백신 유발 COVID-19 모방 증후군

[이매진]

백신 유발 COVID-19 모방 증후군

https://elifesciences.org/articles/74974

Vaccine-induced COVID-19 mimicry syndrome

RNA 바이러스 SARS-CoV-2로 인한 COVID-19 팬데믹과 싸우기 위해, 주로 아데노바이러스 벡터 또는 mRNA 기반 백신으로 수십억 명의 사람들을 면역화하기 위한 글로벌 백신 접종 캠페인이 진행 중입니다. 이 백신은 모두 SARS를 암호화합니다. -CoV-2 스파이크 단백질. 드문 경우지만, 첫 백신 접종 후 4-14일 후에 발생하는 심각한 부작용으로 뇌정맥동 혈전증(CVST)이 보고되었으며 종종 혈소판 감소증을 동반했습니다. CVST 외에도 내장 정맥 혈전증(SVT) 및 기타 혈전색전증이 관찰되었습니다. 이러한 사건은 아데노바이러스 벡터 기반 백신으로 백신 접종한 후에만 발생했지만 mRNA 기반 백신으로 백신 접종한 후에는 발생하지 않았습니다. 그 동안에, 과학자들은 면역 기반의 병태기전을 제안했고 그 상태는 백신 유발 면역 혈전성 혈소판감소증(VITT)으로 만들어졌습니다. 여기서 우리는 RNA 기반 백신이 아닌 DNA 기반에서 발생하는 혈전 색전증 사건을 설명할 수 있는 예상치 못한 메커니즘을 설명합니다. 우리는 Spike 단백질을 코딩하는 DNA 인코딩 mRNA가 Spike의 transmembrane anchor가 손실되어 거의 전체 길이의 Spike가 세포에서 분비되는 방식으로 접합될 수 있음을 보여줍니다. 분비된 스파이크 변이체는 ACE2 수용체를 통해 세포에 결합할 때 잠재적으로 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 그러한 스플라이싱 사건을 피하는 것은 장래 백신의 안전성을 증가시키기 위한 합리적인 백신 설계의 일부가 되어야 합니다. 우리는 Spike 단백질을 코딩하는 DNA 인코딩 mRNA가 Spike의 transmembrane anchor가 손실되어 거의 전체 길이의 Spike가 세포에서 분비되는 방식으로 접합될 수 있음을 보여줍니다. 분비된 스파이크 변이체는 ACE2 수용체를 통해 세포에 결합할 때 잠재적으로 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 그러한 스플라이싱 사건을 피하는 것은 장래 백신의 안전성을 증가시키기 위한 합리적인 백신 설계의 일부가 되어야 합니다. 우리는 Spike 단백질을 코딩하는 DNA 인코딩 mRNA가 Spike의 transmembrane anchor가 손실되어 거의 전체 길이의 Spike가 세포에서 분비되는 방식으로 접합될 수 있음을 보여줍니다. 분비된 스파이크 변이체는 ACE2 수용체를 통해 세포에 결합할 때 잠재적으로 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 그러한 스플라이싱 사건을 피하는 것은 장래 백신의 안전성을 증가시키기 위한 합리적인 백신 설계의 일부가 되어야 합니다.편집자 평가

이 원고에서 저자는 아데노바이러스 기반 현재 백신에서 스플라이스 반응의 발생에 대한 증거를 제공하여 DNA 기반 COVID에 대해 보고되었지만 RNA 기반 COVID에 대해서는 보고되지 않은 혈전색전증 사건의 잠재적인 메커니즘을 제공하는 잘린 스파이크 변형의 분비를 초래합니다. -19 백신.

https://doi.org/10.7554/eLife.74974.sa0

• 결정서 
• eLife의 검토 프로세스

소개

COVID-19 팬데믹은 2019년 말 중국 우한에서 시작하여 RNA 바이러스 SARS-CoV-2로 인해 지금까지(2022년 1월 4일) 2억 9,300만(Mio) 이상의 감염을 일으켰습니다. 546만 명 이상의 사망자(데이터 출처: https://www.worldometers.info/coronavirus/). 세계는 가장 빠른 백신 개발 및 생산에 직면하여 규제 기관의 조건부 시장 승인을 받은 총 4개의 백신이 탄생했습니다. Moderna(mRNA-1273/Spikevax; EMA: 6.1.21), AstraZeneca(AZD1222/ChAdOx1-S/Vaxzevria; EMA: 29.1.21) 및 Janssen(Ad26.COV2.S; EMA: 11.3.21). 4가지 백신 모두 약간 다른 형태의 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질을 암호화하며, 이는 바이러스가 숙주 세포막에 결합하고 각각 ACE2 및 TMPRSS2를 통한 진입을 매개합니다(Hoffmann et al., 2020 ) .

바이오엔텍과 모더나 백신은 대부분 경미하고 전형적인 즉각 접종 부작용만 일으키는 반면, 중증 부작용 혈전증(ITP)이나 혈소판감소증후군(TTS)을 동반한 혈전증은 유럽(2021년 3월)에서 백제브리아에서 처음 관찰됐다. 가장 심각한 부작용은 대뇌 정맥동 혈전증(CVST)과 결합된 혈소판 감소증의 드문 사례를 수반했습니다. 예상보다 높은 CVST 발생으로 인해 여러 유럽 국가(2021년 3월 11~14일: 덴마크, 여러 북유럽 국가, 태국, 아일랜드; 2021년 3월 15일: 독일, 이탈리아, 프랑스)에서 Vaxzevria 백신 접종 캠페인이 급속히 중단되었습니다. , 및 스페인).

독일 Paul-Ehrlich-Institute의 보안 감시에서 얻은 최신 데이터(2021년 12월 23일 보고서; https://www.pei.de/DE/newsroom/dossier/coronavirus/sicherheitsbericht-covid-19-impfstoffe -aktuell.html )는 다른 백신과 비교하여 AstraZeneca 백신의 위험이 여전히 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다( 표 1 참조).). 혈소판감소증 및 면역혈소판감소증(ITP)은 Comirnaty로 96.6 Mio 백신접종 후 314건(Mio 주사당 3.3건), Comirnaty로 10.5 Mio 백신접종 후 Spikevax로 28건(Mio 주사당 2.6건), Vaxzevria는 1,270만 건의 백신 투여 사례(Mio 주사당 21.2건), Ad26.COV2.S의 23건에서는 3백4십만 건의 백신 접종 후 사례(Mio 주사당 6.6건)입니다. 이 4가지 백신의 혈전증 관련 사망 사례는 각각 74, 6, 81 및 12였습니다. 이것은 사례 사망률과 관련된 혈전 색전증 사건이 21.4-52% 범위에 있음을 나타냅니다( 표 1 참조 ).

1 번 테이블

2021년 12월 23일자 독일 Paul-Ehrlich Institute(PEI)의 안전성 데이터.

네 가지 백신 모두에 대한 모든 데이터는 보안 보고서에서 직접 검색되었습니다. 모든 예방 접종 수, 합병증이 있는 총 사례, 아나필락시스 사례, 근/심낭염 사례, …더보기

회사바이오테크/화이자모더나옥스퍼드/AZ얀센/J&J

#예방접종	96.606.131	10.576–131	12.703.030	3.462.557
#복잡증	113.792	28.289	46.325	7.758
미오주사당 건수	1.178	2.675	3.647	2.241
아나필락시스	550	55	101	10
미오주사당 건수	5,7	5.2	8.0	2,9
근/심낭염	1245년	309	0	0
미오주사당 건수	12.9	29.2	0	0
TTS	36	5	200	24
미오주사당 건수	0.4	0.5	15.7	6.9
ITP	314	28	269	23
미오주사당 건수	3.3	2.6	21.2	6.6
GBS	140	14	112	48
미오주사당 건수	1.4	1.3	8.8	13.9
사망 사례	295	20	201	21
미오주사당 건수	3.1	1.9	15.8	6.1

TTS는 36, 5, 200 및 24명의 환자에서 이 4가지 백신에 대해 관찰되었으며, 이는 Mio 주사당 0.4, 0.5, 15.7 및 6.9 사례의 상대적 위험을 나타냅니다. 혈소판감소증과 조합된 이러한 혈전색전증 사건은 '헤파린 유발 혈소판감소증'(HIT)이라는 또 다른 상태와 유사성을 공유합니다. '백신 유발 면역 혈전성 혈소판감소증'(VITT)이라는 용어는 혈소판 인자 4(PF4)에 대한 자가항체가 인과적으로 연관될 수 있음을 발견한 후 이 백신 유발 상태에 대해 만들어졌습니다( Greinacher et al., 2021b ; Greinacher 외, 2021a ). 그러나 많은 실험실의 집중적인 연구 활동에도 불구하고 관찰된 부작용의 근본적인 시작 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.

승인된 백신의 분자 전달 메커니즘에는 mRNA 기반 백신과 아데노바이러스 벡터 기반 백신 간에 근본적인 차이가 있습니다. mRNA 백신은 이름에서 알 수 있듯이 스파이크 서열을 지질 나노입자에 캡슐화된 수정된 RNA 서열로 암호화합니다. 근육 주사 시 나노입자는 세포에 의해 흡수되고 여기서 mRNA 화물은 세포질로 방출됩니다. 두 mRNA 백신 모두 신호 펩타이드를 암호화하기 때문에 단백질 번역 과정은 거친 소포체(ER)에서 일어나 막 고정 스파이크 단백질을 생성합니다. 스파이크 단백질 트리머가 소낭에서 외부 세포막으로 수송되는 ER 및 골지체(당화)에서 추가적인 번역 후 변형이 발생합니다.

대조적으로, 아데노바이러스 벡터 기반 백신은 스파이크 서열을 RNA 서열 대신 코돈 최적화된 DNA 서열로 전달합니다. Vaxzevria는 유전적으로 변형된 침팬지 아데노바이러스 Y25형을 기반으로 하는 반면 Janssen 백신은 인간 아데노바이러스 26형(HAdV-D26)을 기반으로 하며 둘 다 복제 능력이 없습니다. 숙주 세포의 형질 도입 및 벡터 입자의 분해 시 선형 이중 가닥 DNA가 방출되어 핵으로 들어갑니다. 이어서, 바이러스 DNA 암호화 유전자는 숙주 세포 전사 기계를 사용하여 전사됩니다( Doerfler and Böhm, 2003). 핵에서 mRNA가 번역을 위해 세포질로 보내지기 전에(위 참조) 생성된 RNA 분자는 접합 가능성을 포함하여 내인성 1차 전사체와 동일한 전사 후 RNA 처리 기계에 종속됩니다.

SARS-CoV-2는 자연적으로 순수한 세포질 복제 주기를 갖는 베타코로나바이러스 계열의 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 따라서 코로나바이러스는 핵에서 일어나는 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는 진화 압력에 노출되지 않았습니다. 거의 모든 핵 암호화 유전자는 스플라이스 기계에 의해 전구체 RNA 전사체에서 제거되는 인트론을 포함합니다( Lee and Rio, 2015). 정의된 RNA 컨센서스 서열은 거의 100개의 단백질과 특정 U-RNA로 구성된 RNA/단백질 복합체(spliceosome)에 의해 인식됩니다. 주목할 만한 것은 스플라이스 이벤트가 스플라이스 활성화 또는 억제 단백질에 결합하는 엑소닉 스플라이스 인핸서 서열 및 엑소닉 스플라이스 소음기 서열의 영향을 받는다는 것입니다. 이 진화적으로 보존된 스플라이스 과정 동안 소위 '브랜치 A' 뉴클레오티드는 5'-스플라이스 컨센서스 시퀀스 G•GUNNGU의 G•G-디뉴클레오티드에서 친핵성 공격을 수행합니다. 최종 엑소닉 G 뉴클레오티드의 생성된 3'-OH는 3'-스플라이스 컨센서스 시퀀스 YYYYYCAG•G의 G•G-디뉴클레오티드에서 두 번째 친핵성 공격을 합니다. 이를 위해 두 개의 엑손이 융합되고 인트론 서열이 제거됩니다. 각각의 유전자에 대해,

분자생물학이나 생명공학에서 클로닝된 cDNA를 사용할 때 cDNA 합성은 이미 스플라이싱된 mRNA 분자에서 이루어지기 때문에 일반적으로 인트론 서열이 존재하지 않습니다. 그러나 SARS-CoV-2 바이러스의 경우 Spike 오픈 리딩 프레임용으로 복제된 cDNA는 핵으로 암호화된 유전자에서 나온 것이 아니라 감염된 세포의 세포질에서만 복제되는 RNA 바이러스에서 나온 것입니다. 따라서 그러한 cDNA는 우연히 잠재적인 SD 및 SA 부위를 나타냅니다(전체 SARS-CoV-2 바이러스 서열에서 ~130개의 비밀 스플라이스 신호 서열). 왜냐하면 코로나바이러스가 진화하는 동안 그러한 서열을 제거하기 위해 음성 선택이 일어난 적이 없기 때문입니다. . 따라서 우리는 DNA로 암호화된 스파이크 RNA 서열의 핵 스플라이싱이 스플라이싱되어 알려지지 않은 운명과 기능을 가진 절단된 스파이크 단백질 변이체를 초래할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 위에서 언급했듯이 이러한 유형의 스플라이싱은 RNA 바이러스 자체가 다양한 열린 해독 프레임에 인트론 서열을 포함하지 않기 때문에 매우 인위적입니다. 따라서 이러한 모든 스플라이싱 이벤트는 소위 비밀 스플라이스 사이트에서 파생됩니다. 이것은 기능적으로 우리 게놈의 특정 유전자에 기인할 수 있는 대체 스플라이싱의 메커니즘과 관련이 없습니다. 비밀 스플라이싱은 강력한 스플라이스 사이트가 존재할 때만 발생하므로 이러한 비밀 스플라이스 사이트는 다른 세포 유형이나 조직에서 동일하게 사용됩니다. 이는 우리 게놈의 특정 유전자에 기능적으로 기인할 수 있습니다. 비밀 스플라이싱은 강력한 스플라이스 사이트가 존재할 때만 발생하므로 이러한 비밀 스플라이스 사이트는 다른 세포 유형이나 조직에서 동일하게 사용됩니다. 이는 우리 게놈의 특정 유전자에 기능적으로 기인할 수 있습니다. 비밀 스플라이싱은 강력한 스플라이스 사이트가 존재할 때만 발생하므로 이러한 비밀 스플라이스 사이트는 다른 세포 유형이나 조직에서 동일하게 사용됩니다.

숨겨진 스플라이싱에 대한 이 문제를 해결하기 위해 특별히 설계된 스플라이스 리포터 벡터 시스템에서 핵으로 전사된 야생형 및 코돈 최적화 스파이크 유전자를 분석했습니다. 우리는 또한 스파이크 발현 인간 아데노바이러스 5형 벡터와 두 개의 승인된 아데노바이러스 벡터 기반 백신 ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S로 대표 세포를 형질도입한 후 스파이크 RNA의 스플라이싱을 조사했습니다. 여기서 우리는 DNA로 인코딩된 SARS-CoV-2 Spike RNA 분자의 스플라이싱이 in silico 분석에 의해 예측된 위치에서 일어난다는 것을 보여줍니다. 이러한 스플라이스 사건은 막횡단(TM) 앵커가 결여된 스파이크 단백질 변이체를 초래하여 분비 경로의 특성으로 인해 분비될 수 있습니다. 발현 수준을 향상시키기 위해 수행된 코돈 최적화는 스플라이싱의 풍부함을 추가로 증가시켰고 ChAdOx1-S 벡터에 대해 가장 두드러지게 관찰되었습니다. 또한 스파이크 단백질의 생산과 외부 배지로의 분비를 분석하였다. 벡터 기반 백신의 안전성에 대한 연구 결과의 시사점과 RNA 바이러스용 벡터 기반 백신 설계에 대한 향후 결과에 대해 논의할 것입니다.

결과

in silico 분석은 아데노 바이러스 벡터 인코딩 스파이크 시퀀스에서 잠재적인 스플라이스 사이트를 밝힙니다.

우한 SARS-CoV-2 격리체의 Spike 오픈 리딩 프레임은 사용 가능한 SpliceRover 온라인 도구를 사용하여 잠재적인 스플라이스 사이트에 대해 테스트되었습니다( Zuallaert et al., 2018 ). 또한 온라인 ASSP(Alternative Splice Site Predictor) 도구를 사용하여 예측된 접합 부위를 확인했습니다(데이터는 표시되지 않음). 두 서버 모두 Spike 유전자의 3822개 뉴클레오티드 길이 오픈 리딩 프레임에서 수십 개의 잠재적인 스플라이스 사이트를 식별했습니다. 따라서 우리는 더 높은 가능성으로 사용된 것을 식별하기 위해 개별 점수로 이러한 히트를 필터링하기로 결정했습니다(야생형 스파이크 유전자: 6개의 스플라이스 공여자[SD] 사이트, 5개의 스플라이스 수용체[SA] 사이트, 그림 1 및 표 2A 참조 ) ).

그림 1

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스파이크 오픈 리딩 프레임 내 스플라이스 사이트 예측.

접합 부위 예측은 SpliceRover를 이용하여 수행하였다. 스플라이스 기증자 사이트는 빨간색으로, 스플라이스 수용자 사이트는 녹색으로 표시됩니다. SpliceRover는 0과 1 사이의 점수로 스플라이스 사이트를 계산합니다. …더보기

표 2

스플라이스 기증자 사이트 예측.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 오픈 리딩 프레임은 Splice Site Predictor 온라인 도구 SpliceRover( http://bioit2.irc.ugent.be/rover/splicerover ) 로 분석했습니다 . 이 온라인 도구는 …더보기

위치잠재적 스플라이스 기증자 사이트점수유형

A: 야생형 스파이크 ORF에서 스플라이스 기증자 위치 예측
454–473	TGGATGGAAA•GTGAGTTCAG	0.187	+1
541–560	GGAAACAGG•GTAATTTCAA	0.151	+1
894–911	GAAACAAAGT•GTACGTTGAA	0.565	+1
1323년–1342년	TGATTCTAAG•GTTGGTGGTA	0.357	0
1906년–1925년	TATTCTACAG•GTTCTATTFT	0.274	+1
1996–2015	ATTGGTGCAG•GTATATGCGC	0.707	+1
3296–3317	GCACACACTG•GTTTGTAACA	0.160	+2
의견 일치	MAG•GTNNGTG
B: Ad5의 코돈-최적화된 스파이크 ORF에서 스플라이스 공여자 위치 예측
497–516	GCACCTTCGA•GTACGTGTCC	0.987	+2
1175년–1194년	TCACAAACGT•GTACGCCGAC	0.187	+2
1209년–1228년	GGGAGATGAA•GTGCGGCAGA	0.162	0
1812년~1831년	CTCCAACCAG•GTGGCCGTGC	0.540	0
2331년–2350년	CACCCAAGAG•GTGTTCGCCC	0.204	0
2949년–2968년	ACTGGACAAG•GTGGAAGCCG	0.318	0
2961년~2980년	GGAAGCCGAG•GTGCAGATCG	0.151	0
3083–3102	AGATGTCTGA•GTGTGTGCTG	0.318	+2
3296–3315	GCACCCATTG•GTCCGTGACC	0.388	+2
3452–3471	AACTGGATAA•GTACTTTAAG	0.443	+2
3555–3574	GCTGAACGAG•GTGGCCAAGA	0.217	0
3605–3624	AACTGGGGAA•GTACGAGCAG	0.800	+2
C: ChAdOx1-S의 코돈 최적화된 스파이크 ORF에서 스플라이스 기증자 위치 예측
497–516	GCACCTTCGA•GTACGTGTCC	0.986	+2
1012년–1030년	TTCGGCGAG• GTGTTCAATG	0.266	0
1175년–1194년	TCACAAACGT•GTACGCCGAC	0.177	+2
1209년–1228년	GGGAGATGAA•GTGCGGCAGA	0.188	0
1812년~1831년	CTCCAACCAG•GTGGCCGTGC	0.541	0
2331년–2350년	CACCCAAGAG•GTGTTCGCCC	0.215	0
2949년–2968년	ACTGGACAAG•GTGGAAGCCG	0.398	0
2961년~2980년	GGAAGCCGAG•GTGCAGATCG	0.273	0
3083–3102	AGATGTCTGA•GTGTGTGCTG	0.503	+2
3296–3315	GCACCCATTG•GTCCGTGACC	0.381	+2
3452–3471	AACTGGATAA•GTACTTTAAG	0.245	+2
3555–3574	GCTGAACGAG•GTGGCCAAGA	0.310	0
3605–3624	AACTGGGGAA•GTACGAGCAG	0.686	+2
D: Ad26.COV2.S의 코돈-최적화된 스파이크 ORF에서 스플라이스 공여자 부위 예측
563–582	ACCTGCGCGA•GTTCGTGTTC	0.150	+2
1175년–1194년	TCACAAACGT•GTACGCCGAC	0.180	+2
1209년–1228년	GGGAGATGAA•GTGCGGCAGA	0.207	0
1812년~1831년	CAGCAATCAG•GTGGCAGTGC	0.547	0
2331년–2350년	CACCCAAGAG•GTGTTCGCCC	0.202	0
2961년~2980년	TGGGCCGAG•GTGCAGATCG	0.194	0
3083–3102	AGATGTCTGA•GTGTGTGCTG	0.495	+2
3296–3315	GCACCCATTG•GTTCGTGACA	0.392	+2
3452–3471	AACTGGACAA•GTACTTTAAG	0.436	+2
S1 엑토도메인: 뉴클레오티드 1–2049(aa 1–683 ) 에 의해 암호화됨
S2 도메인: 뉴클레오티드 2050–3822(aa 684–1273 ) 에 의해 암호화됨
ACE2 결합 도메인 : 뉴클레오티드 998–1720(aa 319–551 ) 에 의해 암호화됨

마찬가지로 세 가지 다른 아데노바이러스 벡터 시스템에서 코돈 최적화 스파이크 오픈 리딩 프레임에 대해서도 동일한 in silico 분석을 수행했습니다. 첫째, 이들은 인간 아데노바이러스 5형 벡터 백본(Ad5.S)에 클로닝된 원래 우한 서열의 실험적이고 코돈 최적화된 변이체였습니다. 둘째, ChAdOx1-S의 스파이크 서열은 Vaxzevria에서 분리한 아데노바이러스 DNA의 시퀀싱에 의해 유도된 반면, 셋째, Ad26.COV2.S의 스파이크 서열은 Janssen(Roland Zahn에서 친절하게 제공)에서 직접 얻었습니다. 분석 결과 코돈 최적화로 인해 아데노바이러스로 인코딩된 스파이크 시퀀스 3개(Ad5.S: 12 SD 사이트, 10 SA 사이트, ChAdOx1-S: 13 SD 및 5 SA 사이트, Ad26.COV2)에서 잠재적 스플라이스 사이트 수가 증가한 것으로 나타났습니다. S: 9개의 SD 및 10개의 SA 사이트, 표 2B–D 참조) 야생형 우한 SARS-CoV-2 스파이크 시퀀스의 오픈 리딩 프레임과 비교했습니다.

코돈 최적화 스파이크 서열의 중요한 스플라이싱

첫째, 우리는 예측에 따라 6개의 잠재적 SD 사이트를 포함하는 야생형 Spike의 오픈 리딩 프레임 내에서 잠재적 스플라이스 이벤트를 분석했습니다. 이러한 스플라이스 신호 서열은 모든 SD 사이트가 SA 사이트의 상류에 위치하는 정상적인 유전자에서처럼 발생하지 않기 때문에, SD 사이트와 같은 인트론 서열의 측면은 모두 '불포화' 상태이며 일반적으로 시스 또는 트랜스 에서 숨겨진 스플라이스 반응을 일으킵니다 . 잠재적 SA( Kowarz et al., 2011). 이를 위해 스파이크 시퀀스가 ​​완벽한 SA 사이트의 업스트림에 삽입된 3개의 스플라이스 트랩을 생성했으며, 이는 시작 없이 전장 루시퍼라제 유전자에 대한 3개의 다른 판독 프레임(0, +1, +2)에서 다시 융합되었습니다. 코돈. 이 시스템에서 Luciferase 활성은 splicing이 발생하는 경우에만 감지됩니다. 각각의 작제물을 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터(pSBbi::Spike-Luc-0/+1/+2 GP)에 클로닝하고 HEK293T 세포의 안정적인 형질감염에 사용했습니다.

루시퍼라제 분석에서 3개의 스플라이스 트랩 구조물 모두를 분석한 결과, '+2 구조물'이 가장 강력한 세포내 루시퍼라제 활성(1291 상대 광 단위)을 나타내는 반면, '0 구조물'은 훨씬 더 낮은 활성(341 상대 광 단위)을 나타냈습니다. +1 작제물에 대해 결정된 활성은 음성 대조군으로 작용한 형질감염되지 않은 HEK293T 세포에 대한 값에 가깝습니다( 도 2 , 패널 I 참조). 또한 배양된 세포의 배지를 분석하여 소량의 루시페라아제 활성이 세포외에도 존재함을 관찰했습니다. 이 양은 시간이 지남에 따라 증가했으며 세포 내에서 관찰된 세 가지 구조물의 상대적 비율을 모방했습니다( 그림 2 참조)., 패널 II, III). 3개의 스플라이스 트랩의 설계로 인해 루시페라아제 활동은 스플라이싱이 발생할 때만 감지할 수 있습니다. 따라서, 이러한 초기 루시퍼라제 실험은 스파이크 서열의 스플라이싱이 일어나고 있음을 확인했습니다. 스파이크 오픈 리딩 프레임의 SD와 스플라이스 트랩의 SA 사이에 스플라이싱이 발생하면 멤브레인 앵커 역할을 하는 스파이크 단백질의 C-말단에 위치한 TM 도메인이 손실됩니다. 따라서 결과적으로 잘린 스파이크 단백질이 분비될 수 있습니다.

그림 2

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HEK293T 세포에서 스플라이스 트랩 루시페라제 실험.

3개의 상이한 스플라이스 트랩을 pSBbi-GP 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터는 2개의 폴리시스트론 전사체를 인코딩하며, 하나는 GFP 및 퓨로마이신 내성(왼쪽에서 오른쪽으로)을 인코딩하는 반면 …더보기

우리는 또한 아데노바이러스 벡터(Ad5.S, ChAdOx1-S, Ad26.COV2.S)의 코돈 최적화 스파이크 유전자 3개를 루시퍼라제 스플라이스 트랩(0/+1/+2)의 세 가지 버전으로 클로닝하고 Spike-Luciferase 융합 단백질 생산. 여기에서는 세포 내 루시페라제 활성만 분석했습니다( 그림 2 참조)., 패널 IV-VI). 상이한 아데노바이러스 벡터로부터 유래된 3개의 코돈-최적화 스파이크 유전자 모두는 야생형 스파이크 서열 구조물과 비교하여 또한 강화된 스파이크-루시퍼라제 융합 단백질의 강력한 생산을 나타냈다. 따라서, 모든 코돈-최적화 스파이크 유전자는 야생형 스파이크 유전자 서열보다 더 높은 스플라이싱 활성을 나타냈다. 15,840 상대 광 단위의 가장 높은 활성은 ChAdOx1-S 구조의 판독 프레임 +1에서 감지되었습니다. 가장 낮은 수준의 루시페라제 활성은 Ad26.COV2.S 구조물에서 발견되었습니다.

우리는 또한 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 세포내에서 생성된 아데노바이러스 벡터로 인코딩된 스파이크 단백질 변이체와 스파이크-루시퍼라제 융합 단백질의 정상 상태 수준을 결정했습니다. 포획을 위한 단백질 G 비드 및 항-FLAG 항체를 사용하는 스파이크-면역침전 실험을 위해 세포주의 세포 용해물 및 상청액을 사용하였다. 이어서, 항-스파이크 및 항-루시퍼라제 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 샘플을 분석하였다. 그림 3 과 같이, 분석된 모든 스파이크 스플라이스 트랩에 대해 크기가 95-250 kDa인 단백질의 강한 신호가 두 항체가 있는 세포 용해물에서 검출되어 서로 다른 길이의 스파이크-루시퍼라제 융합 단백질을 확인했습니다. 조사된 각 세포주의 세포 용해물 및 배지 상청액은 조사된 각 세포주에서 주요 스플라이스 사건에 의해 예측된 바와 같이 분자량에서 이동하는 여러 단백질 밴드를 나타냈습니다(Ad5.S 195.1 및 195.3 kDa; ChAdOX1-S 195.1 및 195.3 kDa; Ad26 .COV2.S 196.4 kDa; 모두 글리코실화 없음).

그림 3

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HEK293T 세포에서 스플라이스 트랩 웨스턴 블롯 실험.

스파이크 및 스파이크-융합 단백질은 스플라이스 트랩으로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포의 모든 세포 용해물 및 상층액의 면역 침전 비드의 도움으로 농축되었습니다.더보기

야생형 및 코돈 최적화된 스파이크 오픈 리딩 프레임 유래의 다양한 스플라이스 산물 검증

분자 수준에서 이러한 결과를 확인하기 위해 세 가지 야생형 스파이크 인코딩 스플 라이스 트랩 구조로 형질 감염된 세포주에서 RNA를 분석했습니다. 잠재적 스플라이스 이벤트는 5'-프라임을 가리키는 하나의 루시퍼라제 프라이머에 대해 3'-프라임을 가리키는 4개의 스파이크 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 실험에 의해 가시화되었습니다. 편차가 있는 모든 PCR 밴드는 Sanger 시퀀싱으로 분석했습니다( 그림 4 , 아가로스 겔 참조). 도 4 에 도시된 바와 같이 , 우리는 예측된 스플라이스 사이트(예: SD1-3)로부터의 여러 스플라이스 반응뿐만 아니라 프레임 이동 이벤트로 이어지는 내부 스플라이스 반응도 관찰했습니다. 우리는 또한 스파이크와 루시페라아제 사이의 융합을 다시 초래하는 ACE2 결합 도메인의 하류에서 두 개의 스플라이스 이벤트를 발견했습니다.

그림 4

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HEK293T 세포의 형질감염 후 스플라이스 이벤트.

야생형 SARS-CoV-2 스파이크 유전자(3개의 스플라이스 트랩 구조에 클로닝됨)는 HEK293T 세포에서 안정적으로 형질감염되었으며, RNA는 분리되었고 스플라이싱에 대한 RT-PCR 실험으로 조사되었습니다 …더보기

관찰된 스파이크 mRNA의 스플라이싱이 루시페라제 판독 프레임의 5'-말단에서 매우 강력한 SA 부위를 갖는 인공 스플라이스 트랩 구조의 사용으로 인한 아티팩트임을 배제하기 위해 실제 아데노바이러스 벡터 Ad5를 사용하여 분석을 반복했습니다. .S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S. 여기에서 스파이크 서열은 아데노바이러스 pIX의 바로 업스트림인 아데노바이러스 DNA 게놈에 내장되어 있습니다. 바이러스 캡시드의 일부인 pIX는 주로 바이러스 입자의 안정성을 증가시키는 '시멘트' 단백질로서의 구조적 기능을 가지고 있지만 바이러스 수명 주기에서 추가 기능도 가지고 있습니다( Parks, 2005).). 세 가지 다른 아데노바이러스 유형의 pIX 전사 단위의 5'-비암호화 서열은 pIX 프로모터 뒤에 고도로 보존된 SA 부위와 pIX ATG 시작 코돈(뉴클레오티드 -14의 Ad5.S pIX, ChAdOx1-S 뉴클레오티드 -4의 pIX, 뉴클레오티드 -5의 Ad26.COV2.S pIX). 야생형 아데노바이러스에서 이 부위는 아데노바이러스 E1B RNA 처리 중에 자연적으로 SA로 사용됩니다. 스파이크 서열과 아데노바이러스 pIX 사이의 잠재적 스플라이싱을 조사하기 위해 HeLa 및 HepG2 세포를 아데노바이러스 벡터 Ad5.S, ChAdOx1-S 또는 Ad26.COV2.S로 형질도입했습니다. 서로 다른 아데노바이러스 벡터 유형과 유사한 세포 도입 효율을 달성하기 위해 서로 다른 아데노바이러스 벡터의 필요한 감염 다중도(MOI)를 결정하기 위해 각 세포주에 대한 선행 흡수 분석을 수행했습니다(그림 8). 형질도입 2일 후, 총 RNA를 세포로부터 추출하고 범용 pIX 역방향 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하여 스파이크 코딩 RNA와 pIX 전사체의 다양한 위치 사이의 스플라이스 이벤트를 검출했습니다. 에 표시된 바와 같이도 5 및 6 , 도 7은 상이한 아데노바이러스 벡터 백본의 3개의 모든 스파이크 유전자가 아데노바이러스 pIX 전사체에 대한 스플라이스 이벤트를 나타내었다. 주목할만한 것은, 모든 스파이크 유전자가 폴리아데닐화 과정을 시작해야 하는 폴리(A) 신호 서열을 포함하고 있지만, 모든 경우에 우리는 감지된 스플라이스 이벤트가 발생하도록 하는 전사 판독을 관찰했습니다. 반복적으로 식별된 스플라이스 이벤트만 그림 5 — 7 에 표시됩니다.. Ad5.S 스파이크 유전자는 벡터 백본의 pIX 전사체 내의 SA에 대한 위치 506, 1821, 3610*, 3,614 및 3641*에서 우세한 스플라이스 이벤트를 표시했습니다(별표가 있는 숫자는 SpliceRover에 의해 예측되지 않음). ChAdOx1-S 스파이크 유전자는 위치 506, 1049*, 1914*, 3610*, 3614 및 -298* 및 -84*에서 우세한 스플라이스 이벤트를 표시했습니다. 후자의 두 스플라이스 이벤트는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리(A) 신호 298 및 pIX 시작 코돈의 84 뉴클레오티드 업스트림에 위치한 SD를 포함합니다. 마지막으로, Ad26.COV2.S 스파이크 유전자는 뉴클레오티드 541*, 959*, 1184, 1221*, 3641* 및 -83*에서 발생하는 약한 스플라이스 이벤트를 표시했습니다. 또한 여기서 하나의 스플라이스 이벤트는 pIX 시작 코돈의 -83 뉴클레오티드 업스트림에 위치한 유인원 바이러스 40(SV40) 폴리(A) 신호 서열의 SD와 관련이 있습니다.

그림 5

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HeLa 세포의 Ad5.S 형질도입 후 스플라이스 이벤트.

HeLa 또는 HepG2 세포를 아데노바이러스 벡터 Ad5.S로 형질도입하고 RNA를 형질도입 48시간 후에 분리하였다. Spike 내의 세 가지 다른 위치에 결합하는 세 가지 범용 프라이머…더보기

그림 6

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HeLa 또는 HepG2 세포의 ChAdOx1-S 형질도입 후 접합 이벤트.

HeLa 또는 HepG2 세포를 아데노바이러스 벡터 Ad5.S로 형질도입하고 RNA를 형질도입 48시간 후에 분리하였다. 스파이크 유전자 내의 세 가지 다른 위치에 결합하는 세 가지 범용 프라이머…더보기

그림 7

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HeLa 또는 HepG2 세포의 Ad26.COV2.S 형질도입 후 스플라이스 이벤트.

HeLa 또는 HepG2 세포를 아데노바이러스 벡터 Ad5.S로 형질도입하고 RNA를 형질도입 48시간 후에 분리하였다. Spike 내의 세 가지 다른 위치에 결합하는 세 가지 범용 프라이머…더보기

ChAdOx1-S Spike RNA splicing의 우세하고 세포 유형에 따른 유병률

아데노바이러스 벡터로 암호화된 스파이크와 인접한 아데노바이러스 단백질 pIX 전사물 사이에서 관찰된 스플라이싱의 이전 분석을 검증하기 위해 Ad5.S, ChAdOx1-S를 사용하여 동일한 효율로 형질도입된 HeLa 세포의 cDNA 샘플에 대해 추가 PCR을 수행했습니다(그림 8 및 9 ) . , 및 Ad26.COV2.S 벡터. Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26에 대해 DNA 단편 길이가 1802, 2037 및 1865bp인 스파이크 서열에 결합하는 정방향 프라이머 및 3개의 벡터 판독 이벤트 모두에 대해 밝혀진 pIX 서열에 결합하는 역방향 프라이머를 사용합니다. .COV2.S, 각각( 그림 9, 녹색 화살표). Ad26.COV2.S-형질전환된 HeLa 세포에서는 절단된 cDNA 단편이 검출되지 않았지만, Ad5.S- 및 ChAdOx1-S-형질전환된 HeLa 세포 샘플의 PCR 증폭은 더 짧은 길이의 추가 DNA 밴드를 보여 판독 내의 다른 위치에서 스플라이싱을 확인했습니다. - 시퀀스를 통해. 흥미롭게도, Ad5.S-형질도입 샘플의 가장 짧은 DNA 조각의 시퀀싱( 그림 9 , 빨간색 화살표)은 스플라이싱이 스파이크 단백질의 TM 도메인 업스트림의 예측된 SD 사이트에서 프레임 업스트림의 SA 사이트로 프레임 내에서 발생했음을 보여주었습니다. pIX 시작 코돈( 도 5 , nt 3610의 스플라이스 부위)은 잠재적으로 분비된 융합 단백질을 생성합니다. 유사한 결과가 ChAdOx1-S-형질도입 샘플의 가장 짧은 DNA 조각의 시퀀싱에서 얻어졌습니다( 그림 9A).: 파란색 화살표): 스파이크 단백질의 TM 상류의 예측된 SD 부위( 도 6 , nt 3610의 스플라이스 부위)와 pIX 시작 코돈의 상류 SA 부위( 도 9F ) 사이에서 스플라이싱이 일어났다 . 그러나, 이러한 스플라이싱 이벤트는 정지 코돈의 생성을 초래하여, 융합되지 않고 분비되지만 절단된 단백질은 TM 도메인의 결여로 인해 번역될 것이다. ChAdOx1-S 샘플에서 가장 풍부한 DNA 조각의 시퀀싱( 그림 9 , 흰색 화살표)은 BGH poly(A) 꼬리 내 예측된 SD 사이트에서 pIX 시작 코돈의 SA 사이트 업스트림으로의 스플라이싱을 나타냈습니다( 그림 6 , 스플 라이스 사이트 nt –298에서).

그림 8

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동일한 형질도입 효율을 달성하기 위해 다양한 벡터 균주에 필요한 감염 다중도(MOI) 분석.

HeLa, HepG2 및 C2C12 세포는 Ad5.S, ChAdOx1-S 또는 Ad26.COV2.S의 표시된 물리적 MOI로 형질도입되었습니다. 세포를 37°C에서 2시간 동안 벡터와 함께 인큐베이션하고 수확하였다. 총 DNA는 …더보기

그림 9

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ChAdOx1.S 스파이크 서열의 세포 유형 의존적이고 우세한 스플라이싱.

( A ) HeLa, ( B ) HepG2 및 ( C ) C2C12 세포는 코돈 최적화 스파이크 서열을 암호화하는 아데노바이러스 벡터 Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S로 동일한 효율로 형질도입되었습니다. 총 RNA …더보기

PCR로 생성된 DNA의 총량을 비교하면 ChAdOx1-S로 변환된 HeLa 샘플보다 Ad5.S로 변환된 HeLa 샘플에 대해 훨씬 더 높은 Spike-pIX 판독 복사 수(및 후속 잠재적 스플라이싱)가 나타납니다(부피가 2.5배 더 적음에 유의하십시오). Ad5.S에 대해 PCR 샘플의 2개를 로딩했습니다( 도 9A ). 두 벡터의 발현 카세트가 동일한 hCMV 프로모터의 제어를 받기 때문에 이 데이터는 ChAdOx1-S의 BGH poly(A)가 Ad5.S의 SV40 poly(A)보다 read-through 전사를 방지하는 데 더 강력함을 시사합니다. pIX 유전자로.

흥미롭게도, 다른 조직 기원의 세포, 특히 인간 간세포 세포주 HepG2 및 뮤린 C2C12 근세포의 사용은 스플라이싱 사건의 풍부함이 세포 유형 의존적이라는 것을 입증했습니다. Ad5.S-형질도입된 C2C12 세포의 cDNA 샘플에서 전체 길이 판독 단편만 검출되었으며 이는 스플라이싱이 전혀 없음을 나타냅니다( 그림 9C : 녹색 화살표). 대조적으로, ChAdOx1-S-형질도입된 C2C12 세포의 경우 거의 독점적으로 BGH-pIX 스플라이스 생성물이 검출되었다( 도 9C : 흰색 화살표 및 도 9E ). 더욱이, 간세포에서 전체 길이와 스플라이싱된 생성물 사이의 비율은 다시 Ad5.S- 또는 ChAdOx1-S-형질도입된 세포에 대해 달랐습니다( 도 9B). Ad5.S-형질도입된 HepG2 세포의 PCR 패턴은 HeLa 세포와 동일하게 보였지만, ChAdOx1-S-형질도입된 HepG2 세포에서는 Spike-pIX 스플라이스 생성물이 주로 검출된 단편이었습니다(도 9B: 파란색 화살표 및 도 9F ) . 이러한 스플라이스 제품에는 TM 코딩 서열이 없기 때문에 생성된 단백질이 분비될 가능성이 높습니다.

ChAdOx1-형질도입 세포의 게놈 전체 RNA-Seq 데이터에서 상당한 양의 스플라이스 이벤트가 검출됨

ChAdOx1에 의한 세포 형질도입 시 스플라이싱 발생에 관한 우리의 관점을 pIX 중심에서 전체 게놈 수준으로 넓히기 위해 공개적으로 이용 가능한 ChAdOx1-S 형질도입 MRC-5 세포의 RNA-Seq 데이터 세트를 분석했습니다(Almuqrin et al . ., 2021 ). 이러한 데이터 세트는 기본적으로 오류가 발생하기 쉬우므로 분석이 복잡한 나노포어 시퀀싱 데이터를 기반으로 합니다. 따라서 먼저 ChAdOx1-S Spike 유전자를 포함하는 읽기에 대한 데이터 세트를 필터링했습니다. 두 번째 단계에서 우리는 pIX 서열의 존재를 찾고 인간 게놈에 대한 모든 Spike 서열 판독을 폭파했습니다. 이러한 예시적인 데이터 마이닝 실험의 결과는 그림 10 에 나와 있습니다., 여기서 ChAdOx1-S로 형질도입한 후 72일째에 MRC-5 세포에서 파생된 데이터 세트의 분석이 표시됩니다. 수백만 번의 읽기 중 9632번의 읽기는 코돈 최적화 스파이크 유전자에 기인할 수 있습니다. 도 10 에 개략적으로 도시된 바와 같이, 스파이크 오픈 리딩 프레임은 각각 작은 인트론을 갖는 CMV 프로모터에 의해 5'-말단에 측면에 있고 3'-말단에 BGH 폴리(A) 신호 및 pIX 유전자에 의해 각각 측면에 있다. 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 단백질의 신호 서열을 암호화하는 93개의 핵산 서열이 스파이크 유전자의 원래 시작 코돈을 대체합니다. 이 분석에서 우리는 스파이크 뉴클레오티드 서열을 포함하는 9632개의 판독 내에서 CMV의 진짜 SA에 융합된 숙주 세포 유전자 엑손(총 1개에서 18개의 엑손을 융합)을 포함하는 총 120개의 트랜스-스플라이싱된 mRNA를 확인했습니다. 프로모터(n = 8) 또는 내부 Spike SA 사이트(n = 47). 유사하게, 우리는 숙주 세포 유전자의 엑손(1~28 엑손)에 융합된 스파이크 서열을 발견했습니다. 이러한 트랜스-스플라이싱 이벤트는 스파이크 개방 판독 프레임(n = 32, 32개의 서로 다른 SD 사이트) 또는 식별된 BGH SD 사이트(n = 33, 1 SD 사이트). 대표적으로 RSP, MSPG2, GPN2, CCN1, MRPL9, SORT1, UROS, TMEM35B, PRDX, ADAR, IFITM1, MMP1, DUD, PKM, ALDOA, MT2A, DDX42 등의 유전자를 확인했습니다. 총 50 스파이크 -pIX 융합도 발견되었으며(8개의 SD 사이트), HeLa, HepG2 및 C2C12 세포에서 관찰된 바와 같이 BGH SD에서 pIX 코딩 서열의 SA 상류까지 79개의 판독이 발견되었습니다. 이러한 스플라이싱 이벤트의 빈도는 정상 스파이크 읽기(1.24–1.33% 대 97.41%)에 비해 다소 낮지만, 식별은 예상하지 못했습니다. 비교를 위해 두 개의 하우스키핑 유전자인 ABL1과 GAPDH 각각에 대한 읽기 수를 결정했습니다. ABL1 읽기는 44개에 불과한 반면 GAPDH 읽기는 4586이었습니다. 따라서,

그림 10

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MRC-5 세포에서 Vaxzevria의 트랜스-스플라이싱 이벤트.

RNA-Seq 데이터는 브리스톨 대학교의 David A Matthews가 친절하게 제공했습니다. Vaxzevria 백신으로 형질도입한 후 MRC-5 세포에서 파생된 RNA-Seq 데이터. RNA는 72시간 후에 분리되었고 …더보기

논의

여기에서 우리는 복제된 코돈 최적화 cDNA에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하도록 설계된 아데노바이러스 기반 백신이 코딩 서열에 기능적 스플라이싱 사이트가 존재하지 않는 경우 원치 않는 스플라이싱 이벤트를 초래할 수 있다는 실험적 증거를 제공합니다. 벡터 디자인 중에 피할 수 있습니다.

SARS-CoV-2는 전적으로 세포질에서 발생하는 감염 주기를 가진 RNA 바이러스입니다. 따라서 유전자 서열에서 SD 및 SA 부위의 존재에 대한 진화적 선택은 결코 없었다. 기능적으로는 세포질에서만 활성화되는 mRNA 기반 백신인 반면, 아데노바이러스 벡터의 전사물은 접합을 포함한 전사 후 RNA 처리 단계가 일어나는 세포핵에서 생성됩니다. 따라서 여기에서 보여지고 논의된 결과는 SARS-COV-2뿐만 아니라 다른 RNA 바이러스에 대한 DNA 인코딩 백신 개발에 영향을 미칩니다.

이 연구에서 우리는 핵 RNA 스플라이싱 사건의 결과로 아데노바이러스 백신 벡터로부터 천연 막 앵커가 결여되어 분비되기 쉬운 스파이크 단백질 변이체가 생성된다는 가설을 실험적으로 검증했습니다. 우리는 (1) Spike/splice 리포터 시스템에서 야생형 Spike 유전자 내에서 예측된 SD 사이트의 in silico 사용이 Spike-Luciferase 단백질 융합 이벤트를 초래하고, (2) 이 시스템에서 스플라이스 반응이 TM 막 도메인의 스플라이싱-의존적 손실, (3) 개선된 발현을 위해 코돈-변형된 스파이크 유전자를 암호화하는 3개의 평가된 아데노바이러스 벡터 중 2개가 바이러스 야생형 서열보다 더 많고 더 강한 SD 부위를 나타냄, 및 (4 ) 다음 전사 읽기를 통해,

PCR 증폭을 위해 루시퍼라제 또는 아데노바이러스 pIX 코딩 서열에 결합하는 프라이머를 사용했기 때문에 실험 연구에서 스플라이스 이벤트의 뚜렷한 스펙트럼을 조사했음을 지적하고 싶습니다. 대체 스플라이스 이벤트, 예를 들어 내부 스플라이스 이벤트(프레임 내, 프레임 외부)는 대부분 우연히 복제되고 시퀀싱되었습니다. 세포가 AstraZeneca 백신으로 감염된 후 제공된 RNA-Seq 데이터의 분석은 숙주 세포 유전자를 사용한 추가 트랜스-스플라이싱 이벤트에 대한 통찰력을 제공했습니다. 바이러스 RNA 유전자 진화는 카운터 선택 누락으로 인해 스플라이스 사이트 컨센서스 서열을 포함합니다. 따라서 우리는 포유류 세포에서 그러한 RNA 바이러스 유래 유전자의 핵 발현이 미래에 새로운 백신을 개발할 때 고려해야 할 숙주 세포 유전자와의 원치 않는 스플라이싱 사건을 초래할 수 있다고 결론지었습니다.

우리의 결과는 스파이크 스플라이스 반응이 발생하고 분비된 가용성 스파이크 단백질 변이체가 생성됨을 명확하게 나타냅니다. 전체 세포 및 이의 상청액으로부터의 웨스턴 블롯 분석은 이전에 분석된 스플라이싱 사건을 나타내는 분자량이 다른 일련의 스파이크 단백질 변이체를 밝혀냈습니다. 가용성 스파이크 단백질은 부작용, 예를 들어 내피 세포에 대한 강한 염증 반응을 일으키는 것으로 설명되었습니다( Lei et al., 2020 ; Nuovo et al., 2021 ; Patra et al., 2020 ; Amraei and Rahimi, 2020).). 분명히 심각한 생명을 위협하는 혈전색전증은 야생형 SARS-CoV-2에 의한 수용자 세포의 감염으로 인해 발생합니다. 표면에 스파이크 단백질이 있는 슈도바이러스조차도 조직과 내피 세포에서 강한 염증 반응을 일으킬 수 있으며, 이는 가용성 스파이크 단백질이 혈관계에 전신적으로 존재할 때 심각한 부작용을 일으킬 수 있는 잠재적 위험을 나타냅니다(Lei et al., 2021 ) .

우리의 결과에 따르면 가용성 스파이크 변이체는 특히 Vaxzevria로 백신 접종 후 관찰되는 드물지만 심각한 사건의 발생을 잠재적으로 설명할 수 있습니다. 주목할 만한 점은 Ad26.COV2.S 백신이 더 적은 수의 SD 서열을 가지고 있다는 것입니다. 특히 SD 506 및 SD 3614 는 Ad5.S- 및 ChAdOx1-S-인코딩 스파이크에서 가장 강력하게 예측된 SD 사이트인 SD 506 및 SD 3614 가 없습니다( 표 2B–D 참조). 시퀀스( 그림 1 참조 ). 이는 Ad5.S 및 ChAdOx1-S와 대조적으로 Ad26.COV2.S로 세포를 형질도입할 때 상당한 양의 스플라이싱된 RNA 분자가 생성되지 않았다는 관찰에 의해 추가로 확인되었습니다. 이는 Vaxzevria 백신과 비교했을 때 Janssen 백신의 혈전색전성 부작용 발생률이 ~3배 낮은 것을 설명할 수 있습니다(참조:표 1 ). 또한 Janssen 백신으로 TTS의 위험이 ~2배 더 낮은 것을 설명할 수 있습니다.

우리의 데이터를 기반으로 우리는 수용체 결합 도메인을 통해 가용성 스파이크가 ACE2에 결합하고 면역화 중에 생성된 항-스파이크 항체가 내피 세포 표면에 결합된 스파이크 변이체를 인식할 것이라는 가설을 세웁니다. 염증 반응은 항체 의존 세포 매개 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존 세포 독성(CDC)을 포함한 다양한 메커니즘을 통해 국소적으로 발생할 수 있으며, 둘 다 혈전 형성의 출발점이 될 수 있습니다. ADCC에서 주로 NK 세포는 Fc-감마 수용체(CD16 또는 CD32)를 통해 표면 결합 항체에 모집되고 활성화 후 세포 용해를 유발합니다. CDC에서는Luo et al., 2020 ). 이 방법으로 혈전증은 내피 세포가 ACE2를 발현하는 인체의 모든 부위에서 발생할 수 있습니다.

대뇌 경막 정맥동 시스템에서 왜 그런 현상이 발생해야 합니까? 경막 정맥동에서 양방향 및 자세 의존적 혈류의 정맥 판막이 없기 때문에 수용성 스파이크 단백질의 체류 시간이 증가하고 ACE2를 발현하는 내피 세포에 결합할 가능성이 높아진다고 생각할 수 있습니다. 이것은 혈류가 느린 곳에서 불리한 면역 반응의 가능성을 증가시킬 수 있습니다.

최근에 VITT 증후군이 기술되어 복잡한 염증 과정을 암시합니다. HIT와 관련하여 일부 환자에서 항-PF4 자가항체의 유도 및 혈소판 활성화는 주로 대뇌정맥동을 포함하는 큰 혈관에서 혈소판감소증과 혈전증의 관찰된 조합을 초래할 수 있다고 보고되었습니다(그림 11, 왼쪽 ) . 또한 백신 생산 과정에서 발생하는 단백질 불순물이 염증 유발 상태 생성에 관여할 수 있습니다( Krutzke et al., 2021 ). 여기서 우리는 그림 1 에 묘사된 세 번째 병리 메커니즘을 제안합니다., 오른쪽. 우리의 스플라이싱 데이터를 기반으로 막 고정 및 분비된 가용성 스파이크 단백질 변이체가 백신 접종 후 생산됩니다. 분비된 스파이크 단백질 변이체는 혈관계 전체에 퍼져 있으며 표면에서 ACE2를 발현하는 내피 세포에 집중될 수 있습니다. 이러한 ACE2 결합 스파이크는 ADCC 및/또는 CDC 매개 염증 반응을 일으킬 가능성이 있는 백신 접종 후 생성되는 항스파이크 항체의 표적이 됩니다. 또한 혈전색전증 사건과 인과적으로 연결된 이미 설명한 호중구의 NET 반응을 유발할 수 있습니다( Schönrich et al., 2020 ; Veras et al., 2020 ; Middleton et al., 2020 ). 또한 드물게 관찰되는 모세관 누출 증후군(클라크슨병;Kawabe et al., 2002 )는 잠재적으로 그러한 메커니즘에 의해 설명될 수 있다.

그림 11

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예상 병리학 적 질병 메커니즘.

I. 혈소판 감소 상황을 수반하는 백신 유발 면역 혈전성 혈소판 감소증(VITT) 기전을 예측합니다. II. 백신에 의해 유발될 수 있는 전 염증 반응…더보기

3개의 상이한 아데노바이러스 벡터 Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S의 특징을 표 3 에 요약하였다 . 이 보고서에 설명된 대로 백신 설계 및 인코딩된 전사체의 스플라이스 동작 분석을 기반으로 향후 아데노바이러스 백신 설계 및 개발을 위해 고려해야 할 몇 가지 측면을 확인했습니다.

표 3

3가지 아데노바이러스 벡터 기반 구축물의 비교.

세 가지 다른 아데노바이러스 벡터에 대한 우리의 분석에 근거하여 백신 간에 차이가 있었습니다. 표시된 표는 프로모터, 다양한 폴리(A) 요소 및 …더보기

이름벡터발기인추가 시퀀스터미네이터RRARPP접합

Ad5.S	HAd5	인트론 과 CMV	–	SV40	현재의	아니요	+
ChAdOx1-S	차드	인트론 과 CMV	+ tPA(31aa)	BGH	현재의	아니요	+
Ad26.COV2.S	HAd26	인트론 없는 CMV	–	SV40	삭제됨	현재의	부분적으로 삭제된 스플라이스 사이트
논평			업스트림 ATG		위치 682–685	위치 986/987	AZ >> J

두 가지 다른 데이터 세트가 있습니다. 하나의 데이터 세트는 HeLa 및 HepG2 세포주에서 형질도입 후 세 가지 아데노바이러스 벡터 시스템 모두의 스플라이스 이벤트의 대규모 시퀀싱에 의해 생성되었으며( 그림 5 - 7 ), 여기에서 세 벡터 모두의 서로 다른 스플라이스 이벤트는 단순히 분석하여 조사되었습니다. 직접 시퀀싱 또는 서브클로닝 및 시퀀싱을 통해 다수의 PCR 단편. 두 번째 데이터 세트는 HeLa, HepG2 및 C2C12 세포주에서 MOI를 조정한 후 스플라이스 활성에 대해 세 가지 아데노바이러스 벡터를 모두 분석한 실험을 기반으로 합니다( 그림 8). 후자의 경우, 다른 폴리(A) 신호 서열(BGH 대 SV40)의 활성에 대해 판독 통과 전사물이 조사되었지만 특정 전사체에서 스플라이스 이벤트의 양에 대해서도 조사되었습니다(그림 9). Transcriptional read-through는 스파이크 코딩 시퀀스와 아데노바이러스 벡터 게놈에 의해 인코딩된 pIX 유전자 사이의 스플라이스 이벤트 생성을 위한 전제 조건입니다. 이 구조물에 사용된 BGH poly(A) 신호에 연결될 수 있는 ChAdOx1-S에서는 전사 판독이 거의 관찰되지 않았습니다. 분명히 SV40 poly(A) 신호는 우리가 Ad5.S에서 관찰한 것처럼 전사체 종료에 효율적이지 않습니다. 이 경우 조직 특이적 스플라이싱이 가용성 스파이크 단백질 변이체 생성의 일부 차이를 설명할 수 있다는 사실을 지적할 수 있는 스플라이스 이벤트에 대한 차이가 관찰되었습니다.

우리의 연구 결과를 바탕으로, 우리는 DNA 기반 백신에서 발현에 최적화된 야생형 또는 코돈인 스파이크 오픈 리딩 프레임을 항상 강력한 SD 사이트의 존재에 대해 분석해야 한다고 제안합니다. 의도하지 않은 접속을 방지하기 위해 가능하면 강한 SD는 피해야 합니다. 우리는 Janssen Ad26.COV2.S 백신이 강력한 SD의 수를 줄이기 위해 수정된 반면 Ad5.S 및 ChAdOx1-S 벡터에는 여전히 강력한 SD가 포함되어 있어 감지 가능한 많은 수의 스플라이싱 이벤트에 반영됩니다. Ad26.COV2.S 백신에서는 매우 적은 스플라이싱 사건만 검출되었습니다.

인간에서 아데노바이러스 기반 백신의 운명과 조직 분포에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 마우스에서, 근육내 주사 후 상당한 양의 아데노바이러스 벡터가 간세포에 들어가고, 여기서 이식유전자의 발현이 발생하는 것으로 관찰되었다( Kron et al., 2011 ). 침팬지 ChAdOx1-S는 침팬지 아데노 바이러스 Y25( Dicks et al., 2012 )에 기반을 두고 있기 때문에 간성 아데노바이러스일 가능성이 높습니다. 그리고 굿맨, 1969년). 상당한 양의 근육 주사 후 (일부) 백신에서 간세포의 형질도입이 일어난다면, 스플라이싱에 의해 막관통 도메인을 잃은 더 많은 양의 스파이크 단백질이 간정맥을 통해 체순환으로 분비될 것이라고 생각할 수 있습니다. .

종합하면, 우리의 작업에서 DNA로 인코딩된 서열(특히 RNA 바이러스에서 파생된 경우)의 경우 가장 중요한 것은 강력한 SD를 피해야 하며 강력한 poly(A) 신호를 발현 구조의 RNA 종결에 사용해야 한다는 것입니다. 이는 아데노바이러스 벡터가 수송 수단으로 사용될 때 특히 중요합니다. 일반적으로 transgenes 시퀀스는 삭제 된 E1 의 간격에 있는 adenoviral 게놈에 포함 됩니다.-강한 SA 부위가 있는 아데노바이러스 pIX의 바로 상류에 위치한 지역. 대안적으로, 아데노바이러스 벡터의 대부분의 도입유전자는 '왼쪽에서 오른쪽' 방향을 갖지만, 발현 카세트의 반전은 또한 형질전환-코딩 서열과 바이러스 pIX 전사물 사이에 발생하는 스플라이싱 사건을 피할 것이다. 이를 고려하면 스플라이싱 가능성이 크게 감소하거나 무효화됩니다.

우리는 보다 안전한 미래의 아데노바이러스 백신 벡터의 합리적 설계와 일반적으로 아데노바이러스 벡터 기반 유전자 전달 접근법에 대한 이러한 측면의 고려를 강력하게 강조합니다.

재료 및 방법

스플라이스 사이트 예측자세한 프로토콜 요청

우한 SARS-CoV-2 균주(NC_045512.2)의 SARS-CoV-2 스파이크 핵산 서열 및 조사된 3개의 아데노바이러스 벡터 Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2에 의해 인코딩된 코돈 최적화 스파이크 서열 .S는 최신 SpliceRover 온라인 도구( bioit2.irc.ugent.be/rover/splicerover )를 사용하여 SD 및 SA 사이트의 존재를 분석했습니다. 점수가 0.15 미만인 사이트는 추가 분석에서 제외되었습니다( Zuallaert et al., 2018 ). ASSP 온라인 도구는 잠재적인 접합 부위 식별을 위한 두 번째 알고리즘으로 사용되었습니다( Wang and Marín, 2006 ).

Tuna Toptan과 Marek Widera(University Hospital 의료 바이러스 연구소 프랑크푸르트 암 마인, 괴테 대학, 프랑크푸르트 암 마인, 독일). cDNA는 다음 프라이머를 사용하여 증폭한 후 PCR 실험 및 스파이크 유전자의 오픈 리딩 프레임의 클로닝에 사용되었습니다: CoV-2_S.Flag.Sfi.F 5'-aGGCCTCCTGAGGCCaccatggattacaaggatgacgacgataagatgtttgtttttcttgttttattgccactagtctct -3', CoV -2_S.Sfi.R 5'- aGGCCTGACAGCCttatgtgtaatgtaatttgactcctttgagcac-삼'. 생성된 증폭기를 Topo II 벡터 시스템에 클로닝하고 적절한 클론을 서열 분석으로 검증했습니다. 최종 클론을 Sfi1로 절단하고 Sleeping Beauty 트랜스포존 벡터 시스템 pSBTet-GP(GFP/Puromycin; Kowarz et al., 2015 )에 클로닝했습니다. 재조합 스파이크는 FLAG 태그로 N 말단이 수정되었습니다.

스파이크/스플라이스 리포터 시스템 개발자세한 프로토콜 요청

복제된 야생형 스파이크 오픈 리딩 프레임을 사용하여 추가 스플라이스 리포터 시스템을 구축했습니다. 스파이크/스플라이스 리포터 시스템은 정지 코돈을 포함하는 전체 길이의 스파이크 유전자와 필요한 분기 A 뉴클레오티드를 포함하는 인트론 서열 및 3개의 다른 판독 프레임(0, + 1, +2) 전체 길이 루시퍼라제 유전자(시작 코돈 없음). 이 시스템에서 Luciferase 활성은 splicing이 발생하는 경우에만 감지됩니다. 따라서, 3개의 독립적인 스파이크/스플라이스 리포터 구조(pSBbi::Spike-Luc-0/+1/+2 GP)가 통합 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 벡터 pSBbi-GP에 클로닝되었습니다(Kowarz et al., 2015) .). 또한, Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S의 단리된 아데노바이러스 DNA는 Spike 서열의 3822 bp 코돈 최적화 오픈 리딩 프레임을 PCR 증폭하기 위한 주형으로 사용되었습니다. 이들 PCR 단편은 또한 3개의 루시퍼라제 리포터 유전자 구축물 pSBbi::LUC-0/+1/+2 GP에 클로닝되었다. 생성된 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 벡터는 서열이 검증된 후 RT-PCR 및 Luciferase 리포터 실험을 위해 HEK293T 세포의 게놈에 안정적으로 통합되었습니다. ChAdOx1-S 스파이크 서열 구조는 세 가지 다른 구조(Ad5.S, ChAdOX1-S, Ad26.COV2.S)를 모두 길이가 동일하게 만들기 위해 tPA 리더 서열(+31aa) 없이 클로닝되었습니다. 따라서 원래 AZ 벡터의 위치 94-96에 있는 AGA 코돈은 ATG 시작 코돈으로 변환되었습니다. 이러한 방식으로 테스트된 모든 구조는 3822개 뉴클레오티드의 열린 해독 프레임을 가졌습니다.

안정적인 형질감염 실험자세한 프로토콜 요청

모든 스플라이스 리포터 구조는 HEK293T 세포에 안정적으로 형질감염되었고 2 μg/ml Puromycin으로 3-5일 동안 선택되었습니다. RT-PCR에 의한 잠재적 스플라이스 이벤트를 조사하기 위해 루시퍼라제 실험 또는 전체 RNA(Qiagen)의 분리를 위해 세포를 사용했습니다.

아데노바이러스 벡터자세한 프로토콜 요청

N52.E6 세포에서 생산된 Ad5.S 입자( Kowarz et al., 2015 )는 물리적 역가가 3.35 × 10 8 VP/μl였으며 50mM HEPES, 150mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.4에 용해되었습니다. 제조업체에 따르면, AstraZeneca의 ChAdOx1-S 백신(로트 번호 ABV9317)은 1 x 10 8 VP/μl 의 물리적 역가를 갖고 입자는 10mM 히스티딘, 7.5% 수크로스(w/v), 35mM NaCl에 용해되었습니다. , 1mM MgCl 2 , 0.1% 폴리소르베이트 80(w/v), 0.1mM EDTA 및 0.5% EtOH(w/v). 제조업체에 따르면 Janssen의 Ad26.COV2.S 백신(로트 번호 XD955 및 21C10-01)의 역가는 1 × 10 8VP/μl 및 입자를 구연산 일수화물(0.14mg), 구연산 삼나트륨 이수화물(2.02mg), 에탄올(2.04mg), 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(25.50mg), 폴리소르베이트-80(0.16mg), 염화나트륨(2.19mg).

Ad5.S 벡터의 생산 및 정제자세한 프로토콜 요청

본 연구에 사용된 Ad5.S 벡터 입자는 인간 아데노바이러스 종 C 유형 5(GenBank AY339865.1, Δ441-3,522 및 Δ28123-30813에 기초함)를 기반으로 하는 E1 - 및 E3 - 결실된 복제 불능 벡터 입자입니다. SV40 poly(A) 신호가 포함된 CMV 프로모터 제어 SARS-CoV2 Spike 발현 카세트는 GenBank 시퀀스 YP_009724390.1을 기반으로 하며 호모 사피엔스 에 대해 코돈 최적화되었으며 E1 영역 에 삽입되었습니다 . 입자는 E1- 보완 N52.E6 세포( Schiedner et al., 2000 ) 에서 생성되었고 앞서 설명한 바와 같이 CsCl 구배 초원심분리에 의해 정제되었습니다( Krutzke et al., 2020 ). 요약: 4 × 10 8스톡 용액으로부터 MOI 300으로 세포를 형질도입하고; 형질도입 48시간 후 세포를 수확하고, 3ml 150mM NaCl, 50mM HEPES, pH 7.4에 재현탁하고, 동결/해동 주기로 용해시켰다. 세포 파편을 2000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 분리 하고, 상청액을 CsCl 단계 구배(밀도 하단: 1.41g/ml; 밀도 상단: 1.27g/ml, 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에 층을 이루었습니다. ) 4℃에서 2시간 동안 176,000× g 에서 원심분리하였다. 벡터 입자를 흡입하고 연속 연속 CsCl 구배(밀도: 1.34g/ml, 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)로 추가 정제하고 176,000×g에서 원심분리했습니다 .4°C에서 20시간 동안 PD10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 벡터 입자를 흡입하고 탈염했습니다. 물리적 벡터 역가는 260 nm에서의 광학 밀도 측정에 의해 결정되었습니다( Mittereder et al., 1996 ).

벡터 원액에서 아데노바이러스 DNA 분리자세한 프로토콜 요청

QIAamp DNA Mini Kit(250)를 사용하여 Ad5.S, ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S의 200µl 벡터 저장 용액에서 Adenoviral DNA를 분리했습니다. 용출된 DNA를 EtOH로 침전시키고 펠릿을 10μl 10mM Tris 완충액(pH 8.0)에 재현탁시켰다.

세포주자세한 프로토콜 요청

HEK293T 세포는 10%(v/v) FBS와 혼합되고 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 저 포도당 배지에서 유지되었습니다. HeLa(인간 자궁경부암), HepG2(인간 간세포 암종) 및 C2C12(쥐 근육 근모세포)는 각각 MEM, alphaMEM 또는 DMEM 배지에서 배양되었으며, 모두 10% FBS 및 1% 항생제가 보충되었습니다. 세포는 37°C, 5% CO2 에서 성장했습니다.95%의 상대 습도. 일주일에 세 번 계대되는 C2C12를 제외하고 세포는 일주일에 두 번 계대되었습니다. HeLa 및 HepG2 세포의 경우 아데노바이러스 벡터 형질도입을 세포 파종 24시간 후에 수행한 반면, C2C12 세포는 파종 후 72시간 동안 배양하여 조밀하게 성장하고 근세포로 분화를 시작했습니다. 세포주는 ATCC(HEK293T) 또는 DMSZ(HeLa, HepG2, C2C12)에서 얻었고 회사에서 제공한 대로 STR 프로파일링을 통해 세포 정체성을 테스트했습니다. 또한, 이러한 세포 스톡은 14일 동안 세포 배양에서 확장되기 전에 마이코플라즈마 감염에 대해 테스트되었으며(회사에서 아직 수행하지 않음) 이후 액체 질소에서 세포 스톡으로 동결되었습니다. 모든 세포 배양 실험을 위해 이러한 세포 스톡을 해동하고 최대 몇 주 동안 세포 배양에 사용했습니다.

다양한 아데노바이러스 벡터를 사용한 세포 흡수 분석자세한 프로토콜 요청

1 × 10 5 HeLa, HepG2 및 C2C12 세포는 Ad5.S, ChAdOx1-S 또는 Ad26.COV2.S의 표시된 물리적 MOI로 형질도입되었습니다. 세포를 수확하기 전에 37°C에서 2시간 동안 벡터와 함께 세포를 배양하고 제조업체의 지침에 따라 GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma)를 사용하여 총 DNA를 분리했습니다. DNA 농도는 260 nm에서 광학 밀도 측정에 의해 결정되었습니다. 총 20ng의 DNA에서 세포내 아데노바이러스 게놈 카피 수를 정량적 실시간 PCR로 분석했습니다. Ad5.S 및 ChAdOx1-S 샘플에 사용되는 프라이머: fw.: 5'- TAGACGATCCCCTACTGTACG -3'; rv.: 5'- GGAAATATGACTACGTCCGG -3'. Ad5.S 및 Ad26.COV2.S 샘플에 사용되는 프라이머: fw.: 5'- CAGGACGCCTCGGAGTACCTGAG -3'; rv.: 5'GGGGCCACCGTGGGGTT -3'. DNA를 2μl에 용해하고 총 부피 20μl에 SYBR Green(Kapa Biosystems) 10μl, 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.4μl 10pmol/μl와 혼합했습니다. 열순환: 첫 번째 순환: 95°C에서 10분; 40주기: 30초 95°C, 30초 60°C, 8초 72°C; 72°C에서 10분의 최종 사이클이 뒤따릅니다. 분석은 생물학적 및 기술적 삼중으로 수행되었습니다.

아데노바이러스 벡터 매개 세포 형질도입 후 SARS-CoV-2 스파이크 RNA 스플라이싱 분석자세한 프로토콜 요청

HeLa, HepG2 및 C2C12 세포를 사용하여 아데노바이러스 세포 형질도입 검정을 수행하였다. 상이한 균주의 아데노바이러스 벡터로 동등한 세포 형질도입 효율을 달성하기 위해, HeLa 세포를 Ad5.S에 대해 MOI 1000, MOI 3000 ChAdOx1-S, 및 Ad26.COV2-S에 대해 MOI 6000으로 형질도입하였다. HepG2 세포는 Ad5.S의 경우 MOI 1000, ChAdOx1-S의 경우 MOI 3000, Ad26.COV2.S의 경우 MOI 10,000으로 형질도입되었습니다. C2C12 세포는 Ad5.S 및 ChAdOx1-S 모두에 대해 MOI 1000으로 형질도입되었습니다( 그림 8 참조).). RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 RNA를 분리한 후 제조업체의 지침에 따라 Maxima H Minus cDNA 합성(ThermoScientific)을 사용하여 cDNA를 생성하기 전에 세포를 37°C에서 48시간 동안 벡터와 함께 인큐베이션했습니다. RT-PCR(RT-PCR 실험 섹션 참조)에 cDNA를 사용하거나 총 부피 25µl의 Taq 중합효소 PCR에 2µl cDNA를 사용했습니다. 스파이크 서열에 대한 정방향 프라이머 결합: 5'- CAAGGACTTCGGGCGGCTTCAA -3', 세 벡터 모두에 사용됨. 아데노바이러스 pIX 서열에 결합하는 역방향 프라이머 서열: Ad5.S 및 ChAdOx1-S의 경우 5'- CCCATCACATTCTGACGCAC -3'; 5'- TGCTGTCGAGCGACGAGTTCAd26.COV2.S의 경우 -3' 열순환: 95°C에서 3분; 40주기: 30초 95°C, 30초 55°C, 2분 68°C; 8 μl의 Ad5.S와 20 μl의 ChAdOx1-S 및 Ad26.COV2.S PCR 산물을 아가로스 젤에서 분리하고, DNA 밴드를 절제하고, 젤 추출 키트(Qiagen)로 정제하고, pCR 2.1-TOPO TA 클로닝을 사용하여 클로닝했습니다. 키트(ThermoScientific) 및 프라이머 5'- CAGGAAACAGCTATGAC -3' 및 5'- GTAAAACGACGGCCAG -3'을 사용하여 시퀀싱했습니다. 분석은 생물학적 삼중으로 수행되었습니다.

RT-PCR 실험자세한 프로토콜 요청

RT-PCR 실험을 위해 일련의 프라이머가 사용되었습니다. 3개의 리포터 세포주 에서 스플 라이스 이벤트 를 테스트하기 위해 다음 프라이머 시퀀스를 사용했습니다 . 5'- ACACTACTGATGCTGTCCGTG -3', S.2482.F 5'- CTGCAGATGCTGGCTTCAT -3' 및 역방향 프라이머 Luc4008.R 5'- GTCCACCTCGATATGTGCGTC -3'. RT-PCR 실험은 엄격한 조건에서 수행되었으며 예상되는 PCR 밴드에서 벗어난 PCR 단편은 Sanger 시퀀싱으로 분석되었습니다.

아데노바이러스 벡터로 형질도입된 HeLa 및 HepG2 세포에서 파생된 RNA 분석을 위해 일련의 범용 프라이머를 개발했습니다. 이들은 다음 프라이머였습니다: 506univ.F 5'- GCGAGTTCCAGTTCTGCAACG -3', 1,810univ.F 5'- CAGACACTGGAAATCCTGGACATCAC -3', 3610 .F 5'- GCGCCATCAGCTCTGTGCTG -3' 및 역방향 프라이머 pIXuniv.R 5'- CGTCAGAATGTGATGGGATCGACG -3'. RT-PCR 실험은 엄격한 조건에서 수행되었으며 예상되는 PCR 밴드에서 벗어난 PCR 단편은 Sanger 시퀀싱으로 분석되었습니다. 열순환: 첫 번째 순환: 94°C에서 2분; 35주기: 20초 95°C, 30초 60°C, 40초 72°C; 72°C에서 3분의 최종 사이클이 이어집니다.

루시페라제 분석자세한 프로토콜 요청

구성적 GFP 발현 카세트를 나타내는 잠자는 숲속의 미녀 루시페라제 리포터 유전자 구조로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 루시페라제 검정을 수행하였다; 웰당 5000개 세포를 검은색 유리 바닥 96-웰 플레이트(Greiner BioOne)에 시딩했습니다. 2일 후 Varioskan Flash Plate-reader(Thermo Fisher Scientific)로 GFP 형광(RFU)을 측정했습니다. 이어서, D-루시페린(최종 농도 187.5μg/ml)을 자동 분주 시스템으로 첨가하고, 루시퍼라제 활성을 결정하였다(RLU). 세포간 차이를 설명하기 위해 RLU/RFU 비율을 표현하기 위해 정규화 절차를 사용했습니다. 모든 측정은 n = 6으로 수행되었으며 배지의 Luciferase 활성은 두 개의 다른 시점(t = 0 및 t = 48시간)에서 한 번 측정되었습니다. 이 목적을 위해,g 및 100μl 상청액을 사용하여 루시페라제 활성을 측정했습니다.

면역 침전 및 웨스턴 블롯 분석자세한 프로토콜 요청

면역 침전 완충액(150mM NaCl, 10mM Tris, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton-X-100, 0.5% NP-40, protease inhibitor cocktail[Roche Diagnostics])을 사용하여 세포를 30분 동안 일정하게 용해시켰다. 4℃에서 교반. 세포 용해물을 2000rpm(376× g ) 및 4℃에서 5분 동안 원심분리에 의해 세포 파편으로부터 분리하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 용해물을 정량화하고 40µg/µl로 조정했습니다.

200 μl의 세포 용해물 또는 세포 배양 상청액(3일)을 4°에서 일정하게 교반하면서 저결합 튜브(Biozym Scientific)에서 25 μl 단백질 G 자기 비드(New England Biolabs)로 사전 정화했습니다. 씨. 자기 분리 후, 상청액을 25 ㎕ 항-FLAG M2 자기 비드(Sigma-Aldrich #M8823)와 함께 4℃에서 2시간 동안 일정하게 교반하면서 인큐베이션하였다. 그런 다음 비드를 0.5 ml IP 버퍼로 3회 세척하고 20 μl 2X Läemmli 버퍼에 재현탁했습니다. 용리를 위해 침전물 비드를 70°C에서 5분 동안 배양하고 비드를 자기적으로 분리했습니다.

Mini-PROTEAN TGX 무염색 구배 겔 4-15%(Biorad) 및 색 단백질 표준 광범위 P7719S(NEB)를 사용하여 10μl의 상청액을 전기영동으로 분리했습니다. 단백질을 110V에서 70분 동안 Towbin 완충액(25mM Tris, 192mM 글리신, 15% 메탄올, 0.01% SDS, pH = 8.3) 중 저형광 웨스턴 PVDF 막(Abcam) 상에 블롯팅하였다. 멤브레인은 실온에서 1시간 동안 TBS-T에서 5% BSA를 사용하여 차단되었습니다. 1차 항체 배양은 4°C에서 밤새 수행되었습니다. 실온에서 1시간 동안 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 인큐베이션하기 전에 멤브레인을 TBS-T에서 5% BSA로 4회 세척하였다. TBS-T에서 5% BSA로 4회 세척한 후 Clarity Western ECL Substrate(Biorad) 및 ChemiDoc XRS + 시스템(Biorad)을 사용하여 화학발광 검출을 수행했습니다.

다음 항체가 사용되었습니다. #ab6721) 1/10,000 희석.