disk diffusion

[김희중]

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   항균제 감수성 검사 (Susceptibility Test)

   목 적 : 환자의 검체로부터 질병의 원인균을 검출하여 세균 동정과 동시에 항균제 감수성 검사를 하여 감염증 치료에
             필요한 항생제를 선택하는데 있다.                 

                근래에 상용되는 항균제에 대한 세균의 내성이 높아가고 있음을 알 수 있다.

                내성균주를 생성하는 균종들에는 Staphylococci , Proteus , Pseudomonas 및 몇몇 대장균족들이 있다.
                이와 같은 추세는 특히 합병증 치료에 문제점을 야기시키게 됐고 계속하여 새로운 항균제와 합성 치료제 발견에  더욱 집중
                하게 만들었다.

                항균제 치료가 반드시 효과적인 결과를 가져올 것이라는 보장이 없는 까닭에 임상에서 종종 항생물질 치료를
                주저하고 있는 것도 사실이다.
                어떤 특정 병원성균에 대한 항균제의 효과를 측정하여 임상에서 적당한 항균제를 선택하도록 하는 것으로 검사의                 의의를 찾는다.

                약제감수성 검사기간 때문에 오는 치료의 지연이 생길 수 있으나 정확한 항균제의 선택을 통하여 이와 같은 단점
                을 보완할 수 있을 것이다.

   종 류

• 액체배지 희석법 (broth dilution method) :기초배지로 Muller-Hinton 한천이 흔히 사용된다. 균주는 Steers replicator로 접종한다. 한꺼번에 균주 30주 이상의 감수성을 시험할 수 있다. 집락의 증식 상태를 눈으로 확인할 수 있기 때문에 다른 세균에 의한 오염을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그러나 이 방법은 통상적인 감수성 시험에 사용하기에는 너무 번거럽고, 비용이 많이 드는 단점이 있으며, 흔히 연구용으로 사용된다.
  
  
• 한천배지 희석법 (agar dilution method) :액체배지를 기초배지로 사용한다. 항균제 농도마다 1 mL 이상의 액제배지를 사용하면 macrobroth 희석법, 0.05-0.1 mL를 사용하면 microbroth 희석법이라 부른다. MIC 뿐 아니라 최소살균농도 (minimal bactericidal concentration, MBC)도 측정할 수 있는 장점이 있다. 그러나 집락의 증식 상태를 눈으로 확인할 수 없기 때문에 다른 세균에 의한 오염을 배제할 수 없는 단점이 있다. Microscan, Vitek 등 자동화된 장비는 microbroth 희석법으로 균주의 MIC를 측정하며, 많은 미생물 검사실에서 이들 자동화 장비를 이용해서 편리하게 항균제 감수성 시험을 하고 있다. 그러나 이들 자동화 장비는 감수성, 중간내성 및 내성을 구분하는 breakpoint 만 시험할 수 있는 경우가 많으며, 따라서 진정한 의미의 MIC 시험이라고 하기는 어렵다. 또한 항균제의 MIC 보고가 감수성 양상 (감수성, 중간내성 및 내성)만 보고하는 것보다 치료에 더 도움이 된다는 증거도 없다[Jorgensen과 Sahm, 1995].
  
  
• 디스크 확산법 (disk diffusion method) :기초배지로 Muller-Hinton agar 배지가 흔히 사용된다. 한천의 표면에 면봉으로 시험균주의 균액을 고르게 접종하고, 그 위에 항균제 디스크를 놓는다. 배양시간 동안 디스크의 항균제는 주위의 한천으로 확산하므로, 디스크 바로 주변의 한천에는 항균제가 고농도로 분포하지만, 디스크에서 먼 곳의 한천에는 항균제가 낮은 농도로 분포한다. 이와 같은 한천의 항균제 농도경사에 의해서 세균 증식의 억제대가 형성된다. 즉, 디스크와 일정 거리에 있는 한천의 항균제 농도는 시험균주에 대한 MIC가 되며, 이 point보다 안쪽의 한천에서는 균주가 증식을 못 하지만, 이 point 밖에서는 균주가 증식한다. 디스크 확산법에서는 이 억제대의 지름을 측정해서 균주의 시험항균제에 대한 감수성 양상을 결정한다.

  디스크 확산법으로는 MIC를 측정할 수 없다. 또한 증식이 느린 세균, 혐기성 세균 등의 항균제 감수성을 측정할 수 없는 단점이 있다. 그러나 이 방법은 시험이 간단하고, 비용이 적게들며, 시험항균제를 수시로 바꿀 수 있는 장점이 있다. 우리나라의 미생물 검사실 대부분은 이 방법을 이용해서 항균제 감수성 시험을 하고 있다. 최근 일본에서는 디스크 억제대의 크기가 MIC와 비례하는 점을 이용해서 디스크 확산법으로 MIC를 추정하는 방법도 개발되었다.
  
  

• E-test 확산법 (E-test strip method) :확산법을 이용한 항균제 감수성 시험 방법이다. 그러나 일반적인 디스크 확산법과는 달리 MIC를 측정할 수 있다. 방법도 쉽고 간편하기 때문에 통상적인 감수성 시험에 사용할 수도 있다. 그러나 Etest strip의 가격이 상당히 비싸며, 항균제당 넓은 면적의 평판배지가 필요한 단점이 있다.
  
  
• 미생물 자동화 기기 판정법

   재 료

• Mueller-Hinton agar (90mm, 100mm, 150mm)
• 증균 배지 (Mueller Hinton broth, Tryptic soy broth)
• 항균제 디스크
• 표준 탁도액 (McFarland tube 0.5)
• 멸균 면봉, 생리식염수, 백금이
• 디스크 디스펜서 (disc dispenser)
• Zone Reader 등     

   방 법 (Kirby-Bauer disk diffusion method)

           1. 균 접종액의 준비

• 순수 배양된 평판 배지에서 잘 분리된 집락 4-5개를 선별하여 백금이로 증균용 배지에 접종한다.
• 37 C 부란기에서 표준탁도액의 농도 이상으로 균이 발육될 때까지 배양한다.(약 3-5시간 배양이 적당하다.)
• 배양액을 표준탁도액의 농도와 같도록(시험관의 규격이 동등해야 한다)멸균된 생리식염수나 액체배지로 희석한다.

           2. 균의 접종

• 균 배양액의 농도를 맞춘 후 15분 이내에 멸균된 면봉을 균 배양액에 적셔서 시험관 내벽에 돌리면서 눌러 짜서 과다한 균액을 제거한다.
• 표면이 마른 평판 한천 평판 배지 위에 균액이 적셔진 면봉을 골고루 문질러 접종한다.
• 평판 뚜껑을 닫고 3-5분동안 방치하여 표면의 습기가 흡수되도록 한다.

           3. 디스크 접종

• 디스크 디스펜서를 이용하여 필요한 디스크를 균이 골고루 접종된 한천 평판배지에 놓고 디수크 중앙을 가볍게 눌러 한천 표면에 완전히 부착시킨다. 디스크 간의 간격은 충분히 떨어져야 한다. 각 디스크 중심간의 간격은 24mm 이상이어야 하며 평판 가장자리로부터 15mm 이상 떨어져야 한다.
  
  90mm 배지에는6개, 100mm에는 8개, 150mm에는 중앙에 3개, 가장자리에 9개의 디스크를 놓는다.
  
  
• 디스크를 놓은 평판은  약 30분 동안 정치시킨 후 37C 부란기에 평판 뚜껑이 밑으로 가도록 놓아 배양한다.

    

 4. 판독

• Zone Reader 나 자 등을 이용하여 발육 억제대 의 직경을 측정하여 기록한다.
  발육억제대 주변에 미약한 발육이나 작은 집락의 형성은 발육이 억제된 것으로 간주하고 큰 집락이 생겼을 경우는 계대 배양하여 다시 동정해서 재실험하여야 한다.
• 보통 16-18 시간 배양 후의 결과를 참조한다.

           5. 발육 억제대 크기의 해석 (NCCLS standard)

  감수성 시험 결과의 오류

        감수성 시험 결과의 신뢰성을 확보하기 위해서는 참조균주 (reference strain)를 사용해서 꾸준히 정도관리를 해야한다.
        또한 참조 균주의 시험 결과가 오차 허용범위 내에 들었다고 해서 검사결과 모두가 정확하다고 할 수는 없다.
        감수성 시험 결과가 비전형적인 경우에는 재검 혹은 균종 감별의 재확인이 필요하다.

    ① 디스크 확산법 결과 오류의 흔한 원인

• 배지의 오류: 디스크 확산법에는 흔히 Muller-Hinton 한천이 사용되며, 한천의 두께가 틀리거나 배지의 성분이 잘못되면 오류가 생길 수 있다. 특히 한천의 두께는 매우 중요하므로, 반드시 4 mm인 것을 확인해야 한다. 한천의 두께가 4 mm보다 얇으면 디스크의 항균제가 더 빠르고 넓게 확산되므로 억제대의 크기가 더 커지고, 이에 따라서 내성균주를 감수성으로 판정할 우려가 있다. 반대로 한천이 두꺼우면 항균제가 느리고 좁게 확산되므로 억제대 크기가 작아지며, 따라서 감수성균주를 내성으로 판정할 우려가 있다.

• 디스크의 오류: 디스크의 역가가 수송이나 보관의 잘못 혹은 오랜 보존에 의해서 변성되면 감수성 균주를 내성으로 잘못 판정할 수 있다.
  
  
• 시험균주의 오류: 시험균주가 오염되었거나, 접종 균액의 탁도가 잘못되면 감수성 시험결과의 오류를 유발할 수 있다. 오염이 있는 경우에는 억제대가 이중으로 나타나는 경우가 많다. 즉, 결과 해석시 이중의 억제대가 관찰되면 오염을 의심하고, 균종 동정부터 다시 시험하는 것이 좋다. 한편 항균제에 따라서 감수성 시험 결과가 균주의 접종량에 영향을 많이 받을 수도 있다. 접종 균액의 탁도가 너무 높으면 억제대가 좁아질 수 있으며, 반대로 탁도가 너무 낮으면 억제대가 커질 수 있다.

• 참조균주의 오류: 참조균주가 오염 혹은 변이되면 그 날 시험한 감수성 결과 모두를 믿을 수 없게 되므로 주의해야 한다.

• 배양 조건의 오류: 배양온도 혹은 환경에 의해서 감수성 시험결과가 영향을 받을 수 있다. 특히 CO₂ 농도가 높은 환경에서 배양하면 CO₂에 의해서 항균제의 역가가 감소할 수 있으므로 주의해야 한다.

• 검사자의 오류: 억제대 측정, 기록 혹은 breakpoint의 잘못된 적용에 의해서 오류가 생길 수 있다.
  

   ② 오류의 종류

• Very major error: 내성균주를 감수성으로 보고하는 것이며, 미생물 검사실에서 절대로 범해서는 안될 오류이다. 이 오류는 특정 항균제에 내성인 균주의 감염증 치료에 임상의사가 그 항균제를 사용하는 결과를 유발할 수 있으며, 이는 감염증 치료의 실패와 직결되므로 특히 주의해야 한다.

• Major error: 감수성균주를 내성으로 보고하는 것이다. 이 결과는 임상의사의 항균제 선택 폭을 줄이기는 하지만, 다른 감수성 항균제를 사용하면 되므로, 감염증 치료 실패와 직결되는 오류는 아니다.

• Minor error: 감수성을 중간내성으로, 중간내성을 내성으로 혹은 그 역으로 보고하는 것이다.
  
  

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