Re: host -장내 유익균 metabolomics 2022 nature!!

[문형철]

• Review Article
• Published: 15 August 2022

Moving beyond descriptive studies: harnessing metabolomics to elucidate the molecular mechanisms underpinning host-microbiome phenotypes

• Stephanie L. Bishop, 
• Marija Drikic, 
• Soren Wacker, 
• Yuan Yao Chen, 
• Anita L. Kozyrskyj & 
• Ian A. Lewis 

Mucosal Immunology volume 15, pages1071–1084 (2022)Cite this article

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Abstract

Advances in technology and software have radically expanded the scope of metabolomics studies and allow us to monitor a broad transect of central carbon metabolism in routine studies. These increasingly sophisticated tools have shown that many human diseases are modulated by microbial metabolism. Despite this, it remains surprisingly difficult to move beyond these statistical associations and identify the specific molecular mechanisms that link dysbiosis to the progression of human disease. This difficulty stems from both the biological intricacies of host-microbiome dynamics as well as the analytical complexities inherent to microbiome metabolism research. The primary objective of this review is to examine the experimental and computational tools that can provide insights into the molecular mechanisms at work in host–microbiome interactions and to highlight the undeveloped frontiers that are currently holding back microbiome research from fully leveraging the benefits of modern metabolomics.

초록

기술과 소프트웨어의 발전은

대사체학 연구의 범위를 급속히 확장시켰으며,

일상적인 연구에서 중앙 탄소 대사 과정의 광범위한 단면을

모니터링할 수 있게 되었습니다.

이러한 점점 더 정교해지는 도구들은

많은 인간 질환이

미생물 대사 의해 조절된다는 것을 보여주었습니다.

그럼에도 불구하고, 이러한 통계적 연관성을 넘어

미생물군집 불균형과 인간 질환의 진행 사이를 연결하는

특정 분자적 메커니즘을 식별하는 것은 여전히 놀랍도록 어렵습니다.

이 어려움은

호스트-미생물군집 동역학의 생물학적 복잡성과 미생물군집 대사 연구에 내재된

분석적 복잡성에서 기인합니다.

이 리뷰의 주요 목적은

호스트-미생물군집 상호작용에서 작용하는 분자적 메커니즘에 대한 통찰을 제공할 수 있는

실험적 및 계산적 도구를 검토하고,

현대 대사체학의 혜택을 완전히 활용하는 데

현재 장애물이 되고 있는 미개척 분야를 강조하는 것입니다.

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Introduction

Metabolism plays a foundational role in essentially all aspects of life and disruptions in metabolism can affect a wide range of basic functions including nutrition, athletic performance, immune function, pain perception, and the progression of both chronic and infectious diseases1,2,3,4,5,6,7. Although mammalian metabolism has been intensively studied for over a century, it has primarily been investigated through the lens of host metabolic function. However, over the last 20 years we have become increasingly aware of the role that microbial communities play in modulating the availability of nutrients and how these microbial modulations can impact homeostasis5. Everything that mammals eat enters the gastrointestinal (GI) tract, where the metabolism of the gut microbiome can transform these molecules and directly influence the complement of nutrients that are passed along to the host3.

대사 과정은

생명체의 모든 측면에서 기초적인 역할을 하며,

대사 장애는 영양, 운동 성능, 면역 기능, 통증 인식, 만성 및 감염성 질환의 진행 등

다양한 기본 기능에 영향을 미칠 수 있습니다.1,2,3,4,5,6,7.

포유류의 대사 과정은

1세기 이상 집중적으로 연구되어 왔지만,

주로 호스트의 대사 기능 관점에서 조사되어 왔습니다.

그러나 지난 20년간 우리는

미생물 군집이 영양소의 가용성을 조절하는 역할과

이러한 미생물 조절이 항상성에 미치는 영향에 대해 점점 더 인식하게 되었습니다5.

포유류가 섭취하는 모든 음식은 소화관(GI)으로 들어가며,

장 미생물군의 대사 과정은 이러한 분자를 변환하여 호스트에게 전달되는

영양소의 구성을 직접적으로 영향을 미칩니다3.

Disruptions in the microbiome caused by antibiotics, diet, and disease can alter these intricate host-microbiome metabolic exchanges and affect biological functions throughout the body1,2,3,5,6,8,9,10,11,12. A few examples of diseases that are modulated by microbial metabolism include colitis (e.g., irritable bowel syndrome (IBS) and Crohn’s disease)10,13,14,15,16,17, immune diseases (e.g., multiple sclerosis)1,18,19, neurodegenerative diseases (e.g., amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer’s disease)20,21,22, psychological conditions (e.g., depression)8,23, cystic fibrosis24,25,26,27,28,29, cancer30,31,32, and cardiovascular disease33. Microbial metabolism can also play a role in the pharmacokinetics of drugs9,34,35. These surprising associations have led researchers to investigate the microbiome as a vehicle for stimulating specific metabolic activities21,36,37,38 and as a tool to modulate inflammation39,40,41.

항생제, 식이요법, 질병으로 인한 미생물군집의 교란은

이러한 복잡한 호스트-미생물군집 대사 교환을 변화시키고

신체 전반의 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있습니다1,2,3,5,6,8,9,10,11,12.

미생물 대사 의해 조절되는 질병의 몇 가지 예시에는

대장염(예: 과민성 대장 증후군(IBS) 및 크론병)10,13,14,15,16,17,

면역 질환(예: 다발성 경화증)1,18,19,

신경퇴행성 질환(예: 근위축성 측삭 경화증 및 알츠하이머병) 20,21,22,

심리적 상태(예: 우울증)8,23,

낭포성 섬유증24,25,26,27,28,29,

암30,31,32, 및

심혈관 질환33.

미생물 대사 과정은 약물의 약동학에도 영향을 미칠 수 있습니다9,34,35.

이러한 놀라운 연관성은 연구자들이

미생물군집을 특정 대사 활동을 자극하는 매개체로21,36,37,38 및 염증을 조절하는 도구로

조사하도록 이끌었습니다39,40,41.

The links between microbial metabolism and human diseases are now well-defined thanks to large-scale efforts, such as the >15,000 feces samples collected by the American Gut Project42. These efforts have helped demonstrate links between the microbiome and diverse conditions including IBS, cystic fibrosis, diabetes mellitus, and cancer31,43,44,45. While identifying the specific molecular mechanisms contributing to these diseases remains challenging, recent advances in metabolomics technologies allow us to capture a broad swath of central carbon metabolism and track the microbial metabolism of carbon chains as they are passed through networks of over 5000 reactions46,47,48,49. Metabolomics technology, when coupled to animal models, isotope tracing studies, and in vitro organ models allows researchers to probe the complexities of host-microbiome metabolic dynamics with a greater degree of experimental control than was previously possible (Fig. 1, Table 1). The main objective of this review is to examine the unique challenges encountered in microbiome-metabolism studies and discuss how these emerging tools and techniques can provide insights into the molecular mechanisms at work behind complex host–microbiome interactions. We highlight examples of how these tools can be used to study host-microbiota and microbe-microbe interactions, as well as interactions of the microbiome with diet and pharmaceuticals (Table 1; see Supplementary Table 1 for more examples).

미생물 대사 과정과 인간 질환 간의 연관성은

대규모 연구 노력, 예를 들어 미국 장내 미생물 프로젝트(American Gut Project)에서 수집된

15,000개 이상의 분변 샘플을 통해 명확히 정의되었습니다42.

이러한 연구는

장내 미생물군과 과민성 장 증후군(IBS),

낭성 섬유증, 당뇨병, 암 등

다양한 질환 간의 연관성을 입증하는 데 기여했습니다31,43,44,45.

이러한 질환에 기여하는 특정 분자 메커니즘을 규명하는 것은 여전히 도전 과제이지만,

대사체학 기술의 최근 발전은

중앙 탄소 대사 과정의 광범위한 범위를 포착하고

미생물이 5,000개 이상의 반응 네트워크를 통해

탄소 사슬을 대사하는 과정을 추적할 수 있게 했습니다46,47,48,49.

대사체학 기술은

동물 모델, 동위 원소 추적 연구, 체외 장기 모델과 결합될 때,

이전보다 훨씬 높은 실험적 통제 하에서

호스트-미생물군집 대사 동역학의 복잡성을 탐구할 수 있게 합니다(그림 1, 표 1).

이 리뷰의 주요 목적은

미생물군집-대사 연구에서 직면한 독특한 도전 과제를 검토하고,

이러한 신흥 도구와 기술이 복잡한 호스트-미생물군집 상호작용의 분자적 메커니즘을 이해하는 데

어떻게 기여할 수 있는지 논의하는 것입니다.

우리는 이러한 도구를

호스트-미생물군집 및 미생물 간 상호작용, 미생물군집과 식이 및 약물 간의 상호작용을 연구하는 데

어떻게 적용할 수 있는지 예시를 강조합니다(표 1; 추가 예시는 보충 표 1 참조).

Fig. 1: Established model systems for studying host-microbiome-related phenomena.

Figure created with BioRender, available at Biorender.com.

Full size image

Table 1 Established host-microbiome metabolic phenotypes along different axes of interaction, including host-microbe, microbe-microbe, and microbes with the external environment.

Full size table

Biological complexities in microbiome metabolic studies

Complex microbial ecosystems are found throughout the integument, GI tract, airways, mucosa, and urogenital tract5. The environmental conditions that microbes encounter at these sites vary dramatically with respect to pH, oxygen, bicarbonate, and nutrient availability and these site-to-site differences can have a profound impact on which microbes inhabit the niche50. Since the metabolic capacity of microbes differs considerably species to species, these differences in microbial community composition can have a profound impact on the metabolic capacity of the overall system51,52,53,54,55. Moreover, the ensemble action of host and microbial enzymes creates a more complex metabolic network than exists in any individual species5,6.

Microbiome metabolism is further complicated by the multi-species pathways that nutrients can take through the microbial ecosystem. The metabolic waste products of some microbes are the preferred carbon sources for others. Succinate, for example, is a primary waste product of Enterobacteriales56 but is also one of the preferred carbon sources of Pseudomonas aeruginosa57,58,59. These differences in nutritional strategies enable microbial cross-feeding interactions that create multi-species metabolic networks in the microbiome50,60. Cross-feeding can significantly alter the metabolic capacity of systems24,25,27,28,52,61 and modulate microbial phenotypes (e.g., their sensitivity to antibiotics)35,53,54. Cross-feeding interactions also enable some species to survive in otherwise inhospitable environments23,35,62. For example, a previously unreported genus of bacteria (KLE1738) was recently found to depend on γ-aminobutyric acid (GABA)-producing Bacteroides fragilis for growth23. Cross-feeding interactions are also thought to play a role in a range of health issues, including periodontal health62, the clinical progression of pulmonary infections in cystic fibrosis patents24,25,28,29, and may contribute to the overgrowth of pathobionts in response to undernutrition63.

미생물군집 대사 연구에서의 생물학적 복잡성

미생물군집은

피부, 소화관, 호흡기, 점막, 요로생식기 관 등 신체 전반에 걸쳐

복잡한 미생물 생태계를 형성합니다5.

이러한 부위에서 미생물이 직면하는 환경 조건은

pH, 산소, 중탄산염, 영양소 가용성 등에서 극적으로 다릅니다.

이러한 부위별 차이는

특정 미생물이 서식하는 생태적 틈새에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다50.

미생물의 대사 능력은 종마다 크게 다르기 때문에,

미생물 군집 구성의 차이는 전체 시스템의 대사 능력에 깊은 영향을 미칠 수 있습니다51,52,53,54,55.

또한,

호스트와 미생물 효소의 복합적 작용은

어떤 단일 종에서도 존재하지 않는

더 복잡한 대사 네트워크를 생성합니다5,6.

미생물군집의 대사 과정은

영양소가 미생물 생태계를 통해 이동하는 다종 경로로 인해 더욱 복잡해집니다.

일부 미생물의 대사 폐기물은

다른 미생물의 선호 탄소원으로 작용합니다.

예를 들어,

Enterobacteriales의 주요 대사 폐기물인 수산화물은

Pseudomonas aeruginosa의 선호 탄소원 중 하나입니다57,58,59.

이러한 영양 전략의 차이는

미생물 간 교차 영양 상호작용을 가능하게 하여

미생물군집 내 다종 대사 네트워크를 형성합니다50,60.

교차 영양은

시스템의 대사 능력을 크게 변화시킬 수 있으며24,25,27,28,52,61

미생물의 형질(예: 항생제 민감도)을 조절합니다35,53,54.

교차 영양 상호작용은

일부 종이 otherwise 적대적인 환경에서 생존할 수 있도록 합니다23,35,62.

예를 들어,

이전에 보고되지 않은 세균 속(KLE1738)이

γ-아미노부티르산(GABA)을 생산하는

Bacteroides fragilis에 의존하여 성장한다는 것이 최근에 발견되었습니다23.

Cross-feeding interactions

교차 영양 상호작용은

치주 건강62, 낭포성 섬유증 환자의 폐 감염 임상 진행24,25,28,29, 영양 결핍에 대한 반응으로

병리성 미생물의 과증식에 기여할 수 있다는 점 등

다양한 건강 문제에 역할을 할 것으로 추정됩니다63.

Tracking metabolism through multi-species networks

Decoupling the complex flow of molecules organism-to-organism is a non-trivial challenge and to study cross-feeding, researchers have employed a variety of methods including genome-scale metabolic reconstruction28,64, computational modeling with in vitro data28,65,66,67,68, and in vitro checkerboard assays53,54 (Table 1; Supplementary Table 1). Recently, metabolomics has played a larger role in dissecting these dynamics, largely via the use of isotope tracing experiments69,70,71. Isotope tracing approaches track the flow of stable isotope-labeled nutrients (typically 13C, 15N or 2H) through microbial communities and their exchange with the host23,24,61,72. This strategy has been used to identify microbe-specific biomarkers23,33,61, demonstrate the exchange of nutrients from microbes to the host72, and demonstrate syntrophic relationships between microbes that overcome nutrient imbalance in the diet61. Though powerful, isotope labeling approaches are a serious analytical undertaking, especially in the context of untargeted and semi-targeted metabolomics studies. The multi-species metabolic networks can scramble isotope labeling and make it difficult to predict which molecules and which isotopologues (i.e., the number of isotopically labeled atoms present in a molecule) will be produced from a microbiome-linked processing of a precursor. This uncertainty can create computational challenges because it requires all possible metabolites to be screened for all possible isotopologues. This dramatically increases the search space and thereby the likelihood of misidentifying metabolites in the context of untargeted/semi-targeted studies. Although this can be partially mitigated via high-resolution mass spectrometry73, additional care must be given to the molecular assignment process since mass and retention time alone may not be sufficient to unambiguously identify metabolites in isotopically complex microbiome extracts.

다종 네트워크를 통한 대사 추적

개체 간 복잡한 분자 흐름을 분리하는 것은 어려운 과제이며, 교차 영양 작용을 연구하기 위해 연구자들은 유전체 규모 대사 재구성28,64, 체외 데이터 기반 계산 모델링28,65,66,67,68, 및 체외 체커보드 실험53,54(표 1; 보충 표 1) 등 다양한 방법을 활용해 왔습니다. 최근 대사체학은 동위 원소 추적 실험69,70,71을 통해 이러한 동역학을 분석하는 데 더 큰 역할을 해왔습니다. 동위 원소 추적 접근법은 미생물 군집을 통해 안정 동위 원소로 표지된 영양소(일반적으로 13C, 15N 또는 2H)의 흐름과 호스트와의 교환을 추적합니다23,24,61,72. 이 전략은 미생물 특이적 바이오마커를 식별하는 데 사용되었습니다23,33,61, 미생물에서 호스트로의 영양소 교환을 입증하는 데 사용되었습니다72, 그리고 식이 영양소 불균형을 극복하는 미생물 간의 공생 관계를 입증하는 데 사용되었습니다61. 강력한 방법론이지만, 동위 원소 표지 접근법은 특히 비표적 및 반표적 대사체학 연구 맥락에서 심각한 분석적 과제를 안고 있습니다. 다종 미생물 대사 네트워크는 동위 원소 표지법을 혼란스럽게 하여, 미생물군과 관련된 전구체 처리 과정에서 생성될 분자 및 동위 원소 동위체(즉, 분자 내 동위 원소로 표지된 원자의 수)를 예측하기 어렵게 합니다. 이 불확실성은 모든 가능한 대사물을 모든 가능한 동위 원소 동위체에 대해 스크리닝해야 하기 때문에 계산적 도전 과제를 초래합니다. 이는 검색 공간을 극적으로 증가시켜 비표적/반표적 연구에서 대사체 오식별 가능성을 높입니다. 고해상도 질량 분석법73을 통해 일부 완화될 수 있지만, 미생물군집 추출물에서 동위 원소 복잡성으로 인해 질량과 유지 시간만으로는 대사체를 명확히 식별하기 어려울 수 있으므로 분자 할당 과정에 추가적인 주의가 필요합니다.

Organ models of microbiome metabolism

In vitro bioreactors and organ models are well-established systems for reducing the complexity of microbiome analyses and provide a path for identifying specific molecular interactions between cell types26,27,74,75,76,77,78,79. One of the best-established bioreactor systems is the Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME®), which simulates the entire human GI tract74,75. The SHIME® system simulates digestion by pumping contents into a series of chambers74. This system can be primed with fecal suspensions or engineered with specific microbes to enable specific molecular interactions to be studied under controlled conditions. This model has been used to elucidate the effects of diet and pre- or probiotics on organic acid and short-chain fatty acid (SCFA) production in different GI compartments36,38,80,81,82. Other organ models include the Winogradsky column system, which has been used to study the microbial community interactions underlying pulmonary infections25,26,27, and a range of single compartment chemostat reactors that have been used to simulate specific microbiome ecosystems (e.g., the human colon)37,76,77,79,83,84,85,86.

Although each of these established in vitro systems enable detailed molecular studies to be conducted under well-controlled conditions, they lack human cell interactions87 and thus do a poor job of simulating the significant host contributions to the environment, such as the absorption of nutrients associated with mammalian host cells27,74,83,88. To address this, a range of new in vitro organ models have been developed. Organoids, organ-on-a-chip, and related in vitro human biomimetic models allow researchers to simulate specific compartments of the human body while manipulating parameters to simulate disease pathogenesis, host-cell responses, and drug interactions89,90,91. Organoid culture is a well-established tool for studying a multitude of organs and disease models, but most current approaches use a microfluidic organ-on-a-chip approach to mimic complex interactions between the microbiome and host or other microbial cells. The human Colon Chip was used to determine the human microbiome-associated metabolites that mediated susceptibility to enterohemorrhagic E. coli infection, which is not common in mice and therefore cannot be studied in a murine model92. The human gut-on-a-chip, comprised of two microfluidic channels which are separated by a flexible membrane lined with human epithelial cells, is a useful tool to manipulate different factors in the gut microbiome, such as the presence of immune cells and pathogenic microbes, to determine the factors that contribute most to intestinal inflammation and bacterial overgrowth40,93. Similarly, the simplified human microbiota (SIHUMIx) model consists of three parallel bioreactors inoculated with a standard mix of eight bacterial species that are dominant in human feces and improves the reproducibility of results from prior bioreactor systems94.

Newer models are allowing researchers to study more complex interactions including co-culture and multi-organ systems41,87,89. The microfluidics-based HuMix (human-microbial crosstalk) model consists of gaskets divided into three co-laminar microchannels (medium perfusion microchamber, human epithelial cell culture chamber, microbial culture microchamber) with cell-covered membranes used for the extraction of intracellular metabolites87. This provides a means to continually monitor the effect of co-culture on individual co-cultured cell contingents. The authors validated HuMix with human intestinal epithelial cells co-cultured with Lactobacillus rhamnosus GG grown under anaerobic conditions, which induced the intracellular accumulation of GABA in the epithelial cells. Another model connected the human gut, liver, and circulating immune cells (T regulatory and T helper 17 cells) to simulate ulcerative colitis ex vivo using an integrated co-culture system of two fluidically communicating human micro-physiological systems41. In this system, the authors tested the immune response to microbiome-derived SCFAs, which was dependent on the involvement of effector CD4 T cells.

Each of these in vitro organ models provides a mechanism for investigating the molecular underpinnings of host-microbiome interactions. However, all bioreactors and organ models are sensitive to subtle changes in pH, temperature, nutrients, and oxygen levels which can have a dramatic impact the metabolic phenotypes observed in these model systems27,74,83,95. Although these platforms provide a controlled environment for testing metabolic hypotheses about interactions of individual species, they generally must be combined with metabolic profiling or in vivo approaches to verify the physiological relevance of the findings (see Table 1 for examples).

미생물군집 대사 모델

체외 생물반응기와 장기 모델은 미생물군집 분석의 복잡성을 줄이는 데 잘 확립된 시스템이며, 세포 유형 간 특정 분자 상호작용을 식별하는 길을 제공합니다26,27,74,75,76,77,78,79. 가장 잘 확립된 생물반응기 시스템 중 하나는 인간 장 미생물 생태계 시뮬레이터(SHIME®)로, 인간 소화관 전체를 모방합니다74,75. SHIME® 시스템은 내용물을 일련의 챔버로 펌핑하여 소화를 모방합니다74. 이 시스템은 분변 현탁액으로 초기화되거나 특정 미생물로 공학적으로 설계되어 통제된 조건 하에서 특정 분자 상호작용을 연구할 수 있습니다. 이 모델은 식이 요인과 전·프로바이오틱스가 소화관 각 부위에서 유기산 및 단쇄 지방산(SCFA) 생산에 미치는 영향을 규명하는 데 사용되었습니다36,38,80,81,82. 다른 장기 모델에는 폐 감염의 미생물 군집 상호작용을 연구하기 위해 사용된 Winogradsky 기둥 시스템25,26,27과 특정 미생물군 생태계(예: 인간 대장)를 모방하기 위해 사용된 단일 구획 화학반응기(예: 인간 대장)37,76,77,79,83,84,85,86 등이 있습니다.

이러한 확립된 체외 시스템은 잘 통제된 조건에서 상세한 분자 연구를 수행할 수 있지만, 인간 세포 상호작용을 결여하고 있어87 호스트의 환경에 대한 중요한 기여를 시뮬레이션하는 데 부족합니다. 예를 들어, 포유류 호스트 세포와 관련된 영양소 흡수27,74,83,88 등이 포함됩니다. 이를 해결하기 위해 다양한 새로운 체외 장기 모델이 개발되었습니다. 오가노이드, 장기-온-어-칩(organ-on-a-chip) 및 관련 체외 인간 생체 모방 모델은 연구자들이 인간 몸의 특정 부위를 모방하면서 매개변수를 조작하여 질병 발병 메커니즘, 호스트 세포 반응, 약물 상호작용을 시뮬레이션할 수 있도록 합니다89,90,91. 오가노이드 배양은 다양한 장기 및 질병 모델 연구에 널리 사용되는 도구이지만, 현재 대부분의 접근 방식은 미생물군집과 호스트 또는 다른 미생물 세포 간의 복잡한 상호작용을 모방하기 위해 미세유체학 기반 장기-온-어-칩 접근법을 사용합니다. 인간 대장 칩은 쥐에서 흔하지 않아 쥐 모델에서 연구할 수 없는 장출혈성 E. coli 감염에 대한 감수성을 매개하는 인간 미생물군집 관련 대사물을 확인하는 데 사용되었습니다92. 인간 장-온-어-칩은 인간 상피 세포로 덮인 유연한 막으로 분리된 두 개의 미세유체 채널로 구성되어 있으며, 장 미생물군집의 다양한 요인(면역 세포의 존재, 병원성 미생물 등)을 조작하여 장 염증과 세균 과증식에 가장 크게 기여하는 요인을 결정하는 데 유용한 도구입니다40,93. 同様に, 간소화된 인간 미생물군집(SIHUMIx) 모델은 인간 분변에서 우점하는 8종의 세균 종으로 구성된 표준 혼합물을 접종한 세 개의 병렬 바이오리액터로 구성되며, 이전 바이오리액터 시스템의 결과 재현성을 향상시킵니다94.

새로운 모델은 공동 배양과 다기관 시스템과 같은 더 복잡한 상호작용을 연구할 수 있도록 하고 있습니다41,87,89. 미세유체역학 기반의 HuMix(인간-미생물 교신) 모델은 세 개의 공층 미세채널(배지 순환 미세실, 인간 상피 세포 배양실, 미생물 배양 미세실)로 나뉜 가스켓으로 구성되며, 세포로 덮인 막을 사용하여 세포 내 대사물을 추출하는 데 사용됩니다87. 이 모델은 공배양 조건에서 개별 공배양 세포 집단의 영향을 지속적으로 모니터링할 수 있는 방법을 제공합니다. 연구진은 무산소 조건에서 배양된 Lactobacillus rhamnosus GG와 인간 장 상피 세포의 공배양을 통해 HuMix를 검증했으며, 이 과정에서 상피 세포 내 GABA의 축적이 관찰되었습니다. 또 다른 모델은 인간 장, 간, 순환 면역 세포(T 조절 세포 및 T helper 17 세포)를 연결하여 통합된 유체 소통 인간 미세 생리학적 시스템41을 통해 체외에서 궤양성 대장염을 모방했습니다. 이 시스템에서 저자들은 미생물군집에서 유래한 SCFAs에 대한 면역 반응을 테스트했으며, 이는 효과기 CD4 T 세포의 참여에 의존했습니다.

이러한 체외 장기 모델 각각은 호스트-미생물군 상호작용의 분자적 기전을 조사하는 메커니즘을 제공합니다. 그러나 모든 생물반응기와 장기 모델은 pH, 온도, 영양소, 산소 수준과 같은 미세한 변화에 민감하며, 이러한 변화는 모델 시스템에서 관찰되는 대사적 표현형에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다27,74,83,95. 이러한 플랫폼은 개별 종 간의 상호작용에 대한 대사 가설을 테스트하기 위한 통제된 환경을 제공하지만, 일반적으로 대사 프로파일링 또는 in vivo 접근법을 결합해야 발견된 결과의 생리학적 관련성을 검증할 수 있습니다(예시 참조: 표 1).

Animal model strategies for investigating molecular interactions

Gnotobiotic animal models, which have been extensively reviewed elsewhere96,97,98, are one of the most effective tools for investigating the molecular underpinnings of host-microbe molecular interactions99,100,101. Germ-free mice (and other species) can be colonized with defined collections of microbes, which enables direct comparisons between germ-free (GF; free of all microorganisms), specific pathogen free (SPF; contain a microbiota that is free of specified pathogens), and monocolonized/polycolonized animals. For human studies, microbial communities linked to specific metabolic phenotypes can be mapped via metagenomic sequencing102 and the taxonomic structure of populations can be linked to disease states. These phylogenetic mapping efforts can be effective when combined with fecal microbiota transplantation studies to separate host versus microbiome contributions to complex diseases103.

These model systems present a powerful framework for integrating hypothesis testing into metabolomics studies of the microbiome and have been used to investigate diverse biological processes including aging104, reproduction105,106, and metabolism13,14,16,107,108. This strategy has been very successful in providing molecular insights into diverse diseases including colitis (both IBS and Crohn’s disease)15,17, neurodegenerative disease20,21, breast cancer32, diabetes109, the biological response to toxin exposure9,10,34,110,111,112,113, and the role that the microbiome plays in immunity30,114. Though powerful, gnotobiotic models have some limitations. Human physiology and our microbial communities differ from those found in model organisms100 and this can present challenges in translating findings back to human disease115,116. Furthermore, rodents are coprophagic, a behavior that is not common in people, and this can have a direct impact on the metabolic composition of the GI tract, including microbial catabolites of bile acids115. Despite these shortcomings, gnotobiotic models are currently the best tools available for testing specific microbiome metabolic hypotheses and, if carefully coupled with in vitro organ models or human studies, provide the most direct path for unraveling the molecular underpinnings of host-microbiome metabolic dynamics.

동물 모델 전략을 활용한 분자 상호작용 연구

무균 동물 모델(gnotobiotic animal models)은 다른 곳에서 광범위하게 검토된 바와 같이96,97,98, 호스트-미생물 분자 상호작용의 분자적 기전을 연구하는 가장 효과적인 도구 중 하나입니다99,100,101. 무균 마우스(및 기타 종)는 정의된 미생물 집합으로 식민화될 수 있으며, 이는 무균(GF; 모든 미생물이 없는 상태), 특정 병원체 무균(SPF; 특정 병원체가 없는 미생물군을 가진 상태), 단일 식민화/다중 식민화 동물 간의 직접적인 비교를 가능하게 합니다. 인간 연구에서는 특정 대사적 표현형과 연관된 미생물 군집을 메타게놈 시퀀싱102를 통해 지도화할 수 있으며, 군집의 분류학적 구조를 질병 상태와 연결할 수 있습니다. 이러한 계통학적 지도화 노력은 분변 미생물군 이식 연구와 결합될 때 복잡한 질병에 대한 호스트와 미생물군 간의 기여도를 구분하는 데 효과적일 수 있습니다103.

이 모델 시스템은 미생물군집 연구에 가설 검증을 통합하는 강력한 프레임워크를 제공하며, 노화104, 생식105,106, 대사13,14,16,107,108 등 다양한 생물학적 과정을 조사하는 데 활용되었습니다. 이 전략은 대장염(IBS와 크론병 모두)15,17, 신경퇴행성 질환20,21, 유방암32, 당뇨병109, 독소 노출에 대한 생물학적 반응9,10,34,110,111,112,113, 그리고 미생물군이 면역에 미치는 역할30,114 . 강력한 도구임에도 불구하고, 무미생물 모델은 일부 한계점을 가지고 있습니다. 인간 생리학과 미생물 군집은 모델 생물에서 관찰되는 것과 다릅니다100, 이는 연구 결과를 인간 질환으로 역추적하는 데 어려움을 초래할 수 있습니다115,116. 또한, 설치류는 분변 섭취 행동을 보이지만 이는 인간에서 흔하지 않으며, 이는 장내 미생물 대사산물(예: 담즙산 대사산물)을 포함한 장내 대사 구성에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다115. 이러한 한계에도 불구하고, gnotobiotic 모델은 특정 미생물군집 대사 가설을 테스트하는 데 현재 가장 우수한 도구이며, 체외 장기 모델이나 인간 연구와 신중하게 결합될 경우 호스트-미생물군집 대사 동역학의 분자적 기전을 규명하는 가장 직접적인 경로를 제공합니다.

Sampling considerations

Metabolic associations can be established through the analysis of non-invasive samples (analyses of feces, serum, and urine), but these samples are indirect reporters of microbial metabolism, are diluted significantly after they leave their microenvironment, and can undergo significant biological or chemical degradation before they can be sampled from these distal sites44,117,118,119,120,121,122. Although the obvious solution to this problem is to collect samples directly from microbial communities, this approach is not always practical (i.e., sampling the GI tract in humans is invasive and not all sites can be reached via endoscopy123). Moreover, the metabolites produced by microbes in one site can affect a wide range of other organs11,20,21,113,122,124,125,126,127. Microbially-derived trimethylamine N-oxide and phenylacetylglutamine produced in the gut, for example, are linked to elevated risks of cardiovascular disease and pancreatic cancer31,33. In addition, a growing body of literature has shown that the microbiome influences both local and systemic immune function2,127. Microbial inosine, for example, plays a direct role in the activation of antitumor T cells30. Resolving these indirect modes of action is critical for understanding the molecular mechanisms that contribute to disease but poses significant challenges to study designs. At present, the best strategy is to sample broadly from both the local microbial communities (wherever possible) and from distal sites around the body.

The choice of metabolite extraction solvents will also directly affect the scope of metabolites that can be observed in a study46,121. The merits of diverse sample preparation methods, the timing of collection, transport and storage conditions of the samples, homogenization, and pretreatment strategies (e.g., use of preservatives) have been discussed at length elsewhere117,118,119,128,129. Briefly, some general principles that need to be considered are (1) the extraction solvent must match the downstream analysis (i.e., aqueous extractions should be matched with analyses of hydrophilic molecules and vice versa), (2) metabolism needs to be quenched to prevent samples from degrading, (3) solvent/solute ratios should be adjusted according to the target molecules to maximize extraction efficiencies, (4) freezing samples will cause some metabolites to precipitate out of solution and can affect quantification, and (5) every sample extraction method excludes certain groups of molecules and introduces biases46,121,130. Consequently, the primary objective of any extraction should be to capture the target transect of molecules with the least technical error. With this objective in mind, we have increasingly favored extractions in 4 °C 50% methanol:H2O (at a 1:50 or 1:20 volume:volume dilution or 50 mg tissue/mL) for general studies involving central carbon metabolism131,132,133, extracellular metabolome analyses134,135,136, and other projects involving the analysis of polar metabolites137,138,139 (see Section S1 in the SI file for detailed extraction protocols). We have shown that this simple extraction, when coupled with hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) mass spectrometry (MS), can reproducibly capture metabolites over thousands of samples with minimal technical error (coefficient of variation <0.15 over 1000+ injections)140. We find that this method is a good first choice for analyzing polar compounds when the molecular targets are poorly defined; however, other methods can be better optimized for specific compound classes such as SCFAs. Samples containing SCFAs should be immediately frozen (at −20 °C or preferably −80 °C) and can then undergo extraction using solvents such as an acetonitrile:H2O blend or specialized cleanup steps like solid-phase microextraction141,142,143,144. Appropriate sample preparation steps for the sample matrix and the classes of molecules analyzed help ensure reproducible and meaningful results in these complex microbiome-metabolomics studies.

채취 고려 사항

대사 연관성은

비침습적 샘플(분변, 혈청, 소변 분석)을 통해 확립될 수 있지만,

이러한 샘플은 미생물 대사의 간접적 지표이며,

미세 환경을 벗어나면 크게 희석되며,

채취 전까지 생물학적 또는 화학적 분해가 크게 발생할 수 있습니다44,117,118,119,120,121,122.

이 문제의 명백한 해결책은

미생물 군집에서 직접 샘플을 수집하는 것이지만,

이 접근 방식은 항상 실용적이지 않습니다

(예: 인간의 소화관 샘플링은 침습적이며 내시경을 통해 모든 부위를 접근할 수 없습니다123).

또한,

미생물이 한 부위에서 생성한 대사산물은

다양한 다른 장기에 영향을 미칠 수 있습니다11,20,21,113,122,124,125,126,127.

예를 들어,

장에서 생성된 미생물 유래 트리메틸아민 N-옥사이드와 페닐아세틸글루타민은

심혈관 질환 및 췌장암 위험 증가와 연관되어 있습니다31,33.

또한,

미생물군이 국소적 및 전신적 면역 기능에 영향을 미친다는 연구 결과가

점점 더 늘어나고 있습니다2,127.

예를 들어, 미생물 유래 인오신은 항종양 T 세포의 활성화에 직접적인 역할을 합니다30. 이러한 간접적 작용 메커니즘을 규명하는 것은 질병에 기여하는 분자적 메커니즘을 이해하는 데 필수적이지만, 연구 설계에 큰 도전 과제를 제기합니다. 현재 가장 좋은 전략은 가능한 한 국소 미생물 군집과 신체 주변의 원격 부위에서 광범위하게 샘플을 채취하는 것입니다.

대사체 추출 용매의 선택은 연구에서 관찰할 수 있는 대사체의 범위에 직접적인 영향을 미칩니다46,121. 다양한 시료 준비 방법의 장점, 채취 시점, 시료의 운송 및 보관 조건, 균질화, 전처리 전략(예: 보존제 사용) 등은 다른 문헌에서 상세히 논의되었습니다117,118,119,128,129. 간략히 요약하면 고려해야 할 일반적인 원칙은 다음과 같습니다. (

1) 추출 용매는 하류 분석과 일치해야 합니다(예: 수성 추출은 친수성 분자 분석과 일치해야 하며, 반대의 경우도 마찬가지입니다),

(2) 대사 과정을 중단시켜 샘플의 분해를 방지해야 합니다,

(3) 용매/용질 비율은 목표 분자에 따라 조정하여 추출 효율을 극대화해야 합니다,

(4) 시료를 동결하면 일부 대사산물이 용액에서 침전되어 정량화에 영향을 줄 수 있으며,

(5) 모든 시료 추출 방법은 특정 분자 그룹을 배제하고 편향을 도입합니다46,121,130.

따라서 추출의 주요 목표는 기술적 오차를 최소화하여 목표 분자 집합을 포착하는 것입니다. 이 목표를 염두에 두고, 우리는 중앙 탄소 대사 연구를 포함한 일반적인 연구에서 4°C 50% 메탄올: H₂O (부피 비율 1:50 또는 1:20 희석 또는 50 mg 조직/mL)를 사용합니다. 이는 중앙 탄소 대사131,132,133, 세포외 대사체 분석134,135,136, 및 극성 대사체 분석을 포함한 기타 프로젝트에 적용됩니다137,138,139 (자세한 추출 프로토콜은 SI 파일의 Section S1을 참조하세요). 우리는 이 간단한 추출 방법이 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 질량 분석법(MS)과 결합될 때, 기술적 오류가 최소화되면서(변동계수 <0.15, 1,000회 이상 주입 시) 수천 개의 시료에서 대사물을 재현성 있게 포착할 수 있음을 보여주었습니다140. 이 방법은 분자 표적이 명확히 정의되지 않은 극성 화합물 분석에 좋은 첫 번째 선택지이지만, SCFAs와 같은 특정 화합물 클래스에 대해서는 다른 방법이 더 최적화될 수 있습니다. SCFA를 포함한 시료는 즉시 동결(-20°C 또는 가능하면 -80°C)해야 하며, 아세토니트릴:H₂O 혼합액이나 고체상 미세 추출(SPME)141,142,143,144와 같은 특수 정제 단계를 통해 추출할 수 있습니다. 시료 매트릭스와 분석 대상 분자 클래스에 맞는 적절한 시료 전처리 단계는 이러한 복잡한 미생물군집-대사체학 연구에서 재현 가능하고 의미 있는 결과를 확보하는 데 도움이 됩니다.

New frontiers in human sampling

Gnotobiotic animals are a powerful platform for studying disease but will always be imprecise re-creations of human diseases. Validating these findings requires human studies, which are generally limited to blood, urine, feces, and other non-invasive samples. Although some researchers have employed surgical biopsy145 and mucosal endoscopic lavage17,123, these medical procedures are difficult to organize for most studies. To address this, several groups are working to develop ingestible GI sample collection devices146,147. These new tools allow insights into physiology that were previously only practical in animal models.

Three examples of this emerging platform are the CapScan® (Envivo Bio)146, the Ingestible Osmotic Pill147, and the Small Intestine MicroBiome Aspiration Capsule (SIMBA™) (Small Intestine MicroBiome Aspiration Capsule (2022) at https://www.nimblesci.com/technology). The CapScan® consists of a collapsed collection bladder, capped by a one-way valve inside a dissolvable capsule with an enteric coating146. Once ingested, the device moves down the GI tract until it reaches a pre-set pH level (e.g., pH 7–8 in the ileum), where the enteric coating dissolves and the collection bladder draws in the luminal contents. The one-way valve prevents further entrance of liquid into the capsule, which is later recovered from the stool. These researchers tested the device on 240 intestinal samples from 15 healthy patients and found significant differences in microbes and metabolites present in the intestines compared to the stool and determined that bile acid profiles varied along the intestines, as found previously in animal models. Other devices follow similar principles, although the mechanism of action for the 3D-printed Osmotic Pill involves a pressure differential created across the semipermeable membrane, which induces a passive pumping action as it moves down the GI tract147. The pill is embedded with a small neodymium magnet, and thus can be held in a precise location inside the GI tract for sampling of specific locations. These ingestible sampling devices have just recently been introduced and their applications into metabolomics have just started to come online. One consideration in applying this emerging technology to metabolomics is that samples collected via these capsules cannot be metabolically quenched until after the capsule has been collected (potentially a day or more after sampling the microbiome)46,121,148. Consequently, these tools will be most amenable to analyzes of metabolic phenotypes that are biologically and chemically stable.

인간 시료 채취의 새로운 지평

무균 동물은 질병 연구에 강력한 플랫폼이지만, 인간 질병의 부정확한 재현에 불과합니다. 이러한 결과를 검증하려면 인간 연구가 필요하지만, 이는 일반적으로 혈액, 소변, 분변 등 비침습적 시료로 제한됩니다. 일부 연구자들은 수술적 생검145 및 점막 내시경 세척17,123을 사용했지만, 이러한 의료 절차는 대부분의 연구에서 조직하기 어렵습니다. 이를 해결하기 위해 여러 연구 그룹은 섭취 가능한 위장 샘플 수집 장치146,147을 개발 중입니다. 이러한 새로운 도구는 이전에는 동물 모델에서만 가능했던 생리학적 통찰을 제공합니다.

이 신흥 플랫폼의 세 가지 예시는 CapScan® (Envivo Bio)146, Ingestible Osmotic Pill147, 및 Small Intestine MicroBiome Aspiration Capsule (SIMBA™) (Small Intestine MicroBiome Aspiration Capsule (2022) at https://www.nimblesci.com/technology)입니다. CapScan®은 용해성 캡슐 내부에 일방향 밸브로 덮인 붕괴형 수집 블래더로 구성되어 있습니다. 캡슐은 장용 코팅으로 덮여 있습니다.

섭취 후 장 내로 이동하여 사전 설정된 pH 수준(예: 소장 내 pH 7–8)에 도달하면 장용 코팅이 용해되고 수집 블래더가 장 내 내용물을 흡입합니다. 일방향 밸브는 캡슐 내로 추가 액체가 유입되는 것을 방지하며, 이 캡슐은 이후 대변에서 회수됩니다. 이 연구진은 15명의 건강한 환자로부터 수집한 240개의 장 샘플을 대상으로 장치를 테스트했으며, 장 내 미생물과 대사물 수준이 대변과 비교해 유의미한 차이를 보였으며, 이전 동물 모델에서 관찰된 것과 유사하게 장 내 담즙산 프로파일도 장 부위에 따라 달라졌음을 확인했습니다. 다른 장치들도 유사한 원리를 따르지만, 3D 프린팅된 삼투압 캡슐의 작용 메커니즘은 반투과성 막을 통해 생성되는 압력 차이로 인해 소화관 내를 이동하면서 수동적 펌핑 작용을 유발합니다147. 이 캡슐에는 작은 네오디뮴 자석이 내장되어 있어 소화관 내 특정 위치에 정확히 고정되어 샘플링이 가능합니다. 이 섭취 가능한 샘플링 장치는 최근에 도입되었으며, 대사체학 분야로의 적용은 이제 막 시작되었습니다. 이 신기술을 대사체학에 적용할 때 고려해야 할 점은 캡슐을 통해 수집된 샘플이 캡슐이 수집될 때까지(미생물군집 샘플링 후 하루 이상 경과할 수 있음) 대사적으로 안정화되지 않는다는 점입니다46,121,148. 따라서 이러한 도구는 생물학적 및 화학적 안정성이 높은 대사 형질 분석에 가장 적합할 것입니다.

Analytical complexities in microbiome metabolic studies

Microbiome metabolomics studies present significant analytical challenges because of the exceptional breadth of chemical diversity and the high degree of metabolic complexity that can be found in metabolic extracts from microbial communities (Fig. 2)44,46,47. Complex carbohydrates, lipids, bile acids, SCFAs, peptides, amino acids, nucleotides, vitamins and cofactors, and a stunning diversity of secondary metabolites are a few examples of small molecule classes that are metabolized by the microbiome1,2,3,6,8 and can modulate host-microbiome dynamics (see Table 1 for examples). Unfortunately, no single analytical technique can capture this full spectrum of molecules in a single analysis46,48,49. Consequently, each study must designate a target range of molecules and select an extraction method and analytical framework that are compatible with the chemical properties of the target analytes.

미생물군집 대사 연구의 분석적 복잡성

미생물군집 대사체학 연구는 미생물 군집에서 추출된 대사 추출물에서 발견되는 화학 다양성의 예외적인 폭과 대사 복잡성의 높은 정도 때문에 분석적 도전 과제를 제시합니다(그림 2)44,46,47.

복잡한 탄수화물,

지질,

담즙산,

SCFAs,

펩타이드,

아미노산,

뉴클레오티드,

비타민 및 코인자, 그리고

미생물군집에 의해 대사되는 놀라운 다양성의 2차 대사산물은

미생물군집에 의해 대사되는 소분자 클래스의 몇 가지 예시입니다1,2,3,6,8이며,

호스트-미생물군집 동역학을 조절할 수 있습니다(표 1 참조).

Complex carbohydrates, lipids, bile acids, SCFAs, peptides, amino acids, nucleotides, vitamins and cofactors, and a stunning diversity of secondary metabolites are a few examples of small molecule classes that are metabolized by the microbiome1,2,3,6,8 and can modulate host-microbiome dynamics

불행히도 단일 분석 기술로 이 모든 분자 스펙트럼을 단일 분석에서 포착할 수 없습니다46,48,49.

따라서 각 연구는 대상 분자의 범위, 추출 방법 및 분석 프레임워크를 대상 분석물의 화학적 특성과 호환되도록 지정해야 합니다.

Fig. 2: Analytical challenges associated with microbiome-metabolomics research include the diversity of chemical classes present in local and systemic regions of the gut microbiome.

Figure created with BioRender, available at Biorender.com.

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As discussed in “Sampling considerations”, there are dozens of commonly used sample preparation and analytical workflows for metabolomics analyses. These have generally consolidated around methods for the three core instrumentation platforms used in metabolomics: liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)10,13,21,45,142, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)110,149,150, and nuclear magnetic resonance (NMR)12,15,120. Although the general merits and pitfalls of these platforms are thoroughly described elsewhere46, there are some special considerations that these platforms have in the context of microbiome research.

One of the most intensively studied classes of molecules in microbiome research are SCFAs, which are microbially-derived compounds that are implicated in a vast range of biological processes ranging from colitis and immune function to pain perception10,13,15,21,22,85,110,151,152. Although these molecules can be detected on any of the three core analytical platforms, they are surprisingly difficult to accurately quantify. NMR methods can detect them directly but cannot accurately quantify them without selective or multidimensional methods130,153. Although SCFAs are small and polar, they are difficult to resolve by liquid or gas chromatography without derivatization154. To address this, a range of specialized SCFA analysis techniques have been developed10,21,45,142. Of these, we prefer SCFA Quantification Using Aniline Derivatization, which is an isotope-based LC-MS strategy that enables robust absolute quantification of SCFAs in complex samples142.

Another important class of metabolites for microbiome research are bile acids, which encompass a rich collection of cholesterol-derived molecules and whose conjugated derivatives are secreted from the liver into the gut and converted into secondary bile acids via microbial catabolism1,11,44,113,122,155,156. A selection of conjugated and unconjugated bile acids reach the circulatory system, where they interact with bile acid receptors1,11,113,156,157. These molecules are primarily detected in the cecum or the feces and are best detected using reverse-phase LC-MS44,113,158 or via targeted analyses using chemical labeling kits that are now commercially available (e.g., Biocrates)11.

Beyond these intensively studied classes of compounds, a range of aqueous central carbon metabolites, including amino acids (e.g., neurotransmitters, choline derivatives, and tryptophan derivatives), nucleotides, and energy intermediates are emerging as important regulators of the interplay between host and microbiome1,8,20,21,111,124,159,160. These metabolites are more commonly associated with systemic effects (i.e., are found in the bloodstream and tissues such as the brain and liver)12,20,21,111,124,159, but can also serve as important immune regulators in the GI tract30,122,161,162. These hydrophilic compounds are most easily analyzed by LC-MS using HILIC140,163,164,165 but can also be derivatized and analyzed by GC-MS14,109,112. Our preferred strategy for aqueous analyzes of the GI tract and feces uses a zwitterionic HILIC (Thermo Fisher Syncronis™) stationary phase combined with a short linear ammonium formate (aqueous phase)/ acetonitrile with formic acid (organic phase) gradient to capture amino acids, carbohydrates, nucleotide derivatives, and other common compounds that are found outside the cell140. We have recently shown that the uptake and secretion of these compounds is a sensitive predictor of microbial taxa56.

Phosphate-containing metabolites (e.g., ATP, NADH, glucose-6P, and carbamoyl phosphate) and organic acids (e.g., citrate and α-ketoisovalerate) play a critical role in central carbon metabolism, energy transfer, and redox166. Although a range of HILIC methods have been developed to chromatographically resolve these compounds, they tend to ionize poorly by electrospray ionization. This problem can be mitigated through the use of ion pairing agents (e.g., tributylamine; TBA), which improve their chromatographic properties and stabilizes their negative charges167,168. The TBA-metabolite complexes formed through this method enhance LC-MS sensitivity by orders of magnitude for these compounds. One of the most effective of these methods is C18 reverse phase ion pairing (RPIP) that was developed by the Rabinowitz group169. This method can be challenging to set up and involves spraying 15 mM TBA into an instrument, which is very difficult to clean out of the system and effectively commits the LC-MS system to negative mode analyses. For labs with the technical expertise to establish this method and resources to commit an instrument to this setup, the RPIP method offers a robust and high-sensitivity mechanism for quantifying phosphate-containing metabolites and organic acids.

In summary, the vast diversity of microbial metabolites produced by the microbiome cannot be captured using a single analytical assay and the selection of analytical method(s) will have a direct impact on the transect of metabolic pathways that will be observable for any given study. Thus, the analytical approach must be tailored to each investigation and multiple methods are generally required to capture a comprehensive picture of host-microbiome metabolic dynamics.

“표본 채취 고려 사항"에서 논의된 바와 같이, 대사체학 분석을 위해 일반적으로 사용되는 표본 준비 및 분석 워크플로는 수십 가지에 달합니다. 이들은 대사체학에서 주로 사용되는 세 가지 핵심 장비 플랫폼을 중심으로 일반화되었습니다:

액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)10,13,21,45,142,

가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GC-MS)110,149,150, 및

핵자기공명 (NMR)12,15,120.

이 플랫폼들의 일반적인 장점과 단점은 다른 문헌에서 상세히 설명되어 있습니다46, 그러나 미생물군집 연구 맥락에서 이 플랫폼들이 갖는 특수한 고려 사항이 있습니다.

미생물군집 연구에서 가장 집중적으로 연구된 분자 클래스 중 하나는 SCFAs로,

미생물에서 유래된 화합물로

염증성 장 질환과 면역 기능부터 통증 인식에 이르는

광범위한 생물학적 과정에 관여합니다10,13,15,21,22,85,110,151,152.

이러한 분자들은

세 가지 핵심 분석 플랫폼 중 어느 하나에서도 검출될 수 있지만,

정확히 정량화하는 것은 의외로 어렵습니다.

NMR 방법은 이를 직접 검출할 수 있지만, 선택적 또는 다차원적 방법 없이 정확히 정량화할 수 없습니다130,153. SCFAs는 작고 극성이지만, 유도체화 없이 액체 또는 가스 크로마토그래피로 분해하기 어렵습니다154. 이를 해결하기 위해 다양한 전문 SCFA 분석 기술이 개발되었습니다10,21,45,142. 이 중 우리는 SCFA 정량화를 위한 아닐린 유도체화 방법을 선호합니다. 이는 복잡한 시료에서 SCFA의 견고한 절대 정량화를 가능하게 하는 동위 원소 기반 LC-MS 전략입니다142.

미생물군집 연구에서 또 다른 중요한 대사산물 클래스는

담즙산으로,

콜레스테롤 유래 분자의 풍부한 집합체를 포함하며,

그 공액 유도체는 간에서 장으로 분비되어 미생물 분해 과정을 통해

2차 담즙산으로 전환됩니다1,11,44,113,122,155,156.

공액 및 비공액 담즙산 중 일부는

순환계로 이동하여

담즙산 수용체와 상호작용합니다1,11,113,156,157.

이 분자들은 주로 결장이나 분변에서 검출되며,

역상 LC-MS44,113,158 또는 화학 표지 키트(예: Biocrates)를 사용한 표적 분석을 통해

가장 잘 검출됩니다11.

이처럼 집중적으로 연구된 화합물 클래스 외에도,

아미노산(예: 신경전달물질, 콜린 유도체, 트립토판 유도체),

뉴클레오티드,

에너지 중간체 등 수성 중앙 탄소 대사산물이

호스트와 미생물군집 간의 상호작용을 조절하는 중요한 조절자로 부상하고 있습니다1,8,20,21,111,124,159,160.

이러한 대사산물은 주로 전신 효과와 연관되어 있습니다(즉, 혈액 및 뇌, 간과 같은 조직에서 발견됨)12,20,21,111,124,159,

하지만 위장관(GI tract)에서 중요한

면역 조절제로도 작용할 수 있습니다30,122,161,162.

이 친수성 화합물은 LC-MS를 사용하여 HILIC140,163,164,165로 가장 쉽게 분석될 수 있지만, 유도체화 후 GC-MS14,109,112로도 분석될 수 있습니다. 위장관 및 분변의 수성 분석을 위한 우리 연구팀의 선호 전략은 아미노산, 탄수화물, 핵산 유도체 및 세포 외부에 존재하는 기타 일반적인 화합물을 포집하기 위해 양이온성 HILIC (Thermo Fisher Syncronis™) 고정상 상과 짧은 선형 암모늄 포르메이트 (수성 상)/ 아세토니트릴과 포름산 (유기 상) 그라디언트를 결합한 방법을 사용합니다140. 우리는 최근 이러한 화합물의 흡수 및 분비가 미생물 군집의 민감한 예측 인자임을 보여주었습니다56.

인산염을 함유한 대사산물(예: ATP, NADH, 글루코스-6P, 카바모일 인산염) 및

유기산(예: 시트르산 및 α-케토이소발레르산)은

중앙 탄소 대사,

에너지 전달 및 환원-산화 반응에 중요한 역할을 합니다166.

이러한 화합물을 크로마토그래픽으로 분리하기 위해 다양한 HILIC 방법이 개발되었지만,

이들은 전기분사 이온화(ESI)에서 이온화 효율이 낮습니다.

이 문제는 이온 결합제(예: 트리부틸아민; TBA)를 사용함으로써 완화될 수 있으며,

이는 화합물의 크로마토그래픽 특성을 개선하고 음전하를 안정화시킵니다167,168.

이 방법으로 형성된 TBA-대사체 복합체는 이러한 화합물의 LC-MS 감도를 수십 배 향상시킵니다. 이 방법 중 가장 효과적인 것은 Rabinowitz 연구 그룹이 개발한 C18 역상 이온 결합(RPIP)입니다169. 이 방법은 설정하기 어려우며, 15 mM TBA를 기기에 분사해야 하며, 이는 시스템에서 제거하기 매우 어렵고 LC-MS 시스템을 음이온 모드 분석에 고정시키는 효과를 갖습니다. 기술적 전문성과 이 방법을 구축할 수 있는 자원, 그리고 기기를 이 설정에 할당할 수 있는 실험실에서는 RPIP 방법이 인산염 함유 대사체와 유기산을 정량화하는 데 견고하고 고감도 메커니즘을 제공합니다.

요약하면,

미생물군집이 생성하는 미생물 대사물의 광범위한 다양성은

단일 분석법으로 포착할 수 없으며,

분석 방법의 선택은 특정 연구에서 관찰 가능한 대사 경로의 범위에 직접적인 영향을 미칩니다.

따라서

분석 접근 방식은 각 연구에 맞게 조정되어야 하며,

호스트-미생물군집 대사 동역학의 포괄적인 그림을 포착하기 위해 일반적으로 여러 방법이 필요합니다.

Data normalization in microbiome metabolic studies

The variability of microbiome samples (e.g., fecal water content and variation in urine water content) along with the frequently large scale of many microbiome studies creates significant complexities with regards to normalizing metabolomics datasets31,33,42,43,56,170. Data normalization is a complex task that is affected by both the analytical platform and sample type. Whereas NMR data can be normalized post-acquisition, mass spectrometry data are very challenging to correct post-acquisition because each molecule follows its own unique ionization properties that are nonlinearly affected by the composition of the matrix171,172,173,174. Thus, no single normalization constant can be used to correct for sample-to-sample differences in composition. To address this, a range of computational strategies have been proposed including normalization to a constant sum175, probabilistic quotient normalization176, metabolic ratio correction171, median fold change177, and normalization to MS total useful signal173. However, in our experience, none of these computational strategies completely control for variability and all of these mathematical operations contribute to undesirable propagation of error. Additionally, normalization can produce significant artefacts—especially in untargeted analyses (partially due to missing signals in analytes approaching the limit of detection). Consequently, our preferred approach, wherever possible, is to prepare homogeneous samples or otherwise correct the sample extractions prior to analysis to minimize the need for post-analysis data normalization. We employ a range of analytical strategies depending on the sample type: for tissue and fecal samples we prefer weighing, for fluids we normalize to initial sample volume, and for microbial samples and cell cultures we correct to optical density or colony counts; alternatively, we introduce isotope-labeled reference metabolites into the extraction mixture142 (see SI Section S1 for details).

In addition to sample-to-sample variability, metabolomics studies must also contend with the inherent instability of the analytical platforms. LC-MS response factors drift day-to-day and thus preclude the direct comparison of raw signal intensities from batch-to-batch. This problem can be addressed by collecting a common reference sample in every batch and expressing observed intensity relative to the common refence140. This common sample can be prepared as a mixture of all of the representative samples (i.e., a “super mix”) which is ideal in untargeted analyses that may capture unusual metabolites. Alternatively, a mixture of analytical reference standards in a representative sample matrix can be collected along with each batch of samples140,173. These calibration reference samples can then be used to compute the absolute concentration of target metabolites and thereby sidestep the data normalization pitfalls. Naturally, the standards-based approach limits analysis to compounds that can be matched to commercial standards and to signals that are present within the linear range of the calibration reference mixtures.

Data analysis complexities in microbiome metabolic studies

Untargeted metabolomics studies capture thousands of individual features from each sample, but conventional experimental designs involve cohorts of hundreds or fewer subjects178. This creates an inherent mismatch between data size and biological replication, which is a recipe for driving false discovery, statistical overfitting, and a variety of computational problems. Consequently, data processing steps, including removal of noise, peak detection, identification, quantification, and missing value imputation can play pivotal role in the quality of the resulting dataset178,179,180. Many of these challenges are inherent to all systems-level analysis and there are well-established statistical tools such as dimensionality reduction approaches (e.g., principal component analysis)12,16,32,105,124,181,182, correction for multiple-testing (e.g., Bonferroni correction)183, the use of linear models (e.g., ridge regression)184, and data visualization strategies (e.g., volcano or Manhattan plots)185 that can identify statistically significant correlations and avoid common pitfalls related to false discovery and statistical overfitting. Recently, new computational approaches have been developed, including machine learning and mediation analysis, that provide a powerful new approach for unlocking the molecular underpinnings of host-microbiome dynamics186,187,188,189,190,191.

Machine learning strategies for identifying molecular mechanisms

Microbiome-metabolomics computational approaches must decipher a complex mix of interactions to reveal the microbial composition, the interactions between its components, the interaction with the host, as well as time dependencies in the sample. In recent years, researchers have increasingly used machine learning (ML) approaches to resolve these complexities188,190,192,193,194. ML techniques compress high-dimensional data into models via a recursive learning (or fitting) process. Once trained, these models can then be used to predict, classify, or transform new data. A branch of ML called explainable ML focuses on the interpretability of such models and is useful for microbiome research because of its ability to model to highly complex functions, and to identify important combinations of features while simultaneously incorporating confounding variables189,190,195,196,197. Some examples of successful applications of ML are high-capacity models (e.g., Random Forest190 and Gradient Boosting189), deep artificial neural networks that can model arbitrarily complex functions196,197, and the SHAP algorithm that uses concepts from cooperative game theory to analyze trained models and their predictions195. Each of these tools can return a human interpretable “importance” score of the original features and these scores can be used to help drive research into discrete molecular mechanisms. Recently, identifying these causal relationships has been taken a step forward with AutoEncoders, which are neural networks that were developed to identify causal relationships using a latent variable model187. Though effective in skilled hands, neural networks often require expert knowledge to be implemented effectively and other approaches including mediation analysis may provide a means to interpreting complex relationships in metabolomics data.

미생물군집 대사 연구에서의 데이터 정규화

미생물군집 샘플의 변동성(예: 분변 수분 함량 및 소변 수분 함량의 변동)과 많은 미생물군집 연구의 대규모 특성으로 인해 대사체학 데이터셋의 정규화에 있어 심각한 복잡성이 발생합니다31,33,42,43,56,170. 데이터 정규화는 분석 플랫폼과 샘플 유형에 모두 영향을 받는 복잡한 작업입니다. 반면 NMR 데이터는 획득 후 정규화가 가능하지만, 질량 분석 데이터는 각 분자가 매트릭스의 구성에 비선형적으로 영향을 받는 고유한 이온화 특성을 갖기 때문에 획득 후 정규화가 매우 어렵습니다171,172,173,174. 따라서 샘플 간 구성 차이를 보정하기 위해 단일 정규화 상수를 사용할 수 없습니다. 이를 해결하기 위해 다양한 계산 전략이 제안되었습니다. 예를 들어, 일정 합계로 정규화175, 확률적 비율 정규화176, 대사 비율 교정171, 중간값 변화율177, MS 총 유용 신호로 정규화173 등이 있습니다. 그러나 우리의 경험에 따르면, 이러한 계산 전략 중 어느 것도 변동성을 완전히 통제하지 못하며, 모든 수학적 연산은 원치 않는 오류 전파에 기여합니다. 또한 정규화는 특히 비표적 분석에서(분석 대상 물질의 신호가 검출 한계에 가까워지는 경우 부분적으로 인해) 심각한 인공물을 생성할 수 있습니다. 따라서 가능한 경우, 분석 전 샘플을 균일하게 준비하거나 샘플 추출을 보정하여 분석 후 데이터 정규화의 필요성을 최소화하는 것이 우리 선호하는 접근 방식입니다. 시료 유형에 따라 다양한 분석 전략을 적용합니다: 조직 및 분변 시료에는 중량을 측정하는 방법을 선호하며, 액체 시료에는 초기 시료 부피로 정규화하고, 미생물 시료 및 세포 배양에는 광학 밀도나 콜로니 수로 보정합니다. 또는 추출 혼합물에 동위 원소 표지된 참조 대사물을 도입하는 방법도 사용합니다142 (자세한 내용은 SI 섹션 S1 참조).

시료 간 변동성 외에도 대사체학 연구는 분석 플랫폼의 내재적 불안정성과도 직면합니다. LC-MS 응답 인자는 날마다 변동되므로 배치 간 원시 신호 강도를 직접 비교할 수 없습니다. 이 문제는 각 배치에서 공통 참조 시료를 수집하고 관측된 강도를 공통 참조에 상대적으로 표현함으로써 해결할 수 있습니다140. 이 공통 샘플은 모든 대표 샘플의 혼합물(즉, “슈퍼 믹스”)로 준비될 수 있으며, 이는 비정상적인 대사물을 포착할 수 있는 비표적 분석에 이상적입니다. 대안으로, 각 배치 샘플과 함께 분석 참조 표준의 혼합물을 대표 샘플 매트릭스 내에 수집할 수 있습니다140,173. 이러한 교정 참조 샘플은 목표 대사물의 절대 농도를 계산하는 데 사용되어 데이터 정규화 문제를 회피할 수 있습니다. 자연스럽게, 표준 기반 접근법은 상업용 표준과 일치시킬 수 있는 화합물 및 교정 참조 혼합물의 선형 범위 내에 존재하는 신호로 분석을 제한합니다.

미생물군집 대사 연구에서의 데이터 분석 복잡성

비표적 대사체학 연구는 각 샘플에서 수천 개의 개별 특성을 포착하지만, 전통적인 실험 설계는 수백 명 이하의 대상군을 포함합니다178. 이는 데이터 크기와의 생물학적 반복성 불일치를 초래하며, 이는 허위 발견, 통계적 과적합, 다양한 계산 문제의 원인이 됩니다. 따라서 데이터 처리 단계(노이즈 제거, 피크 탐지, 식별, 정량화, 누락 값 보완 등)는 결과 데이터셋의 품질에 결정적인 역할을 할 수 있습니다178,179,180. 이러한 도전 과제 중 많은 부분은 모든 시스템 수준 분석에 내재되어 있으며, 차원 축소 접근법(예: 주성분 분석)12,16,32,105,124,181,182, 다중 비교 교정(예: Bonferroni 교정)183, 선형 모델 사용(예: ridge 회귀) 184, 데이터 시각화 전략(예: 화산도나 맨해튼 플롯)185 등이 있습니다. 이러한 도구들은 통계적으로 유의미한 상관관계를 식별하고 거짓 발견 및 통계적 과적합과 관련된 일반적인 함정을 피하는 데 도움을 줍니다. 최근에는 기계 학습 및 매개 분석과 같은 새로운 계산적 접근법이 개발되어 호스트-미생물군집 동역학의 분자적 기전을 규명하는 강력한 새로운 접근법을 제공했습니다186,187,188,189,190,191.

분자 메커니즘 식별을 위한 머신러닝 전략

미생물군집-대사체학 계산 접근법은 미생물 구성, 구성 요소 간의 상호작용, 호스트와의 상호작용, 샘플 내 시간 의존성을 밝히기 위해 복잡한 상호작용의 혼합을 해독해야 합니다. 최근 몇 년간 연구자들은 이러한 복잡성을 해결하기 위해 머신러닝(ML) 접근법을 점점 더 많이 활용해 왔습니다188,190,192,193,194. ML 기술은 재귀적 학습(또는 적합화) 과정을 통해 고차원 데이터를 모델로 압축합니다. 훈련된 모델은 새로운 데이터를 예측, 분류, 또는 변환하는 데 사용될 수 있습니다. 설명 가능한 ML(explainable ML)이라는 ML의 한 분야는 이러한 모델의 해석 가능성에 초점을 맞추며, 미생물군집 연구에 유용합니다. 이는 고도로 복잡한 기능을 모델링할 수 있으며, 혼란 변수를 동시에 고려하면서 중요한 특징의 조합을 식별할 수 있기 때문입니다189,190,195,196,197. ML의 성공적인 응용 사례로는 고용량 모델(예: 랜덤 포레스트190 및 그라디언트 부스팅189), 임의로 복잡한 기능을 모델링할 수 있는 심층 인공 신경망196,197, 그리고 협력 게임 이론의 개념을 활용해 훈련된 모델과 예측을 분석하는 SHAP 알고리즘195 등이 있습니다. 이 도구들은 원본 특징의 인간이 해석 가능한 '중요도' 점수를 반환할 수 있으며, 이 점수는 분자 메커니즘 연구를 촉진하는 데 활용될 수 있습니다. 최근에는 AutoEncoders를 통해 이러한 인과 관계 식별이 한 단계 발전했습니다. AutoEncoders는 잠재 변수 모델을 활용해 인과 관계를 식별하기 위해 개발된 신경망입니다187. 전문가의 손에서 효과적이지만, 신경망은 효과적으로 구현하기 위해 전문 지식이 필요하며, 매개 분석과 같은 다른 접근 방식이 대사체학 데이터의 복잡한 관계를 해석하는 수단을 제공할 수 있습니다.

Mediation analysis in microbiome studies

Mediation analysis is a valuable tool that can estimate causality in relationships between study variables191,198. Mediation models were first employed in the study of psychosocial predictors of human health in order to identify potential causal relationships by decomposing the direct effect of a predictor versus a treatment or outcome or its indirect effect through a mediator199,200,201,202. A mediation model has three types of variables, the predictor (X), the outcome (Y), and the mediator (M). X could be the state of a patient (age, gender, comorbidities, etc.), Y the severity of a disease, and M the clinical interventions. Tests of association often use another variable called the confounding factor or variable (C), which does not mediate the association between X and Y but is an alternate (biasing) explanation for it. The goal is to quantify direct effects (caused by X) and indirect effects (caused by M) on (Y) and their statistical significances. Explanations for a potentially-causal association between a predictor (X) and an outcome (Y) almost always involve at least one mediator variable (M)203.

More recently, there has been a growing interest in studying the role of human gut microbiota as a “mediating” biological pathway in the association between diet, a medical intervention or an environmental exposure, and adult health200,201,202. Several publications have also explored the role of early-life microbiota by testing the role of gut microbiota during infancy in mediating associations between a variety of early life exposures such as maternal pre-pregnancy weight, cesarean section delivery, and household cleaning product use, and comparing these to future health outcomes204,205,206. Mediation analysis can be used to identify microbiota metabolic pathways for breastfeeding in promoting gut immunity. For example, γ-Proteobacteria and its metabolite lactate have been shown experimentally to promote mucosal immunity and aid maturation of gut microbiota by stimulating Immunoglobulin A responses and enhancing intestinal cell activity of dendritic cells207,208.

In a multiple mediator pathway model (Fig. 3), we demonstrate the effects of two sequential mediators, gut γ-Proteobacteria (Mediator 1) and lactate levels (Mediator 2), in the pathway between breastfeeding (BF) status (X) and fecal secretory Immunoglobulin A (sIgA) levels, a marker of gut immunity, after 3 months of breastfeeding (Y). At this young infant age, breast milk is the sole source of sIgA and the infant gut only produces small amounts. In this example, the predictor variable (X) is divided into two categories, X1 (partially-breastfed infants) and X2 (non-breastfed infants), and compared to the reference category, exclusively breastfed infants. The mediating path (or indirect effect) being tested is the γ-Proteobacteria – lactate pathway in the association between the extent of non-breastfeeding and fecal sIgA levels. This path shows statistical significance for partial breastfeeding [Path 3 × 1: −0.05, 95% (−0.10, −0.01)] and no breastfeeding [Path 3 × 2: −0.06, 95%CI (−0.13, −0.02)], indicating that limiting breast milk intake can lower infant sIgA levels through a pathway of reduced abundance of γ-Proteobacteria and its metabolite lactate. As expected, the model also shows a substantial direct effect for lack of any breastfeeding in lowering sIgA levels [X2, −4.34]. Importantly, the microbiota-lactate path is a separate path to the direct effects of breast milk in supplying sIgA to the infant, suggesting that reduced availability of fecal lactate due to limited breastfeeding may lower sIgA production in the infant gut. Experimentally, it has been shown that lactate stimulates sIgA production208. By identifying multiple metabolic paths or consequences of reduced milk intake, this model underscores the importance of breastfeeding in not only providing passive IgA immunization to the infant but also its role in promoting the immuno-stimulatory activity of γ-Proteobacteria and lactate during early infancy when mucosal immunity is poorly developed209,210.

Fig. 3: Mediation analysis can be used to establish causality in microbiome-metabolomics studies, with an example shown of the mediating roles of infant γ-Proteobacteria (Mediator 1) and lactate (Mediator 2) on the association between breastfeeding status (causal agent X) and fecal sIgA levels (presumed effect Y) at 3 months.

a We establish the variables in the causal diagram, showing the association between causal agent X (breastfeeding status) and presumed effect Y (infant fecal sIgA levels at 3 months). b Using a sequential mediation model, we establish the direct effects of breastfeeding status on fecal sIgA levels, where breastfeeding status is the categorical variable and exclusive-BF is the reference group. c We then calculate the indirect and total effects in the causal diagram. β-coefficients are shown with 95% Confidence Intervals (CI) and significant differences (p < 0.05) are indicated in red.

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Although classical mediation approaches may not model nonlinear effects well, new approaches including parametric models and ML mediation analysis show promising results in establishing high-dimensional data without pre-selection of control variables186,191,192,194,211. These exciting new methodologies will enable researchers to handle the ever-increasing amounts and complexity of future datasets generated through large-scale metabolomics studies.

Examples of host-microbiome dynamics that are modulated through metabolism

Advances in metabolomics technologies have greatly expanded our ability to dissect the molecular underpinnings of complex host-microbiome interactions. Recently, there has been a major expansion of the literature in this area. Our small selection of examples provided here (Table 1) can serve as a starting point for exploring this exciting new body of literature.

Host-microbe metabolic dynamics encompass a wide range of biological functions including chronic and infectious disease, immunity, aging, neurology, and physiology10,13,15,18,22,30,33,104,212. One classic example of these host-microbe dynamics relates to SCFAs, which are produced by the gut microflora and have protective effects against colitis and IBS10,13,15. SCFAs also modulate the maturation of immune cells, including microglia, and shape the properties of the visceral pain signaling pathways10,22. Recent studies have shown that SCFAs have radioprotective effects by stimulating repair processes in the gastrointestinal tract and by reducing proinflammatory responses in the host22,110.

Other select examples of host-microbe interactions include the production of inosine by Bifidobacterium pseudolongum, which aids in the activation of host responses to colorectal cancer in immune checkpoint blockade therapy (with anti-CLTA-4 treatment)30. In addition, phenylacetyl-glutamine and phenylacetyl-glycine, produced by Clostridium sporogenes, are associated with cardiovascular disease through modulation of G-protein coupled receptors33. Lactobacillus and Bacteroides microbiome members are correlated with enhanced neurobiological functions like improved memory or alleviated depression symptoms23,159. Bacteroides possess the ability to produce GABA, a key neurotransmitter for mood and memory regulation23, while Lactobacillus spp. enhance GABA production in a lactate-dependent manner159. Lactobacillus members also metabolize dietary tryptophan into indole compounds (e.g., indoxyl-3-sulfate, indole 3-propionic acid, indole 3-aldehyde) which have a protective effect against host inflammation via the activation of aryl hydrocarbon receptors in both experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE; representative of multiple sclerosis)18 and colorectal cancer models212.

Microbiota also participate in microbe-to-microbe interactions that impact host homeostasis and affect the ability of specific pathogens to cause infection. In cystic fibrosis infections, a range of in vitro, computational, and human metabolic profiling approaches have collectively established that dominance by the pathogen Pseudomonas aeruginosa is driven by its ability to cross-feed on amino acids, organic acids, and alcohols produced by facultative anaerobes in the environment24,25,28,29. Phascolarctobacterium spp. have a protective effect against Clostridium difficile infections by consuming the succinate needed for Clostridium difficile growth39 while Bacteroides vulgatus produce SCFAs and trimethylamines, which have a protective effect against Vibrio cholerae infections151.

Diet plays a large role in microbiota-mediated effects in the host. Probiotic and prebiotic (e.g., inulin and stachyose) treatments can be used to stimulate specific strains in the gut microbiome to produce higher levels of SCFAs21,36,37,38. Host nutrition can also be corrected through cross-feeding, where in flies, Lactobacillus and Acetobacter establish a syntrophic relationship to overcome nutrient scarcity due to an imbalanced diet61. Diet can also have a negative impact on the host, such as in the case of Chron’s disease, where catabolism of dietary serine by blooms of Escherichia coli and Citrobacter rodentium can worsen inflammatory responses39. Butyrate produced by Firmicutes members of the microbiome in response to a high carbohydrate diet is associated with the hyperproliferation of colon epithelial cells in a colorectal cancer model213. While current technologies have enabled us to unravel many of these host-microbiome interactions along multiple axes of interaction, new technologies will allow us to elucidate even more of the complex interactions underlying community metabolism, disease pathology, and dysbiosis at a molecular level.

고전적인 매개 분석 방법은 비선형 효과를 잘 모델링하지 못할 수 있지만, 파라메트릭 모델과 ML 매개 분석을 포함한 새로운 접근 방식은 통제 변수의 사전 선택 없이 고차원 데이터를 구축하는 데 유망한 결과를 보여주고 있습니다186,191,192,194,211. 이러한 흥미로운 새로운 방법론은 대규모 대사체학 연구를 통해 생성되는 미래의 데이터 세트의 양과 복잡성이 지속적으로 증가함에 따라 연구자들이 이를 처리하는 데 기여할 것입니다.

대사 과정을 통해 조절되는 호스트-미생물군집 동역학의 예시

대사체학 기술의 발전은 복잡한 호스트-미생물군집 상호작용의 분자적 기전을 분석하는 능력을 크게 확장시켰습니다. 최근 이 분야에서의 문헌이 급속히 확장되었습니다. 여기에서 제시된 작은 예시들(표 1)은 이 흥미로운 새로운 문헌을 탐구하는 출발점이 될 수 있습니다.

호스트-미생물 대사 역학은 만성 및 감염성 질환, 면역, 노화, 신경학, 생리학 등 다양한 생물학적 기능을 포함합니다

10,13,15,18,22,30,33,104,212.

이 호스트-미생물 역학의 고전적인 예시 중 하나는 장 미생물군에 의해 생성되는 SCFAs(단쇄 지방산)로, 대장염과 IBS에 대한 보호 효과를 나타냅니다10,13,15. SCFAs는 미세아교세포를 포함한 면역 세포의 성숙을 조절하며, 내장 통증 신호 전달 경로의 특성을 형성합니다10,22. 최근 연구에서는 SCFAs가 위장관 내 복구 과정을 자극하고 호스트의 염증 반응을 감소시켜 방사선 보호 효과를 발휘한다는 것이 밝혀졌습니다22,110.

기타 선택적 호스트-미생물 상호작용 사례로는 Bifidobacterium pseudolongum이 생성하는 이노신이 면역 체크포인트 차단 치료(anti-CLTA-4 치료제와 병용)에서 대장암에 대한 호스트 반응 활성화에 도움을 주는 것이 있습니다30. 또한 Clostridium sporogenes가 생성하는 페닐아세틸-글루타민과 페닐아세틸-글리신은 G-단백질 결합 수용체 조절을 통해 심혈관 질환과 연관되어 있습니다33. Lactobacillus 및 Bacteroides 미생물군 구성원은 기억력 향상이나 우울증 증상 완화 등 신경생물학적 기능 개선과 연관되어 있습니다23,159. Bacteroides는 기분과 기억 조절에 중요한 신경전달물질인 GABA를 생성할 수 있으며23, Lactobacillus 속은 젖산에 의존적으로 GABA 생성을 촉진합니다159. Lactobacillus 속은 식이 트립토판을 인돌 화합물(예: 인돌-3-황산염, 인돌-3-프로피온산, 인돌-3-알데히드)로 대사하며, 이는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE; 다발성 경화증의 대표 모델)18 및 대장암 모델212에서 아릴 하이드로카본 수용체 활성화 통해 호스트 염증에 대한 보호 효과를 발휘합니다.

미생물군은 호스트의 항상성을 조절하고 특정 병원체가 감염을 일으키는 능력을 영향을 미치는 미생물 간 상호작용에도 참여합니다. 낭포성 섬유증 감염에서 체외, 계산적, 인간 대사 프로파일링 접근법은 종합적으로 병원체 Pseudomonas aeruginosa의 우세함이 환경 내 조건부 혐기성 미생물이 생성하는 아미노산, 유기산, 알코올을 교차 영양으로 이용하는 능력에 의해驱动된다는 것을 확립했습니다24,25,28,29. Phascolarctobacterium spp.는 Clostridium difficile의 성장에 필요한 succinate를 소비함으로써 Clostridium difficile 감염에 대한 보호 효과를 발휘하며39, Bacteroides vulgatus는 SCFAs와 trimethylamines를 생성하여 Vibrio cholerae 감염에 대한 보호 효과를 나타냅니다151.

식이 요인은 호스트 내 미생물군집 매개 효과를 크게 좌우합니다. 프로바이오틱스와 프리바이오틱스(예: 인울린과 스타키오스) 치료는 장 미생물군집 내 특정 균주를 자극하여 SCFAs의 생산량을 증가시킬 수 있습니다21,36,37,38. 호스트의 영양 상태는 교차 급여를 통해 개선될 수 있으며, 파리에서 Lactobacillus와 Acetobacter는 불균형한 식이로 인한 영양소 부족을 극복하기 위해 공생 관계를 형성합니다61. 식이 요인은 호스트에 부정적인 영향을 미칠 수도 있습니다. 예를 들어 크론병의 경우, Escherichia coli와 Citrobacter rodentium의 증식으로 인한 식이 세린의 분해가 염증 반응을 악화시킬 수 있습니다39. 미생물군집의 Firmicutes 속이 고탄수화물 식이에 반응하여 생성하는 부티레이트는 대장암 모델에서 대장 상피 세포의 과도한 증식과 연관되어 있습니다213. 현재 기술은 이러한 호스트-미생물군 상호작용을 다양한 상호작용 축을 통해 규명하는 데 기여했지만, 새로운 기술은 미생물군집 대사, 질병 병리학, 불균형(dysbiosis)의 복잡한 상호작용을 분자 수준에서 더욱 명확히 밝히는 데 기여할 것입니다.

Conclusion

Over the last two decades metabolomics has matured from a largely descriptive activity into a tool for probing the molecular underpinnings of biology. Host-microbiome dynamics are some of the most complex biological systems where these tools have been applied and the biological, logistical, analytical, and computational challenges inherent to this field of research make it difficult to move beyond correlational statistics. However, recent advances in model systems, experimental strategies, analytics, and computational tools have opened the door to mechanistic insights into microbiome-mediated biological phenomena. As these approaches mature, we anticipate that we will quickly gain molecular understanding of the myriad mechanisms that the microbiome uses to modulate the host immune system and other important phenomena.

결론
지난 20년간 대사체학은 주로 설명적인 활동에서 생물의 분자적 기반을 탐구하는 도구로 발전해 왔습니다. 호스트-미생물군집 동역학은 이러한 도구가 적용된 가장 복잡한 생물학적 시스템 중 하나이며, 이 연구 분야에 내재된 생물학적, 물류적, 분석적, 계산적 도전 과제들은 상관관계 통계 beyond을 넘어서는 것을 어렵게 만들고 있습니다. 그러나 모델 시스템, 실험 전략, 분석 기술, 계산 도구 분야의 최근 진보는 미생물군집이 매개하는 생물학적 현상의 메커니즘적 이해로 나아가는 길을 열었습니다. 이러한 접근법이 성숙해감에 따라, 우리는 미생물군집이 호스트 면역 시스템을 조절하는 수많은 메커니즘과 다른 중요한 현상에 대한 분자적 이해를 빠르게 얻을 수 있을 것으로 기대됩니다.

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