조작하여 세포 내에서 나노입자를 합성하도록 할 수도 있다. 예를 들어, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 자연적으로 발생하는 철 나노입자를 형성하는 철 저장 단백질인 페리틴을 변형하여 페리틴 경쇄와 페리틴 중쇄가 유연한 연결 부위를 통해 융합된 페리틴 융합 단백질을 형성하도록 한다. 무선 주파수 자기장에 의한 철 코어의 가열은 TRPV1 채널을 열어 칼슘 유입을 유발하고, 프로인슐린 유전자 발현을 증가시켜 시험관 내에서 인슐린 분비를 유도한다. 이는 생체 내에서 혈당 감소를 초래한다.

본 발명의 다른 실시예에서, 세포 내 나노입자를 이용한 변형은 TRPV1의 N-말단에 GFP에 대한 낙타과 항체가 융합된 변형 TRPV1과, 페리틴 경쇄-링커-페리틴 중쇄의 N-말단에 EGFP가 융합된 변형 페리틴 융합 단백질을 사용한다. TRPV1에 부착된 페리틴의 철 핵을 가열하면 칼슘 유입이 유발되고 시험관 내에서 프로인슐린 유전자 발현 및 프로인슐린 방출이 증가한다.
본 발명의 비제한적인 실시예에서, 상기 나노입자는 상자성 나노입자일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 대상에서 관심 있는 세포 유형의 활성을 원격으로 자극하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 대상에게 관심 있는 세포 유형에 선택적인 나노입자를 투여하는 단계; 및 (ii) 무선 주파수장을 인가하여 나노입자를 원격으로 활성화하는 단계를 포함한다. 나노입자의 활성화는 대상에서 관심 있는 세포 유형의 활성을 자극한다. 세포 활동에는 예를 들어 세포 증식 및/또는 분화, 세포사멸, 신호 전달 경로 활성화, 신경 활성화, 장기 시냅스 강화 발달 및/또는 유전자 발현 조절과 같은 세포 반응이 포함될 수 있습니다.
또한, 본 발명은 대상에서 특정 세포 유형의 활동을 자극하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 대상에 특정 세포 유형에 선택적인 나노입자를 포함하는 변형된 세포를 투여하는 단계 및 (b) 나노입자를 원격으로 활성화하기 위해 무선 주파수장을 인가하는 단계를 포함합니다. 나노입자의 활성화는 대상에서 특정 세포 유형의 활동을 자극합니다.
본 발명은 다양한 임상 환경에서 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술은 다양한 유전성 또는 후천성 질환의 치료에 사용되는 생리활성 단백질의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 유도 만능 줄기세포(iPSC) 또는 NICE 구조체를 발현하도록 조작된 자가 유래 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포는 자가 이식편으로 작용하여 세포 기능을 외부에서 제어할 수 있게 합니다. NICE 의존성 칼슘 유입은 호르몬 분비, 근육 수축 또는 신경 활동을 포함한 다양한 기능을 조절하는 데 사용될 수 있습니다. 조절된 호르몬 발현 및 분비는 당뇨병과 같은 여러 내분비 질환의 치료에 도움이 될 수 있습니다. 신경 자극은 파킨슨병(시상하핵 자극) 및 뇌졸중(경두개 직류 자극)과 같은 여러 심각한 질환뿐만 아니라 통증 완화 및 위마비 치료에도 사용될 수 있습니다(Benabid A L. et al, 2009 Lancet Neurol 8:67-81; Schlaug G. et al. 2008 Arch Neurol 65: 1571-1576; Nnoaham K E, Kumbang J 2008 Cochrane Database Syst RevCD003222; Maranki J, Parkman H P 2007 Curr Gastroenterol Rep 9:286-294).
당사 기술에 알려진 방법을 사용하여 제조된 기능성 나노입자는 내인성 세포 특이적 표면 단백질을 표적으로 하는 재조합 항체로 코팅하여 표적화할 수 있습니다. 이러한 응용 분야 및 접근법은 NICE 기법을 사용하여 동물에 적용할 수 있습니다.

또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 특정 세포 집단이 생리 기능에 미치는 영향을 분석하는 수단을 제공한다. 본 발명은 서로 다른 주파수에 맞춰 조정된 나노입자로 다양한 세포 유형을 표지할 수 있게 하여, 근접해 있는 특정 세포 집단도 동시에 활성화할 수 있도록 한다. 본 발명은 시험관 내 및 생체 내에서 비침습적으로 세포 기능을 선택적으로 조절할 수 있도록 한다. 현재까지 해부학적으로 구분되고, 시간적으로 제어되며, 비침습적인 세포 활성화 방법은 존재하지 않는다. 이러한 기술을 통해 세포 집단의 역할을 연구할 수 있다.

(이하 생략)

나노테크놀로지의 현재입니다.

인체 내의 페리틴에 무선 주파주를 걸어서 신체 반응을 조절할수 있네요.

[루시엘]

https://m.blog.naver.com/goodozone/224273114354