한심~!! 돌연변이 바이러스 백신과 면역치료도 필요없는데 난리속에서 해결책은~??

[한키스코]

2015년 발표한 '네이쳐 메디슨'에 나온 논문에서 예견된 신종 코로나바이러스(치명적 폐렴 유발원)는 백신과 면역치료도 필요없어 향후에도 대책이 없을 것입니다.

빌게이츠도 신약-백신개발에 참여한다지만 가능성은 희박할 것입니다.

괴물 바이러스 이제는 치료할 수 없다~!! Nature Medicine에 나온 논문의 원본은 아래의 링크에서 보실 수있습니다. https://www.nature.com/articles/nm.3985

변종되었기에 판정이 음성이라지만 오류가 있을 수 있다고 볼 수 있습니다.

안심할 수 없는 미생물학전(전쟁) 시대~??

첫 발현된 바이러스가 여러 숙주를 거치면 돌연변이로 다른 신종바이러스가 되고 변이는 계속 이어지는 특이성이 있습니다.

백신(대응 항원-항체유도물질) 개발에서 몇 십 년이 거치기에 못 따갑니다.

부분적 항체형성도 변화되는 돌연변이를 상식적으로 따라갈 수도 없습니다.

결국 안된다는 것이지요~~~~~~~~ㅠㅠ.

왜 이렇게 현실에서 호들갑 떨고, 가두고, 뉴스로 불안조성을 유도하는 지 생각해 보아야 합니다~!!

독감바이러스 등 오염 속에서 누구는 환자가 되고 누구는 환자가 안되는 원인은 무엇일까요~??

허약한 사람은 위험합니다.

하루하루 면역력유지가 핵심일 것입니다.

건강유지에는 여러 복합시스템으로 이해하기도 어렵습니다.

신체건강을 위해서는 영양균형유지가 중요하다 하겠습니다.

현실이 위험다고 하시면...,

부족한 영양소는 채워야하고 과식하지 않고 물질대사가 잘 이루어지도록 매일 신경써야합니다.

내몸애트리엠은 그 부족한 영양소를 채워줄 수 있는 대왕급 영양소의 집합체이며, 대사활성까지 고려한 신개념의 제제이오니 잘 고려하시길 바랄 뿐입니다.

감사합니다~트리엠^^

-네이쳐 Medicine 논문 요약본-

요약

심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV) 및 중동 호흡기 증후군 (MERS) -CoV의 출현은 종간 전파 사건의 위협을 강조하여 인간에게 발생합니다. 여기 우리는 현재 중국 말굽 박쥐 인구 1 순환하는 SARS 같은 바이러스 SHC014-CoV의 질병 가능성을 검사합니다 . SARS-CoV 역 유전학 시스템 사용 2, 우리 마우스 생 성 SARS CoV 백본에서 박쥐 코로나 바이러스 SHC014의 스파이크를 표현하는 키메라 바이러스를 생성 하 고 특징. 결과 야생형 백본에서 SHC014 스파이크를 인코딩하는 그룹 2b 바이러스 SARS 수용 체 인간 안지오텐신 변환 효소 II (ACE2)의 여러 orthologs를 효율적으로 사용 하 고 기본 인간기도 세포에서 효율적으로 복제 하 고 전염병에 해당하는 체 외 역가를 달성 할 수 있습니다 나타냅니다 SARS-CoV의 균주. 또한, 생체 내실험은 주목할만한 발병으로 마우스 폐에서 키메라 바이러스의 복제를 입증한다. 이용 가능한 SARS- 기반 면역-치료 및 예방 양식의 평가는 열악한 효능을 나타냈다; 모노클로 날 항체 및 백신 접근법은 신규 스파이크 단백질을 사용하여 CoV 로의 감염을 중화시키고 보호하는데 실패 하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 전염성 전장 SHC014 재조합 바이러스를 합성 적으로 다시 유도하고 시험 관내 및 생체 내 에서 강력한 바이러스 복제를 입증한다 . 우리의 작업은 현재 박쥐 집단에서 순환하는 바이러스로부터 SARS-CoV 재발의 잠재적 위험을 시사합니다.

본관

SARS-CoV의 출현은 세계화로 전 세계적으로 급속한 확산과 막대한 경제적 영향을 초래하는 심각한 호흡기 질환의 종간 전염의 새로운 시대를 예고했습니다 3 , 4 . 그 이후로, 인플루엔자 A 균주 H5N1, H1N1 및 H7N9 및 MERS-CoV를 포함한 몇 가지 균주가 동물 집단에서 출현하여 괴로워하는 지역에 상당한 질병, 사망률 및 경제적 어려움을 초래했습니다 5 . 공중 보건 대책이 SARS-COV 발생 막을 수 있었지만 4 , 최근 메타 지노믹스 연구는 밀접하게 미래의 위협을 초래할 수 있습니다 중국어 박쥐 집단에서 순환 바이러스 SARS와 같은 관련의 식별 시퀀스가 1 , 6. 그러나 서열 데이터만으로도 미래의 전염병 바이러스를 식별하고 준비 할 수있는 최소한의 통찰력을 제공합니다. 따라서, 순환 박쥐 CoV의 출현 가능성 (즉, 인간을 감염시킬 수있는 가능성)을 조사하기 위해, 우리는 중국 말굽 박쥐 1 에서 분리 된 RsSHC014-CoV 시퀀스에서 새로운 동물성 CoV 스파이크 단백질을 암호화하는 키메라 바이러스를 구축했습니다. -SARS-CoV 마우스 적응 백본과 관련하여. 하이브리드 바이러스는 천연 골격에서 다른 필요한 적응성 돌연변이와 독립적으로 질병을 유발할 수있는 새로운 스파이크 단백질의 능력을 평가할 수있게 해주었다. 이 방법을 사용하여, 우리는 주요 인간기도 세포 및 생체 내 에서 SHC014 스파이크 단백질에 의해 매개되는 CoV 감염을 특성화 하였다및 SHC014-CoV에 대한 이용 가능한 면역 치료제의 효능을 시험 하였다. 이 전략을 함께 사용하면 미래의 바이러스를 예측하고 준비 할 수 있도록 metagenomics 데이터를 변환합니다.

SHC014 및 관련 RsWIV1-CoV의 서열은 이들 CoV가 유행성 SARS-CoV 균주에 대해 가장 가까운 친척임을 보여준다 ( 도 1a, b ); 그러나, SARS-CoV에 대한 수용체 인 인간 ACE2에 결합하는 14 개의 잔기에는 Y442, L472, N479, T487 및 Y491에 중요한 5 가지를 포함하여 14 개의 잔기에 중요한 차이가있다 (참조 7 ). WIV1에서, 이들 잔기 중 3 개는 유행성 SARS-CoV Urbani 균주와 다르지만, ACE2에 대한 결합을 변경시킬 것으로 예상되지 않았다 ( 보충도 1a, b 및 보충 표 1 ). 이 사실은 WIV1 스파이크 단백질을 암호화하는 렌티 바이러스가 인간 ACE2를 발현하는 세포로 들어가는 능력을 측정 한 유사 타이핑 실험에 의해 확인됩니다 ( 보조 그림 1).) 및 WIV1-CoV의 시험 관내 복제 분석에 의해 (참조 1 ). 대조적으로, SHC014에서 14 개의 ACE2- 상호 작용 잔기 중 7 개는 숙주 범위에 중요한 5 개의 잔기를 포함하여 SARS-CoV의 잔기와 상이하다 (보완 적도 1c 및 보충 표 1 ). (세포를 입력하는 SHC014 스파이크를 발현 렌티 pseudotyped 실패 결합 이러한 변경, 부가도.도 1d )의 SHC014 스파이크 바인드 인간 ACE2 수없는 것을 제안했다. 그러나, 관련 SARS-CoV 균주의 유사한 변화는 ACE2 결합 7 , 8 을 허용하는 것으로보고되었다확인에는 추가 기능 테스트가 필요하다고 제안했습니다. 따라서, 본 발명자들은 마우스에서 발병 기전 및 백신 연구의 기회를 최대화하기 위해 복제 가능하고 마우스에 적응 된 SARS-CoV 백본 (이하, 키메라 CoV를 SHC014-MA15라고 함)과 관련하여 SHC014 스파이크를 합성 하였다 ( 보충 그림). 2a ). 구조-기반 모델링 및 의사 타이핑 실험 둘 다로부터의 예측에도 불구하고, SHC014-MA15는 실행 가능하였고 Vero 세포에서 높은 역 가로 복제되었다 ( 보충도 2b ). SARS와 유사하게 SHC014-MA15는 진입을위한 기능성 ACE2 분자가 필요했으며 인간, 사향 및 박쥐 ACE2 오쏘 로그를 사용할 수 있습니다 ( 보충 그림 2c, d). 인간기도의 감염을 매개하는 SHC014 스파이크의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 인간 상피기도 세포주 Calu-3 2B4 (참조 9 )의 감염에 대한 감수성을 검사하고 , 그것과 비슷한 강력한 SHC014-MA15 복제를 발견했다. SARS-CoV Urbani ( 그림 1c ). 이러한 발견을 확장시키기 위해, 1 차 인간기도 상피 (HAE) 배양 물을 감염시키고 두 바이러스의 강력한 복제를 나타냈다 ( 도 1d ). 이 데이터는 SHC014 스파이크로 바이러스가 인간기도 세포를 감염시키는 능력을 확인하고 SHC014-CoV의 종간 전송의 잠재적 위협을 강조합니다.

그림 1 : SARS 유사 바이러스는 인간기도 세포에서 복제 되고 생체 내 병인을 생성 합니다.

( a ) 대표적인 CoV의 전장 게놈 서열은 온라인 방법에 기술 된 바와 같이 정렬되고 계통 발생적으로 맵핑되었다 . 스케일 바는 뉴클레오타이드 치환을 나타내며, 70 % 이상의 부트 스트랩 지지만이 라벨링된다. 이 트리는 CoV가 α-CoV, β-CoV 및 γ-CoV로 정의 된 3 개의 별개의 계통 발생 그룹으로 나누어 져 있음을 보여줍니다. 고전적인 부분 군 군집은 β-CoV의 경우 2a, 2b, 2c 및 2d로 표시되고 α-CoV의 경우 1a 및 1b로 표시됩니다. ( b ) SARS-CoV를 포함하여 2b 군의 대표적인 β-CoV의 스파이크의 S1 도메인의 아미노산 서열이 정렬되고 계통 발생적으로 맵핑되었다. 스케일 바는 아미노산 치환을 나타낸다. ( c , d) Calu-3 2B4 세포 ( c ) 또는 잘 분화 된 1 차 공기-액체 인터페이스 HAE 세포 배양 ( d ) 감염 후 SARS-CoV Urbani (검정색) 및 SHC014-MA15 (녹색)의 바이러스 복제 두 셀 유형 모두에 대해 0.01의 (MOI) 0.01. Calu-3 및 HAE 실험 모두에 대해 생물학적 복제물 ( n = 3)을 갖는 개별 시점에서 샘플을 수집 하였다 . ( e , f ) 체중 감량 ( SAS -CoV MA15의 경우 n = 9; SHC014-MA15의 경우 n = 16) ( e ) 폐의 바이러스 복제 ( SARS-CoV MA15의 경우 n = 3; SHC014-의 경우 n = 4) MA15) ( f) 비강 내 (in) 경로를 통해 1 x 10 4 pfu의 마우스-적응 SARS-CoV MA15 (검정색) 또는 SHC014-MA15 (녹색)로 감염된 10 주령 BALB / c 마우스 . ( g, h ) SARS-CoV MA15 ( n = 3 마리 마우스)로 감염된 마우스 ( g ) 또는 SHC014-MA15 ( n = 4 마리 마우스) ( h )로 감염된 마우스로부터 SARS-CoV N 항원에 대해 염색 된 폐 부분의 대표적인 이미지 가 도시되어있다. 각 그래프에서 중심 값은 그룹 평균을 나타내며 오차 막대는 sem 스케일 막대 (1mm)를 정의합니다.

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생체 내 감염을 중재하는데있어서 SHC014 스파이크의 역할을 평가하기 위해 , SARS-MA15 또는 SHC014-MA15의 10 4 플라크 형성 단위 (pfu) 로 10 주령 BALB / c 마우스를 감염시켰다 ( 도 1e-h ). SARS-MA15로 감염된 동물은 감염 후 4 일 (dpi)까지 빠른 체중 감소 및 치사를 경험했다; 대조적으로, SHC014-MA15 감염은 마우스에서 실질적인 체중 감소 (10 %)를 나타내지 만 치사율은 없었다 ( 도 1e ). 바이러스 복제를 조사한 결과 SARS-MA15 또는 SHC014-MA15로 감염된 마우스의 폐에서 거의 동등한 바이러스 역가가 나타났습니다 ( 그림 1f ). SARS-MA15에 감염된 생쥐의 폐는 말기 세기관지와 폐 실질 모두에서 강한 염색을 나타냈다 ( 그림 1g).), SHC014-MA15- 감염 마우스의 마우스는기도 항원 염색이 감소 된 것으로 나타났다 ( 도 1h ); 대조적으로, 실질 또는 전체 조직학 스코어에서 항원 염색의 결손이 관찰되지 않았으며, 이는 SHC014-MA15에 대한 폐 조직의 차등 감염을 시사한다 ( 보충 표 2 ). 다음으로,보다 감수성이 높고 (12 개월 된) 동물에서 감염을 분석했습니다. SARS-MA15- 감염된 동물은 체중이 급격히 감소하고 감염에 굴복했다 ( 보충 그림 3a, b ). SHC014-MA15 감염은 견고하고 지속적인 체중 감소를 유도했지만, 치사율은 최소였다. 어린 쥐에서 관찰 된 조직학 및 항원 염색 패턴의 경향은 나이든 동물에서 보존되었다 ( 보충 표 3).). 본 발명자들은 SHC014-MA15 감염 후 체중 감소 또는 항원 염색을 나타내지 않은 Ace2 -/- 마우스를 사용한 실험에 기초하여 SHC014-MA15가 대안적인 수용체를 통해 감염을 매개 할 가능성을 배제 하였다 ( 보충 그림 4a, b 및 보충) 표 2 ). 함께, 데이터는 SHC014 스파이크를 갖는 바이러스가 악성 CoV 백본의 맥락에서 마우스에서 체중 감소를 유도 할 수 있음을 나타낸다.

ZMApp 10 과 같은 에볼라 모노클로 날 항체 요법의 전임상 효능을 고려하여 , 본 발명자들은 SHC014-MA15에 대한 감염에 대한 SARS-CoV 모노클로 날 항체의 효능을 결정하고자 하였다. SARS-CoV 스파이크 단백질을 표적으로하는 4 개의 광범위하게 중화되는 인간 모노클로 날 항체는 이전에보고 된 바 있으며 면역 요법 11 , 12 , 13에 대한 가능한 시약입니다 . 우리는 바이러스 복제에 대한 이러한 항체의 효과를 조사하고 (바이러스 복제의 억제율로 표현) 야생형 SARS-CoV Urbani가 비교적 낮은 항체 농도에서 4 개의 모든 항체에 의해 강력하게 중화됨을 발견했습니다 ( 그림 2a-d), 중화는 SHC014-MA15에 대해 변 하였다. 파지 디스플레이 및 탈출 돌연변이 체 11 , 12에 의해 생성 된 항체 인 Fm6은 SHC014-MA15 복제의 백그라운드 억제 수준만을 달성 하였다 ( 도 2a ). 유사하게, SARS- CoV- 감염 환자 13 의 기억 B 세포로부터 유래 된 항체 230.15 및 227.14 는 또한 SHC014-MA15 복제를 차단하지 못했다 ( 도 2b, c). 세 가지 항체 모두에 대해, SARS 및 SHC014 스파이크 아미노산 서열 사이의 차이는 SARS-CoV 이스케이프 돌연변이 체 (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E)에서 발견 된 직접적이거나 인접한 잔기 변화에 상응하며, 이는 아마도 항체의 부재를 설명한다 SHC014에 대한 중화 활동. 최종적으로, 단일 클론 항체 109.8은 SHC014-MA15의 50 % 중화를 달성 할 수 있었지만, 고농도 (10 μg / ml)에서만 ( 도 2d ). 함께, 결과는 SARS-CoV에 대한 광범위하게 중화 항체가 SHC014와 같은 응급 SARS- 유사 CoV 균주에 대해서만 한계 효능을 가질 수 있음을 입증한다.

도 2 : SARS-CoV 모노클로 날 항체는 SARS- 유사 CoV에 대한 한계 효능을 갖는다.

( a – d ) SARS-CoV Urbani로 Vero 세포의 감염에 대해 원래 유행성 SARS-CoV에 대해 생성 된 단일 클론 항체 패널의 효능 (플라크 수 감소로 측정)을 평가하는 중화 분석 또는 SHC014-MA15 (녹색). 시험 된 항체는 fm6 (어 바니의 경우 n = 3; SHC014-MA15의 경우 n = 5) 11 , 12 ( a ), 230.15 (어 바니의 경우 n = 3; SHC014-MA15의 경우 n = 2) ( b ), 227.15 ( n Urbani의 경우 = 3, SHC014-MA15의 경우 n = 5) ( c ) 및 109.8 ( nUrbani의 경우 3 = SHC014-MA15의 경우 n = 2) 13 ( d ). 각 데이터 포인트는 그룹 평균을 나타내며 오류 막대는 sem을 정의합니다. b , c의 SARS-CoV Urbani-infected Vero 셀의 오류 막대 는 기호로 겹치므로 표시되지 않습니다.

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SHC014-MA15 로의 감염에 대한 기존 백신의 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 이중 불 활성화 된 전체 SARS-CoV (DIV)를 갖는 노화 된 마우스를 백신 접종 하였다. 이전 연구는 DIV가 어린 마우스를 상 동성 바이러스 14 로 공격으로부터 중화시키고 보호 할 수 있음을 보여 주었다 ; 그러나 백신 때문에 예방 접종의 피해되는 동물의 수를 나타내는, 관찰 된 면역 병리을 증강하는 세 동물을 보호하는 데 실패했습니다 (15) . 여기서 우리는 체중 감량 또는 바이러스 역가와 관련하여 DIV가 SHC014-MA15와의 도전으로부터 보호를 제공하지 않았다는 것을 발견했습니다 ( 보조 그림 5a, b ). 다른 이종 그룹 2b CoV를 사용한 이전 보고서와 일치 15DIV- 접종 된 노화 된 생쥐로부터의 혈청은 또한 SHC014-MA15를 중화 시키는데 실패 하였다 ( 보완 적도 5c ). 특히, DIV 백신 접종은 강력한 면역 병리 ( 보충 표 4 ) 및 호산구 증가증 ( 보조 그림 5d-f )을 초래했다 . 함께, 이러한 결과는 DIV 백신이 SHC014 로의 감염에 대해 보호되지 않을 것이고, 백신 접종 된 노인 그룹에서 질병을 증가시킬 수 있음을 확인시켜 준다.

DIV를 사용한 마우스의 백신 접종과는 달리, 약독 화 생백신으로서 SHC014-MA15를 사용하는 것은 SARS-CoV에 의한 도전에 대하여 잠재적 인 교차-보호를 나타내었지만, 결과는 중요한 경고를 갖는다. 우리는 10 4 pfu의 SHC014-MA15로 어린 마우스를 감염 시키고 28 일 동안 관찰 하였다. 이어서, 29 일에 SARS-MA15로 마우스에 도전 하였다 ( 보충도 6a ). SHC014-MA15 감염 28 일 후 유발 된 항혈청으로부터의 최소 SARS-CoV 중화 반응이 있었지만, 고용량의 SHC014-MA15로 마우스의 이전 감염은 치사량의 SARS-MA15 로의 공격에 대한 보호를 부여 하였다 ( 보충 그림 6b, 1 : 200). 이차 항원 부스트가없는 경우, 28dpi는 항체 역가의 예상 피크를 나타내며 시간 16 , 17에 따라 SARS-CoV에 대한 보호가 감소 될 것임을 암시합니다 . 치사량의 SARS-CoV에 의한 공격에 대한 보호를 나타내는 유사한 결과가 체중 감량 및 바이러스 복제와 관련하여 노화 된 BALB / c 마우스에서 관찰되었다 ( 보충도 6c, d ). 그러나, 10 4 pfu 의 SHC014-MA15 감염 용량은 일부 노인 동물에서> 10 % 체중 감소 및 치사를 유발 하였다 ( 도 1 및 보충도 3).). SHC014-MA15 (100 pfu)의 저용량으로 예방 접종을하면 체중 감량을 유도하지는 않았지만 SARS-MA15 치명적인 복용량 도전으로부터 노인 동물을 보호하는 데 실패했습니다 ( 보충 그림 6e, f ). 함께, 데이터는 SHC014-MA15 챌린지가 보존 된 에피토프를 통해 SARS-CoV에 대한 교차-보호를 제공 할 수 있지만, 필요한 용량은 병인을 유도하고 약독 화 백신으로서의 사용을 배제한다는 것을 시사한다.

SHC014 스파이크가 인간 세포의 감염을 매개하고 마우스에서 질병을 유발할 수있는 능력이 있음을 확인한 후, SARS-CoV에 사용 된 접근 방식을 기반으로 전장 SHC014-CoV 감염성 클론을 합성했습니다 ( 그림 3a ) 2 . Vero 세포에서의 복제는 SARS-CoV와 비교하여 SHC014-CoV에 대한 결손이 없음을 나타냈다 ( 도 3b ); 그러나, SHC014-CoV는 감염 후 24 시간 및 48 시간에 1 차 HAE 배양에서 유의하게 ( P <0.01) 약독 화되었다 ( 도 3c ). 마우스의 생체 내 감염은 유의 한 체중 감소를 나타내지 않았지만 SARS-CoV Urbani와 비교하여 전장 SHC014-CoV 감염의 폐에서 바이러스 복제가 감소 된 것으로 나타났다 ( 도 3d, e). 함께, 결과는 전장 SHC014-CoV의 생존 성을 확립하지만, 그의 호흡이 인간 호흡기 세포 및 마우스에서의 유행성 SARS-CoV의 그것과 동등하기 위해서는 추가의 적응이 요구됨을 시사한다.

그림 3 : 전장 SHC014-CoV는 인간기도에서 복제되지만 유행성 SARS-CoV의 독성은 없습니다.

( a ) 6 개의 연속 cDNA (SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E 및 SHC014F로 지정)로 합성 된 SHC014-CoV 분자 클론의 도식은 전장 cDNA 발현의 직접 조립을 가능하게하는 독특한 BglI 부위 옆에 위치 함 오픈 리딩 프레임 (1a, 1b, 스파이크, 3, 엔벨로프, 매트릭스, 6-8 및 뉴 클레오 캡시드). 밑줄 친 뉴클레오티드는 제한 효소 절단 후 형성된 오버행 서열을 나타낸다. ( b , c ) Vero 세포 감염 후 SARS-CoV Urbani (검정색) 또는 SHC014-CoV (녹색)의 바이러스 복제 ( b ) 또는 잘 분화 된 1 차 공기-액체 인터페이스 HAE 세포 배양 ( c0.01)의 MOI에서 각 그룹에 대해 생물학적 복제물 ( n = 3)을 갖는 개별 시점에서 샘플을 수집 하였다 . 데이터는 Vero 및 HAE 셀에 대한 하나의 실험을 나타냅니다. ( D , E ) 무게 손실 ( N SARS-COV MA15 용 = 3, N = 7 SHC014-COV 대 N (= 6 SARS-우르 바니 용) D ) 및 바이러스 복제 폐 ( N SARS-우르 바니 대 = 3 및 1 x 10 5 pfu의 SARS-CoV MA15 (회색), SHC014-CoV (녹색) 또는 SARS-CoV Urbani (검은 색)에 감염된 10 주령 BALB / c 마우스의 SHC014-CoV) ( e ) 경로에서. 각 데이터 포인트는 그룹 평균을 나타내며 오류 막대는P <0.01 및 *** P <0.001 개별 꼬리 점 의 양측 스튜던트 t 검정을 사용 합니다.

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SARS-CoV 전염병 동안, 손바닥 사향과 인간 4 에서 발견 된 CoV 균주 사이에 연결이 신속하게 확립되었습니다 . 이 발견을 바탕으로, 일반적인 출현 패러다임은 전염병 SARS-CoV가 박쥐 바이러스로 시작하여 사향으로 뛰어 들고 수용체 결합 도메인 (RBD) 내에서 변화를 통합하여 사향 Ace2에 대한 결합을 개선 시킨다고 주장한다 (참조 18 ). 살아있는 동물 시장의 사람들에 대한 후속 노출은 사향 균주에 의한 인간 감염을 허용하였고, 이는 결국 유행성 균주가되도록 적응되었다 ( 도 4a ). 그러나, 계통 발생 학적 분석은 초기 인간 SARS 균주가 더 밀접하게 사향이 균주에 비해 박쥐 균주 관련 나타날 제안 (18). 따라서, 제 패러다임 직접 배트 인간 전송 SARS-COV 출현 및 지속 감염 (위한 보조 호스트 및 저장하는 역할을 손바닥 사향 고양이 개시 주장 도. 4B ) 19 . 두 패러다임 모두에 대해, 2 차 숙주에서의 스파이크 적응은 필수이며, 대부분의 돌연변이는 RBD 내에서 발생할 것으로 예상되므로, 개선 된 감염을 촉진시킨다. 두 이론 모두 박쥐 CoV의 풀이 제한되어 있고 숙주 범위 돌연변이가 무작위 및 희귀하여 인간의 미래 출현 사건의 가능성을 감소 시킨다는 것을 암시합니다.

그림 4 : 코로나 바이러스의 출현 패러다임.

코로나 바이러스 균주는 박쥐 집단에서 순환하는 준-종 풀에서 유지된다. ( , B ) 전통 SARS-COV의 출현 이론이 호스트 범위 돌연변이 (빨간색 원)를 가정하는 대체 호스트의 허가 감염 임의 희귀 발생을 나타냅니다. 이차 숙주 패러다임 ( a )은 비인간 숙주가 박쥐 전구 바이러스에 감염되고 적응을 통해 인간에게 전염되는 것을 촉진한다고 주장한다. 인간에서의 후속 복제는 유행성 바이러스 균주로 이어진다. 직접 패러다임 ( b)는 중간 숙주의 필요없이 박쥐와 인간 사이에서 전염이 일어난다는 것을 시사한다. 그 후, 선택은 2 차 숙주에서 밀접하게 관련된 바이러스 복제와 함께 인간 집단에서 발생하여, 바이러스 지속성 및 적응 둘 다를 허용한다. ( c ) 키메라 SARS 유사 바이러스의 데이터는 유사 종 풀이 돌연변이 (빨간색 원)없이 인간 세포를 감염시킬 수있는 여러 바이러스를 유지한다고 주장합니다. 2 차 또는 인간 숙주에서의 적응이 전염병 발생에 필요할 수 있지만, SHC014 스파이크 함유 바이러스가 악성 CoV 백본 (녹색 외곽선이있는 원)과 재조합되면 전염병이 인간에게 발생할 수 있습니다. 기존 데이터는 세 가지 패러다임 모두의 요소를 지원합니다.

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우리의 연구는 다른 출현 경로를 무효화하지는 않지만, 순환 박쥐 CoV 풀이 돌연변이 나 적응없이 인간을 감염시킬 수있는 '포지션'스파이크 단백질을 유지하는 세 번째 패러다임을 주장합니다 ( 그림 4c ). 이 가설은 SARS-CoV 백본에 SHC014 스파이크를 함유하는 키메라 바이러스가 인간기도 배양 및 RBD 적응이없는 마우스 모두에서 강력한 감염을 유발하는 능력에 의해 설명된다. 이전에 확인 된 병원성 CoV 백본 3 , 20 의 관찰과 결합, 본 발명자들의 결과는 SARS- 유사 출현 균주에 필요한 출발 물질이 현재 동물 저수지에서 순환하고 있음을 시사한다. 특히, 전장 SHC014-CoV가 아마도 인간 질병을 매개하기 위해 추가의 백본 적응을 필요로 할지라도, CoV 패밀리에서 기록 된 고주파 재조합 사건은 미래의 출현 가능성과 추가 준비의 필요성을 강조한다.

지금까지 동물 인구의 게놈 화면은 주로 발병 설정에서 새로운 바이러스를 식별하는 데 사용되었다 (21). 이 접근법은 이러한 데이터 세트를 확장하여 바이러스 출현 및 치료 효과에 대한 질문을 조사합니다. 우리는 SHC014 스파이크가있는 바이러스가 인간 질병에 가장 적합한 모델 인 일차 인간기도 배양에서 복제하는 능력 때문에 잠재적 인 위협으로 간주합니다. 또한, 마우스에서 관찰 된 발병 기전은 RBD 적응없이 포유 동물 모델에서 질병을 유발하는 SHC014- 함유 바이러스의 용량을 나타낸다. 특히, SARS-MA15를 사용한 것과 비교하여 폐에서의 차등 성 및 SARS-CoV Urbani에 비해 HAE 배양에서 전장 SHC014-CoV의 감쇠는 스파이크 가공성, 수용체 생체 이용률 또는 길항 작용을 포함하여 ACE2 결합 이상의 인자 숙주 면역 반응 중-출현에 기여할 수있다. 하나, 이러한 발견을 인간의 병원성 잠재력으로 번역하기 위해서는 비인간 영장류에서의 추가 시험이 필요하다. 중요하게, 이용 가능한 치료제의 실패는 추가 연구 및 치료의 개발에 대한 중요한 필요성을 정의한다. 이러한 지식을 바탕으로 SHC014와 같은 그룹 2b 특정 CoV의 출현을 방지하는 감시 프로그램, 진단 시약 및 효과적인 치료법을 생성 할 수 있으며, 이종 풀을 유지하는 다른 CoV 분기에 적용 할 수 있습니다.

미래의 신종 바이러스에 대비하는 준비를 제공하는 것 외에도이 접근 방식은 미국 정부에서 규정 한 기능 획득 (GOF) 연구 일시 중지 상황에서 고려해야합니다 22 . 이전 출현 모델 ( 도 4a, b )에 기초하여, SHC014-MA15와 같은 키메라 바이러스의 생성은 병원성을 증가시킬 것으로 예상되지 않았다. SHC014-MA15는 부모 마우스 적응 형 SARS-CoV에 비해 약화되지만, MA15 백본 내에서 야생형 Urbani 스파이크가있는 CoV의 병원성을 검사하는 유사한 연구는 마우스에서 체중 감소가없고 바이러스 복제가 감소 된 것으로 나타났습니다 23 . 따라서 Urbani spike-MA15 CoV와 관련하여 SHC014-MA15는 병인의 증가를 보여줍니다 ( 그림 1). 이러한 연구 결과를 바탕으로, 과학적 검토 패널은 포유류 모델에서 병원성이 증가되는 것을 배제 할 수 없기 때문에 추적하기에는 너무 위험한 순환 균주를 기반으로 키메라 바이러스를 구축하는 유사한 연구를 고려할 수 있습니다. 마우스-적응 균주에 대한 제한 및 이스케이프 돌연변이 체를 사용한 모노클로 날 항체의 개발과 함께, CoV 출현 및 치료 효능에 대한 연구는 진전이 심각하게 제한 될 수있다. 이러한 데이터와 제한은 함께 GOF 연구 문제의 교차로를 나타냅니다. 미래의 발발을 준비하고 완화 할 수있는 잠재력은 더 위험한 병원체를 생성 할 위험에 대비해야합니다. 앞으로 정책을 개발함에있어

전반적으로, 우리의 접근 방식은 metagenomics 데이터를 사용하여 순환 박쥐 SARS와 유사한 CoV SHC014에 의해 발생할 수있는 잠재적 위협을 식별했습니다. 키메라 SHC014 바이러스가 인간기도 배양 물에서 복제하고 생체 내에서 병인을 유발 하며 현재의 치료제를 피할 수 있기 때문에 순환 SARS 유사 바이러스에 대한 감시 및 개선 된 치료제가 필요하다. 우리의 접근 방식은 또한 바이러스 발생을 예측하고 미래의 신종 바이러스 감염 치료 준비에이 지식을 적용하기 위해 metagenomics 데이터의 사용을 가능하게합니다.

행동 양식

바이러스, 세포, 시험 관내 감염 및 플라크 분석.

야생형 SARS-CoV (우르 바니), 마우스 적응 SARS-CoV (MA15) 및 키메라 SARS- 유사 CoV를 Dulbecco의 변형 된 독수리에서 자란 Vero E6 세포 (미국 육군 의료 연구소의 전염병에서 획득)에서 배양했습니다. 배지 (DMEM) (Gibco, CA) 및 5 % 태아 클론 혈청 (FCS) (Hyclone, South Logan, UT)과 항생제 / 항균제 (Gibco, Carlsbad, CA). ACE2 오쏘 로그를 발현 하는 DBT 세포 (Baric laboratory, source unknown) 는 이전에 인간 및 사향 모두에 대해 기술되어 왔으며; 박쥐 Ace2 서열은 Rhinolophus leschenaulti의 것을 기초로하고 , 박쥐 Ace2 를 발현하는 DBT 세포 는 이전에 기술 된 바와 같이 확립되었다 8. Pseudotyping 실험은 HIV에 기반을 사용 pseudovirus 유사 하였다 앞서 설명한 제조 10 , 및 발현 HeLa 세포 (바이러스학 무한 연구소)에 조사 ACE2 orthologs한다. HeLa 세포를 최소 필수 배지 전술 한 바와 같은 10 % FCS (깁코, CA)이 보충 된 (MEM) (깁코, CA)에 배양 하였다 (24) . Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 및 1 차 인간기도 상피 세포의 성장 곡선은 앞서 설명한 8 , 25. 최근에 가공 원료를 생성하는 데 사용 된 최초의 종자 스톡은 오염이 없지만, 가공 세포주 스톡은 최근에 마이코 플라스마에 대해 인증되거나 시험되지 않았다. HAE 문화를위한 인간의 폐는 채플 힐 임상 시험 심사위원회 (Chapel Hill Institutional Review Board)에서 승인 한 프로토콜로 노스 캐롤라이나 대학에서 조달되었습니다. HAE 배양은 섬모 세포 및 섬모가 아닌 상피 세포 및 잔 세포를 함유하는 고도로 분화 된 인간기도 상피를 나타낸다. 전술 한 바와 같이 배양은, 사용하기 전에 몇 주 동안 공기 - 액체 계면에서 성장 26. 간략하게, 세포를 PBS로 세척하고 바이러스로 접종하거나 37 ℃에서 40 분 동안 PBS에 모의 희석시켰다. 접종 후, 세포를 3 회 세척하고 새로운 배지를 첨가하여 시간 '0'을 나타냈다. 각각의 기재된 시점에서 3 개 이상의 생물학적 복제물을 수확 하였다. 어떠한 샘플 수집에도 블라 인 딩이 사용되지 않았으며 샘플이 무작위 화되지 않았습니다. 모든 바이러스 배양은 이전에 그룹 2에서 설명한 바와 같이 생물 안전 캐비닛에 여분의 팬이있는 생물 안전 수준 (BSL) 3 실험실에서 수행되었습니다 . 모든 직원은 Tyvek 슈트, 앞치마 및 부티가 장착 된 동력 식 공기 정화 호흡기 (Breathe Easy, 3M)를 착용하고 이중 장갑을 썼습니다.

시퀀스 클러스터링 및 구조 모델링.

대표적인 CoV의 스파이크의 S1 도메인의 전장 게놈 서열 및 아미노산 서열을 젠 뱅크 또는 PATRIC (Pathosystems Resource Integration Center)에서 다운로드하여 ClustalX와 정렬하고 100 부트 스트랩을 사용하여 최대 우도 추정을 사용하여 계통 발생 학적으로 비교 하였다. PhyML 사용 ( https://code.google.com/p/phyml/) 패키지. 트리는 PhyML 패키지와 최대한의 가능성을 사용하여 생성되었습니다. 스케일 바는 뉴클레오티드 치환을 나타낸다. 부트 스트랩을 70 % 이상 지원하는 노드 만 레이블이 붙어 있습니다. 트리는 CoV가 α-CoV, β-CoV 및 γ-CoV로 정의 된 3 개의 별개의 계통 발생 그룹으로 나뉘어져 있음을 보여줍니다. 고전적인 부분 군 군집은 β-CoV의 경우 2a, 2b, 2c 및 2d로 표시되고 α-CoV의 경우 1a 및 1b로 표시됩니다. 모델러 (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit)를 사용하여 구조 모델을 생성하여 결정 구조 2AJF (Protein Data Bank)를 기반으로 ACE2와 복잡한 SARS RBD의 SHC014 및 Rs3367에 대한 상 동성 모델을 생성했습니다 . 상 동성 모델을 MacPyMol (버전 1.3)에서 시각화하고 조작했습니다.

SARS와 같은 키메라 바이러스의 구성.

야생형 및 키메라 바이러스는 SARS-CoV Urbani 또는 앞서 설명한 27에 해당하는 마우스 적응 형 (SARS-CoV MA15) 감염성 클론 (ic)에서 파생되었습니다 . SHC014에 대한 스파이크 서열을 함유하는 플라스미드를 제한 소화에 의해 추출하고 MA15 감염성 클론의 E 및 F 플라스미드에 결찰시켰다. 클론은 독특한 클래스 II 제한 엔도 뉴 클레아 제 부위 (BglI)에 의해 플 랭킹 된 서열을 사용하여 6 개의 연속 cDNA로서 Bio Basic으로부터 설계되고 구입되었다. 그 후, 야생형 키메라 SARS-CoV 및 SHC014-CoV 게놈 단편을 함유하는 플라스미드를 증폭, 절제, 결찰 및 정제 하였다. 이어서, 시험 관내 전사 반응을 수행하여 전장 게놈 RNA를 합성하고,이를 전술 한 바와 같이 Vero E6 세포로 형질 감염시켰다2 . 형질 감염된 세포로부터의 배지를 수확하고 후속 실험을위한 종자 저장 물로서 제공 하였다. 키메라 및 전장 바이러스는 이들 연구에 사용하기 전에 서열 분석에 의해 확인되었다. 키메라 돌연변이 체 및 전장 SHC014-CoV의 합성 구조는 노스 캐롤라이나 대학교 기관 생물 안전위원회 및 이중 사용 연구위원회에 의해 승인되었습니다.

윤리 성명서.

이 연구는 NIH 실험실 동물 복지국 (OLAW)의 동물 관리 및 사용에 대한 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC, 허가 번호 A-3410-01)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는이 연구에 사용 된 동물 연구 프로토콜 (IACUC # 13-033)을 승인했습니다.

마우스 및 생체 내 감염.

암컷, 10 주령 및 12 개월령 BALB / cAnNHsD 마우스를 Harlan Laboratories로부터 주문 하였다. 마우스 감염은 이전에 설명한대로 수행되었습니다 20. 간략하게, 동물을 BSL3 실험실로 가져와 감염 전 1 주일 동안 적응시켰다. 감염 및 생 약독 화 바이러스 백신 접종을 위해, 마우스를 케타민 및 자일 라진의 혼합물로 마취시키고, 도전 될 때, 인당 완충 식염수 (PBS) 50 μl 또는 시점 당 3 또는 4 마우스로 희석 된 바이러스로 비강 내 감염시켰다. 그림 범례에 설명 된 바와 같이 복용량 당 감염 그룹. 개별 마우스의 경우, 전체 용량을 흡입하지 못하거나 코에서 접종 물을 버블 링하거나 입을 통한 감염을 포함한 감염에 대한 표기법은 연구자의 재량에 따라 마우스 데이터를 배제 할 수 있습니다. 감염 후, 다른 사전 확립 된 배제 또는 포함 기준은 정의되지 않았다. 어떠한 동물 실험에서도 눈가림이 사용되지 않았으며, 동물은 무작위 화되지 않았다. 예방 접종의 경우 젊은 마우스 및 노화 된 마우스를 명반 또는 모의 PBS와 함께 20 μl 부피의 0.2 μg의 이중-불 활성화 SARS-CoV 백신 중 20 μl 부피로 풋 패드 주사로 백신 접종 하였다; 이어서, 22 일 후에 동일한 요법으로 마우스를 부스팅하고 그 후 21 일에 공격 하였다. 모든 그룹에 대해, 프로토콜에 따라, 실험 기간 동안 동물의 임상 징후 (웅크림, 주름진 모피 및 감소 된 활성)에 대해 매일 동물을 모니터링 하였다. 최초 7 일 동안 매일 체중 감량을 모니터링 한 후, 동물이 초기 시작 체중으로 회복되거나 3 일 동안 지속적으로 체중 증가를 나타낼 때까지 체중 모니터링을 계속 하였다. 출발 체중의 20 % 이상을 잃은 모든 마우스는 지상 공급되었고 20 % 컷오프 미만인 한 하루에 여러 번 더 모니터링되었다. 출발 체중의 30 % 이상을 잃은 생쥐는 프로토콜에 따라 즉시 희생되었다. 악의적 인 것으로 여겨지거나 회복 될 것 같지 않은 마우스도 연구원의 재량에 따라 인도적으로 희생되었다. 안락사를 이소 플루 란 과다 복용을 사용하여 수행하였고, 자궁 경부 탈구로 사망을 확인 하였다. 모든 마우스 연구는 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 노스 캐롤라이나 대학교 (동물 복지 보증 # A3410-01)에서 수행되었습니다.

조직 학적 분석.

좌측 폐를 제거하고 1 주일 동안 팽창없이 10 % 완충 포르말린 (Fisher)에 침지시켰다. 조직을 파라핀에 매립하고 UNC 라인 버거 종합 암 센터 조직 병리학 핵심 시설에 의해 5μm 섹션을 제조 하였다. 항원 염색의 범위를 결정하려면, 섹션들은 전술 한 바와 같이,기도 및 폐 실질의 염색하여 맹검 방식으로 시판 클론 SARS-COV 안티 뉴 클레오 항체 (Imgenex)를 사용하여 바이러스 항원 염색 획득 하였다 (20) . Olympus DP71 카메라와 함께 Olympus BX41 현미경을 사용하여 이미지를 캡처했습니다.

바이러스 중화 분석.

플라크 감소 중화 역가 검정은 전술 한 11 , 12 , 13 과 같이 SARS-CoV에 대해 이전에 특성화 된 항체로 수행 하였다 . 간략하게, 중화 항체 또는 혈청을 2 배로 연속 희석하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 100 pfu의 상이한 감염성 클론 SARS-CoV 균주와 함께 배양 하였다. 이어서 바이러스 및 항체를 5 x 10 5 Vero E6 세포 를 갖는 6- 웰 플레이트 / 여러 복제물 (웰)로 첨가 하였다 ( n≥ 2). 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션 후, 세포에 배지 중 0.8 ml 아가 로스 3 ml를 겹쳐 놓았다. 플레이트를 37 ℃에서 2 일 동안 인큐베이션하고, 3 시간 동안 중성 적색으로 염색하고 플라크를 계수 하였다. 플라크 감소 백분율은 (1- (항체가있는 플라크 수 / 항체가없는 플라크 수)) × 100으로 계산되었다.

통계 분석.

모든 실험은 2 개의 실험 그룹 (두 바이러스 또는 백신 접종 및 백신 접종되지 않은 코호트)과 대조하여 수행되었다. 따라서, 바이러스 역가 및 조직학 점수의 유의미한 차이 는 개별 시점에서 양측 스튜던트 t- 검정에 의해 결정되었다 . 데이터는 일반적으로 비교되는 각 그룹에 분산되었으며 유사한 분산을 가졌습니다.

생물 안전 및 생물 보안.

보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 대학교 생명 안전위원회가 실험 프로토콜을 승인 한 후 시작되었습니다 (프로젝트 제목 : 박쥐 SARS 유사 CoV의 감염성 클론 생성; 실험실 안전 계획 ID : 20145741; 스케줄 G ID : 12279). 이러한 연구는 인플루엔자, 메르 스 및 사스 바이러스와 관련된 선별 된 기능 향상 연구에 대한 미국 정부의 심의 과정 연구 자금 지원 중단 ( http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function) 전에 시작되었습니다 . .pdf ). 이 논문은 자금 지원 기관인 NIH에 의해 검토되었습니다. 이러한 연구의 계속이 요청되었으며 이는 NIH에 의해 승인되었습니다.

SARS-CoV는 선택 에이전트입니다. 이 연구에 대한 모든 작업은 승인 된 표준 운영 절차 (SOP) 및 SARS-CoV, MERs-CoV 및 기타 관련 CoV에 대한 안전 조건으로 수행되었습니다. 우리 기관의 CoV BSL3 시설은 미생물 및 생의학 실험실 (BMBL), 미국 보건 복지부, 공중 보건 서비스, 질병 통제 센터 (CDC)의 생물 안전에서 권장되는 안전 요구 사항을 준수하도록 설계되었습니다. ) 및 NIH. 실험실 안전 계획이 제출되었으며이 시설은 UNC 환경 건강 안전부 (EHS)와 CDC에 의해 사용이 승인되었습니다. 시설에 입장하려면 전자 카드 액세스가 필요합니다. 모든 근로자는 EHS의 훈련을 받아 공기 청 정식 호흡 보호구 (PAPR)를 안전하게 사용하고, BSL3 시설에서의 적절한 작업 습관과 적극적인 의료 감시 계획이 마련되어 있습니다. CoV BSL3 시설에는 예비 팬, 팬 비상 전원 및 생물학적 안전 캐비닛 및 냉동고가 포함되어 있으며 SealSafe 마우스 랙을 수용 할 수 있습니다. BSL3 작용 제로 분류 된 물질은 SARS-CoV, bat CoV 전구체 균주, MERS-CoV 및 이러한 병원체에서 유래 한 돌연변이 체로 구성됩니다. BSL3 시설 내에서 감염성 바이러스에 대한 실험은 인증 된 Class II Biosafety Cabinet (BSC)에서 수행됩니다. 모든 직원은 문지르 기, 타이벡 복장 및 앞치마, PAPR 및 신발 덮개를 착용하고 손은 이중 장갑을 낀다. BSL3 사용자는 대학 직원 직업 건강 클리닉 (UEOHC)에서 모니터링하는 의료 감시 계획을 준수해야합니다. BSL3에서 일할 때 기간 동안 CoV 감염과 관련된 증상에 대한 연간 인플루엔자 예방 접종 및 의무보고. 모든 BSL3 사용자는 노출 관리 및보고 프로토콜에 대한 교육을 받았으며자가 검역에 대비하고 비상 상황에서 지역 감염성 질병 관리 부서에 안전하게 전달하도록 교육을 받았습니다. 모든 잠재적 노출 사건은 EHS와 UEOHC에 의해보고되고 조사되며 CDC와 NIH에보고됩니다.