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[문형철]

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A non-invasive olfactory bulb measure dissociates Parkinson’s patients from healthy controls and discloses disease duration

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• Open access
• Published: 18 August 2021

A non-invasive olfactory bulb measure dissociates Parkinson’s patients from healthy controls and discloses disease duration

• Behzad Iravani, 
• Artin Arshamian, 
• Martin Schaefer, 
• Per Svenningsson & 
• Johan N. Lundström 

npj Parkinson's Disease volume 7, Article number: 75 (2021) Cite this article

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Abstract

Olfactory dysfunction is a preval‎ent non-motor symptom of Parkinson’s disease (PD). This dysfunction is a result of neurodegeneration within the olfactory bulb (OB), the first processing area of the central olfactory system, and commonly precedes the characteristic motor symptoms in PD by several years. Functional measurements of the OB could therefore potentially be used as an early biomarker for PD. Here, we used a non-invasive method, so-called electrobulbogram (EBG), to measure OB function in PD and age-matched healthy controls to assess whether EBG measures can dissociate PDs from controls. We estimated the spectrogram of the EBG signal during exposure to odor in PD (n = 20) and age-matched controls (n = 18) as well as identified differentiating patterns of odor-related synchronization in the gamma, beta, and theta frequency bands. Moreover, we assessed if these PD-EBG components could dissociate PD from control as well as their relationship with PD characteristics. We identified six EBG components during the initial and later stages of odor processing which dissociated PD from controls with 90% sensitivity and 100% specificity with links to PD characteristics. These PD-EBG components were related to medication, disease duration, and severity, as well as clinical odor identification performance. These findings support using EBG as a tool to experimentally assess PD interventions, potentially aid diagnosis, and the potential development of EBG into an early biomarker for PD.

초록

후각 기능 장애는

파킨슨병(PD)의 흔한 비운동 증상입니다.

이러한 기능 장애는

중추 후각 시스템의 첫 번째 처리 영역인 후각구(OB) 내의

신경 퇴화의 결과이며,

일반적으로 PD의 특징적인 운동 증상보다

몇 년 앞서 나타납니다.

따라서

OB의 기능적 측정은

잠재적으로 파킨슨병의 초기 바이오마커로 사용될 수 있습니다.

여기서는

비침습적 방법인 근전도 electrobulbogram (EBG)를 사용하여

PD와 연령이 일치하는 건강한 대조군에서

OB 기능을 측정하여

EBG 측정이 PD와 대조군을 구분할 수 있는지 평가했습니다.

우리는

PD(n= 20)와 연령이 일치하는 대조군(n= 18)에서

냄새에 노출되는 동안

EBG 신호의 스펙트로그램을 추정하고

감마, 베타 및 세타 주파수 대역에서

냄새 관련 동기화의 차별화 패턴을 확인했습니다.

또한 이러한

PD-EBG 성분이

PD를 대조군으로부터 분리할 수 있는지 여부와

PD 특성과의 관계를 평가했습니다.

우리는

냄새 처리의 초기 및 후기 단계에서 6개의 EBG 성분을 확인했으며,

이 성분들은 90%의 민감도와 100%의 특이도로

PD를 대조군으로부터 분리하고

PD 특성과의 연관성을 확인했습니다.

이러한

PD-EBG 성분은

약물, 질병 기간 및 중증도,

임상 냄새 식별 성능과 관련이 있었습니다.

이러한

연구 결과는

PD 개입을 실험적으로 평가하고,

잠재적으로 진단을 지원하며,

PD의 조기 바이오마커로 EBG를 개발하는 도구로 EBG를 사용하는 것을 뒷받침합니다.

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Introduction

Given the notion that the olfactory bulb (OB) is an indispensable olfactory processing node that is central for many olfactory tasks including, but not limited to, odor discrimination, concentration-invariant odor recognition, odor segmentation, and odor pattern recognition1, olfactory dysfunction is expected to follow impairment to its function. OB is further one of the first sites of insult in the central nervous system in Parkinson’s disease (PD). Under the current concept of PD’s pathology progression, Lewy bodies initiate in the OB and subsequently infiltrate to other neural systems, including olfactory and non-olfactory areas2. As a consequence, the olfactory deficit is a common early symptom in PD which often precedes the characterizing motor symptoms by several years3,4. Olfactory loss has therefore been proposed as a possible biomarker preceding PD clinical diagnosis5. Structural MRI approaches have reported that PD is associated with reduced OB volume6 and fractional anisotropy, measured by diffusion tensor imaging (DTI)7. However, because the OBs are situated in an area susceptible to MR artifacts, the variations between the DTI series are higher than for other brain regions. Moreover, destruction of a large portion of the OB is required before a reduction in olfactory behavioral performance can be detected8, and performance on behavioral tests is confounded by cognitive abilities9. Hence, a direct measure of OB neural responses to odors would be an ideal candidate for a potential early indication of PD that is not dependent on cognitive abilities.

Odor processing has repeatedly been used to dissociate PD patients from healthy controls based on cerebral responses using either EEG10,11,12 or fMRI13,14 measures where several promising results have emerged. All studies to date, however, have obtained results that are more likely linked to either cognitive aspects of the odor percept or indirect measures of OB responses, such as differences in early ERP responses10. This lack of measures from the OB can be explained by the inherent limitations of the various methods used to date that render them unable to assess functional non-invasive measures from the human OB. However, it was recently demonstrated that a reliable odor-related OB signal can be assessed by means of a so-called electrobulbogram (EBG), a non-invasive method that can reliably measure functional OB processing of odors from micro-amplified electrodes on the forehead15. The odor-related EBG response in healthy human participants is defined as an early signal in the gamma band which is thought to reflect mostly within-OB processing16. Interestingly, in vivo recordings from the OB in animal PD models have demonstrated that partial depletion of dopaminergic neurons in the substantia nigra decreases the odor-induced activity in both the gamma and beta bands within the OB17. Taken together, these findings suggest that odor-evoked oscillatory processing within the OB could be an early and sensitive indication of PD.

Previously, the EBG method has been used to assess valence processing18 as well as the communication between OB and olfactory cortex in humans19 where it was demonstrated that OB functions and communicates in multiple frequency bands. Particularly, the afferent connection of OB was demonstrated to operate in the gamma/beta bands whereas the efferent connection of OB in the theta/delta bands19. As mentioned earlier, the past rodent studies indicated that the gamma band oscillation in OB is linked to intra-bulb processes20,21 whereas the theta band is related to respiration21. Nevertheless, theta oscillations in humans have been indicated that have more relevance in odor processing especially in higher-order olfactory regions rather than mere respiration22. In the current study, we used this newly developed technique of non-invasive recording from the human OB (i.e., EBG) to assess whether odor-evoked oscillatory processing within the OB can differentiate diagnosed PD patients from healthy controls. We further determined the sensitivity and specificity of classification for EBG versus a standardized clinical olfactory test. Finally, we assessed whether these EBG responses were associated with standard measures of PD disease progression and severity.

소개

후각 전구(OB)는

냄새 구별, 농도 불변 냄새 인식, 냄새 분할, 냄새 패턴 인식 등

많은 후각 작업의 중심이 되는

필수적인 후각 처리 노드라는 개념을 고려할 때1,

odor discrimination, concentration-invariant odor recognition, odor segmentation, and odor pattern recognition

후각 기능 장애는

그 기능에 장애가 있을 때

뒤따르는 것으로 예상됩니다.

또한

후각은

파킨슨병(PD)의 중추신경계에서

가장 먼저 손상되는 부위 중 하나입니다.

현재

PD의 병리 진행 개념에 따르면,

루이체는 OB에서 시작하여

후각 및 비후각 영역을 포함한 다른 신경계로 침윤합니다2.

결과적으로

후각 결손은

파킨슨병의 흔한 초기 증상으로,

특징적인 운동 증상보다 몇 년 앞서 나타나는 경우가 많습니다3,4.

후각기능 장애는

PD의 가장 초기에 나타나는데,

PD 환자의 90%에서 나타남.

후각 기능 장애는 파킨슨병(PD)의 가장 초기에 나타나는 비운동성 특징 중 하나입니다. 이러한 기능 장애는 초기 PD 환자의 약 90%에서 나타나며, 운동 증상이 시작되기 수년 전에 나타날 수 있습니다. 후각 기능 장애를 일으키는 메커니즘은 현재 알려져 있지 않습니다. 알츠하이머병, 다운증후군, 괌의 파킨슨 치매 복합체에서도 동일한 결손이 관찰되므로 공통된 병리학적 기질이 관여할 수 있습니다. 다계통 위축, 피질 기저부 변성 및 진행성 핵상 마비와 같은 장애에서 후각 상실이 덜 발생하거나 없다는 점을 고려할 때 후각 검사는 감별 진단에 유용할 수 있습니다. 파킨슨병 및 후각 상실을 동반하는 여러 관련 질환의 후각 기능 장애는 코에룰루스, 라페핵, 메이나르트 기저핵과 같은 구조의 뉴런 수 감소와 연관성이 있습니다. 이러한 신경해부학적 소견은 여러 가지 PD 관련 증상에서 자율신경계가 관여한다는 증거와 함께 콜린성, 노르아드레날린성 및 세로토닌성 기능의 결핍이 후각 상실의 원인이 될 수 있음을 시사합니다. 이 리뷰에서는 후각 기능 장애의 원인과 관련이 있을 수 있는 요인을 포함하여 파킨슨병의 후각 기능 장애에 대한 현재 이해에 대해 설명합니다.

따라서

후각 상실은

파킨슨병 임상 진단에 앞서 가능한 바이오마커로 제안되어 왔습니다5.

구조적 MRI 접근법에 따르면 PD는 확산텐서영상(DTI)으로 측정한 후두엽 부피 감소6 및 분수 이방성과 관련이 있다고합니다7. 그러나 후두엽은 MR 아티팩트에 취약한 영역에 위치하기 때문에 다른 뇌 영역에 비해 DTI 계열 간의 차이가 더 높습니다.

또한

후각 행동 수행 능력의 감소를 감지하기 위해서는

OB의 많은 부분이 파괴되어야 하며8,

행동 테스트의 수행 능력은

인지 능력에 의해 혼동될 수 있습니다9.

따라서

냄새에 대한 후각 신경 반응의 직접적인 측정은

인지 능력에 의존하지 않는

잠재적인 PD의 조기 징후에 이상적인 후보가 될 수 있습니다.

냄새 처리는 EEG10,11,12 또는 fMRI13,14 측정을 사용하여 대뇌 반응을 기반으로 건강한 대조군으로부터 PD 환자를 분리하는 데 반복적으로 사용되어 왔으며 몇 가지 유망한 결과가 나타났습니다. 그러나 지금까지의 모든 연구는 냄새 지각의 인지적 측면 또는 초기 ERP 반응의 차이와 같은 후각 반응의 간접적 측정과 관련이 있을 가능성이 높은 결과를 얻었습니다10. 이러한 후각 측정의 부족은 현재까지 사용된 다양한 방법의 내재적 한계로 인해 인간 후각의 기능적 비침습적 측정을 평가할 수 없기 때문으로 설명할 수 있습니다. 그러나 최근 이마의 미세 증폭 전극에서 냄새의 기능적 OB 처리를 안정적으로 측정할 수 있는 비침습적 방법인 소위 근전도(EBG)를 통해 신뢰할 수 있는 냄새 관련 OB 신호를 평가할 수 있음이 입증되었습니다15.

건강한 사람 참가자의 냄새 관련 EBG 반응은 감마 대역의 초기 신호로 정의되며, 이는 대부분 내-OB 처리를 반영하는 것으로 생각됩니다16. 흥미롭게도 동물 PD 모델에서 OB의 생체 내 기록을 통해 흑질 내 도파민성 뉴런의 부분적인 고갈이 OB 내 감마 및 베타 대역 모두에서 냄새 유발 활동을 감소시킨다는 사실이 입증되었습니다17. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 냄새로 인한 후각실질 내 진동 처리가 PD의 조기에 민감한 징후가 될 수 있음을 시사합니다.

이전에는 EBG 방법을 사용하여 원자가 처리18와 인간의 후각 피질과 후각 피질 간의 통신을 평가하는 데 사용되었으며19, 여기서 OB가 여러 주파수 대역에서 기능하고 통신한다는 것이 입증되었습니다. 특히, OB의 구심성 연결은 감마/베타 대역에서 작동하는 반면, 원심성 연결은 세타/델타 대역에서 작동하는 것으로 입증되었습니다19. 앞서 언급한 바와 같이, 과거 설치류 연구에서 OB의 감마 대역 진동은 전구 내 과정과 관련이 있는 반면20,21 세타 대역은 호흡과 관련이 있는 것으로 나타났습니다21. 그럼에도 불구하고 인간의 세타 진동은 단순한 호흡보다는 특히 고차 후각 영역에서 냄새 처리와 더 관련이 있는 것으로 나타났습니다22.

본 연구에서는 새로 개발된

비침습적 기록 기법인 인간 후비갑개(즉, EBG)를 사용하여

후비갑개 내 냄새 유발 진동 처리가

진단된 PD 환자를 건강한 대조군과 구별할 수 있는지 평가했습니다.

또한 표준화된 임상 후각 테스트와 비교하여

EBG에 대한 분류의 민감도와 특이도를 확인했습니다.

마지막으로,

이러한 EBG 반응이

PD 질환 진행 및 중증도의 표준 측정과 관련이 있는지

평가했습니다.

Results

Compared to Controls, PD patients demonstrated a clear olfactory impairment when assessed using a 16-item odor identification (odor ID) test23, t(36) = 7.70, p < 0.001, CI = [4.77, 8.18]. Participants’ OB responses were then assessed by exposing them to 1 s long stimuli consisting of either odor (3 iso-intense odors with diverse quality) or non-odorized air (to remove sniff only response) using 4 EBG electrodes attached on participants’ forehead. Initially, to assess potential differences in odor-dependent OB responses between PD and Control, the spectrogram of the EBG signal was estimated using a multi-taper convolution method, and, subsequently, sniff and evoked responses were removed. In addition, we assessed whether the differences found in the EBG spectrogram can be used to distinguish PDs from Controls and their relationship with PD parameters.

결과

16개 항목으로 구성된

냄새 식별(냄새 ID) 테스트23, t(36) = 7.70, p<0.001, CI= [4.77, 8.18]로 평가했을 때

대조군과 비교하여

PD 환자는

명확한 후각 장애가 있는 것으로 나타났습니다.

그런 다음

참가자의 이마에 부착된 4개의 EBG 전극을 사용하여

냄새(다양한 품질의 세 가지 등강도 냄새) 또는

냄새가 없는 공기(후각 반응만 제거)로 구성된 1초 길이의 자극에 노출시켜

참가자의 OB 반응을 평가했습니다.

처음에는 PD와 대조군 간의 냄새 의존적 OB 반응의 잠재적 차이를 평가하기 위해 다중 테이퍼 컨볼루션 방법을 사용하여 EBG 신호의 스펙트로그램을 추정하고, 이후 스니핑 및 유발 반응을 제거했습니다. 또한 EBG 스펙트로그램에서 발견된 차이점을 사용하여 PD와 대조군을 구별할 수 있는지 여부와 PD 파라미터와의 관계를 평가했습니다.

EBG measure in PD and healthy Control

First, we replicated the healthy EBG odor response in Controls using the same method as in Iravani et al.15. The location of EBG electrodes is illustrated in Fig. 1a. As predicted, we detected an early gamma synchronization after sniffing an odor in the EBG electrodes, Fig. 1b, a result similar to what has previously been described for the EBG response15. This validated that we could detect a robust OB signal in Controls in the present dataset. However, when we assessed the EBG spectrogram at the same time and frequency intervals in PD patients, no gamma synchronization was detected, Fig. 1c. Next, we assessed whether the EBG response to odors differed between PD and Control using a multi-taper sliding window to produce time-frequency maps of the EBG odor response. We found that the control group, when contrasted against the PD group and while controlling for a sniff and evoked responses, had greater odor-induced power in the theta, beta, and gamma band, Fig. 1d. To isolate specific areas that are significantly different between the two groups, we subsequently used non-parametric tests with 1000 permutations and found that the increases in power were significant for Control, compared to PD, in the gamma band around 460 ms after odor onset, t(37) = 3.28, p < 0.001, the beta band around 620 ms, t(37) = 2.7, p < 0.006, and finally in the theta band around 680 ms, t(37) = 3.87, p < 0.001, Fig. 1e. Comparably, we found a decrease in the power of gamma frequency around 660 ms, t(37) = 3.13, p < 0.002, as well as 980 ms, t(37) = 2.23, p < 0.012, and alpha/beta around odor onset, t(37) = 3.50, p < 0.02, in Control group compared with PD, Fig. 1f. We subsequently labeled these significant clusters (p < 0.05, cluster size > 100) based on the order of appearances as Component 1, Component 2, etc. A total of six components were identified, as illustrated in Fig. 1g. Here, Components 2, 3, and 4 had higher power in Controls whereas Components 1, 5, and 6 had lower power in Controls (i.e., higher power in PDs).

PD 및 건강한 대조군에서의 EBG 측정

먼저, 우리는 Iravani등15에서와 동일한 방법을 사용하여

대조군에서 건강한 EBG 냄새 반응을 재현했습니다.

EBG 전극의 위치는 그림 1a에 나와 있습니다.

예상대로, 우리는 EBG 전극에서 냄새를 맡은 후 초기 감마 동기화를 감지했습니다(그림 1b). 이는 이전에 설명한 EBG 반응과 유사한 결과입니다15. 이를 통해 현재 데이터 세트의 컨트롤에서 강력한 OB 신호를 감지할 수 있음을 확인했습니다. 그러나 PD 환자에서 동일한 시간 및 주파수 간격으로 EBG 스펙트로그램을 평가했을 때 감마 동기화는 감지되지 않았습니다(그림 1c). 다음으로, 멀티 테이퍼 슬라이딩 창을 사용하여 냄새에 대한 EBG 반응이 PD와 대조군 간에 차이가 있는지 평가하여 EBG 냄새 반응의 시간-주파수 맵을 생성했습니다. 그 결과, 대조군은 PD군과 비교했을 때 냄새를 맡고 유발된 반응을 통제한 상태에서 세타, 베타, 감마 대역에서 냄새 유발력이 더 큰 것으로 나타났습니다(그림 1d). 두 그룹 간에 유의미한 차이가 있는 특정 영역을 분리하기 위해 1000개의 순열을 사용한 비모수 테스트를 실시한 결과, 냄새가 시작된 후 460ms 전후의 감마 밴드에서 t(37) = 3.28, p<0.001, 620ms 전후의 베타 밴드에서 t(37) = 2.7, p<0.006, 마지막으로 680ms 전후의 세타 밴드에서 t(37) = 3.87, p<0.001, 그림 1e에서 PD에 비해 대조군의 파워 증가가 유의미하다는 것을 확인할 수 있었습니다. 이와 비교하여, 대조군에서는 냄새가 시작되는 약 660 ms, t(37) = 3.13, p<0.002, 980 ms, t(37) = 2.23, p<0.012, 냄새가 시작되는 약 알파/베타, t(37) = 3.50, p<0.02의 감마 주파수의 파워가 감소한 것을 발견했습니다(그림 1f, PD와 비교). 이후 이러한 유의미한 군집(p< 0.05, 군집 크기 > 100)을 출현 순서에 따라 컴포넌트 1, 컴포넌트 2 등으로 라벨링했습니다. 그림 1g에 표시된 것처럼 총 6개의 구성 요소가 확인되었습니다. 여기서 컴포넌트 2, 3, 4는 대조군에서 더 높은 파워를 가진 반면, 컴포넌트 1, 5, 6은 대조군에서 더 낮은 파워를 가졌습니다(즉, PD에서 더 높은 파워를 가짐).

Fig. 1: EBG measure can dissociate PD from control.

a Placement of EBG electrodes on the forehead. b Odor-induced EBG response in the healthy controls replicates earlier studies. Gamma synchronization appears briefly after the odor onset (indicated by the horizontal white line at Time 0) for Controls. c No gamma synchronization was found for PDs in the same time period (EBG area of interest was marked with a black rectangle). Warmer colors indicate synchronization whereas cooler colors indicate desynchronization compared to Sniff (clean air). d T-map derived from 1000 Monte Carlo permutation tests. Early and late differences between Control and PD are statistically meaningful in theta, beta, and gamma band. e Threshold t-maps indicating areas with p < 0.05 where power is more for Control compared with PD. f Threshold t-maps indicating areas with p < 0.05 where power is less for Control compared with PD. Warmer colors in the t-maps represent higher t-values. g Clusters of significance (p < 0.05, cluster size > 100) differentiated EBG components that dissociate Control from PD. Specifically, we isolated six different components in the gamma, beta, and theta bands during the early and late time points. Each component is illustrated with a specific color and color labels can be found in the color bar on the right side of the panel.

a 이마에 EBG 전극을 배치한 모습. b 건강한 대조군에서 냄새로 인한 EBG 반응은 이전 연구와 유사합니다. 감마 동기화는 대조군의 경우 냄새가 시작된 직후에 잠깐 나타납니다(시간 0의 가로 흰색 선으로 표시). c 같은 기간 동안 PD의 경우 감마 동기화가 발견되지 않았습니다(관심 EBG 영역은 검은색 사각형으로 표시됨). 따뜻한 색은 동기화를 나타내고 차가운 색은 스니프(깨끗한 공기)와 비교하여 동기화 해제됨을 나타냅니다. d 1000회의 몬테카를로 순열 테스트에서 파생된 T맵. 세타, 베타, 감마 밴드에서 통계적으로 의미 있는 제어와 PD의 초기 및 후기 차이를 나타냅니다. e 임계값 t-맵은 PD에 비해 제어의 파워가 더 큰 영역에서 p< 0.05인 영역을 나타냅니다. f 임계값 t-맵은 PD에 비해 제어의 파워가 더 작은 영역에서 p< 0.05인 영역을 나타냅니다. t 맵의 색상이 따뜻할수록 t값이 높음을 나타냅니다. g 유의미한 클러스터(p< 0.05, 클러스터 크기 > 100)는 PD에서 컨트롤을 분리하는 EBG 구성 요소를 구분합니다. 특히 초기 및 후기 시점에서 감마, 베타, 세타 대역에서 6개의 서로 다른 구성 요소를 분리했습니다. 각 구성 요소는 특정 색상으로 표시되어 있으며 패널 오른쪽의 색상 표시줄에서 색상 레이블을 확인할 수 있습니다.

To assess the generalizability of our findings and to determine whether the differences in spectrogram between PD and Control are not dependent on a group level effect but also exist on the trial level, we performed intra-class correlation, namely ICC(2,k), to eval‎uate the level of agreement of each component across individuals in the two groups. We found medium to high ICC outcomes [0.46–0.78] for all detected components (Supplementary Fig. 1), thereby suggesting that these results are likely to replicate in an independent sample with similar individual characteristics.

연구 결과의 일반화 가능성을 평가하고 PD와 대조군 간의 스펙트로그램 차이가 그룹 수준의 효과에 의존하는 것이 아니라 시험 수준에서도 존재하는지 확인하기 위해 클래스 내 상관관계, 즉 ICC(2,k)를 수행하여 두 그룹의 개인 간 각 구성 요소의 일치 수준을 평가했습니다. 탐지된 모든 구성요소에 대해 중간에서 높은 ICC 결과[0.46-0.78]를 발견했으며(보충 그림 1), 이는 이러한 결과가 유사한 개별 특성을 가진 독립 표본에서도 재현될 가능성이 있음을 시사합니다.

EBG measure versus odor ID in dissociating PD from healthy Control

We found six significant clusters in the time-frequency map of odor EBG responses that allowed us to differentiate between PD and Control. Next, we determined the sensitivity and specificity of the EBG results, as well as assessed how the EBG measures compared to a standard 16-item clinical cued odor ID test, using mixed-effect logistic regression models with the EBG components as independent variables.

We first assessed the goodness of the fit for each EBG component by in-sample prediction error estimated by means of Akaike information criteria (AIC). We found that all EBG components’ AIC value was lower than the 16-item odor ID model. This means that the EBG models fit the obtained result better than the 16-item odor ID test, Fig. 2a. However, some EBG models worked better than others. For example, the model with Component 1 had the lowest AIC, 168.05, and outperformed the rest of the EBG models (Component 3 (AIC = 169.07), Component 6 (AIC = 171.24), Component 4 (AIC = 172.57), Component 2 (AIC = 173.62), and Component 5 (AIC = 175.64), Fig. 2b. However, these models are not nested, and assessing only in-sample error might not be sufficient. Therefore, we further assessed the sensitivity and specificity of each model. We did not achieve high sensitivity and specificity with models including only one EBG component, Fig. 2c. Therefore, we stepwise added components to the logistic regression and assessed prediction accuracy. We found a maximum accuracy of 94% with an AIC = 279.11 for a model including 4 components (Components 5, 4, 2, and 6), Fig. 2d. This model demonstrated a similar fit to the data as the 16-item odor model (AIC = 276.27). We then explored the sensitivity and specificity of the multicomponent EBG model. The odor ID model produced high values (sensitivity 90%; specificity 94%) whereas the multicomponent EBG resulted in 90% sensitivity and 100% specificity, Fig. 2e; this can be viewed as high values but nominally with more in-sample error compared with the 16-item odor ID model.

PD와 건강한 대조군을 구분하기 위한 냄새 ID와 EBG 측정값 비교
냄새 EBG 반응의 시간-주파수 맵에서 PD와 대조군을 구분할 수 있는 6개의 유의미한 클러스터를 발견했습니다. 다음으로, EBG 결과의 민감도와 특이도를 측정하고, EBG 구성 요소를 독립변수로 하는 혼합 효과 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 16개 항목으로 구성된 표준 임상적 단서 냄새 ID 테스트와 비교하여 EBG 측정값이 어떻게 나타나는지 평가했습니다.

먼저 Akaike 정보 기준(AIC)으로 추정된 표본 내 예측 오차를 통해 각 EBG 구성 요소에 대한 적합도를 평가했습니다. 그 결과 모든 EBG 구성 요소의 AIC 값이 16개 항목의 냄새 ID 모델보다 낮은 것으로 나타났습니다. 이는 16개 항목의 냄새 ID 테스트(그림 2a)보다 EBG 모델이 도출된 결과에 더 잘 부합한다는 것을 의미합니다. 그러나 일부 EBG 모델은 다른 모델보다 더 잘 작동했습니다. 예를 들어, 구성 요소 1을 사용한 모델은 AIC가 168.05로 가장 낮았으며 나머지 EBG 모델(구성 요소 3(AIC = 169.07), 구성 요소 6(AIC = 171.24), 구성 요소 4(AIC = 172.57), 구성 요소 2(AIC = 173.62), 구성 요소 5(AIC = 175.64), 그림 2b)보다 성능이 뛰어났습니다. 그러나 이러한 모델은 중첩되지 않았기 때문에 샘플 내 오차만 평가하는 것은 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 각 모델의 민감도와 특이도를 추가로 평가했습니다. 그림 2c와 같이 하나의 EBG 구성 요소만 포함하는 모델에서는 높은 민감도와 특이도를 얻지 못했습니다. 따라서 단계적으로 로지스틱 회귀에 구성 요소를 추가하고 예측 정확도를 평가했습니다. 4개의 구성 요소(구성 요소 5, 4, 2, 6)를 포함하는 모델의 경우 최대 정확도가 94%(AIC = 279.11)로 나타났습니다(그림 2d). 이 모델은 16개 항목으로 구성된 냄새 모델(AIC = 276.27)과 데이터와 유사한 적합도를 보였습니다. 그런 다음 다성분 EBG 모델의 민감도와 특이도를 살펴봤습니다. 냄새 ID 모델은 높은 값(민감도 90%, 특이도 94%)을 생성한 반면, 다성분 EBG는 민감도 90%, 특이도 100%(그림 2e)로 나타나 16항목 냄새 ID 모델에 비해 명목상으로는 높은 값이지만 표본 내 오차가 더 큰 것으로 볼 수 있습니다.

Fig. 2: Comparison within EBG models as well as EBG and odor identification models.

a Akaike information criteria (AIC) for each EBG component and 16-item odor ID. b Zoomed-in AIC values for the only EBG models. c Cross table of each component of the EBG models shows true/false positive/negative values. The colors of the EBG components in the panel (a), (b) and (c) correspond with Fig. 1g. d Accuracy of models with stepwise adding components shows maximum accuracy for the model includes components 5, 2, 4, and 6. Peak accuracy is marked with a filled yellow circle. e Crosstables of 16-item odor ID and multicomponent EBG model show comparable sensitivity and higher specificity, yet we found slightly more in-sample error compare with 16-item odor ID.

The cross table in Fig. 2e demonstrates that 1 individual was a false positive and 2 false negatives for the 16-item odor ID model whereas the EBG model produced 2 false-negative individuals. We subsequently assessed occurred errors in the models by plotting the decision boundary and identifying those individuals who were erroneously labeled. This analysis indicated that the two individuals who were incorrectly classified in the two models were not the same across models, Fig. 3a. Regarding the 16-item odor ID model, misclassifications are straightforward. Patients who did not develop hyposmia are here wrongly classified as control participants and the Control participant who was on the border of hyposmia was falsely classified as PD, Fig. 3b. The EBG model assigned all these individuals correctly to their respective groups. However, two other individuals were wrongly classified (false negatives) as healthy participants. One of the false negatives in the EBG model had more severe PD symptoms and cognitive deficits than the PD group as a whole, Fig. 3c.

그림 2e의 교차 표는 16개 항목 냄새 ID 모델에서는 1개 개체가 위양성, 2개 개체가 위음성인 반면, EBG 모델에서는 2개 개체가 위음성을 생성했음을 보여줍니다. 그 후 결정 경계를 플로팅하고 잘못 분류된 개체를 식별하여 모델에서 발생한 오류를 평가했습니다. 이 분석 결과, 두 모델에서 잘못 분류된 두 개체는 두 모델에서 동일하지 않은 것으로 나타났습니다(그림 3a). 16개 항목으로 구성된 냄새 ID 모델의 경우, 오분류는 간단합니다. 여기서 저산소증이 발생하지 않은 환자는 대조군 참가자로 잘못 분류되었고 저산소증 경계에 있던 대조군 참가자는 PD로 잘못 분류되었습니다(그림 3b). EBG 모델은 이 모든 개인을 각 그룹에 올바르게 배정했습니다. 그러나 다른 두 명은 건강한 참가자로 잘못 분류(위음성)되었습니다. EBG 모델의 위음성 중 하나는 전체 PD 그룹보다 더 심각한 PD 증상과 인지 결손을 보였습니다(그림 3c).

Fig. 3: The logistic regression decision boundary.

a Violin plot shows the distribution for 16-item odor ID responses and EBG responses. The scatter plot within the distribution shows individual responses. The black box shows the 25 and 75 percentiles in which the white dot shows the median. The whiskers show the maximum and minimum within 1.5 times of the interquartile range. The logistic decision boundary is shown with the dashed line. b Radar plot shows the demographic and PD parameters for the false negatives that occurred in the 16-item odor ID model. c Similarly, the radar plot shows the demographic and PD parameters for the false negatives that occurred in the EBG model. The dashed line in (b) and (c) shows the mean response. Note, all the false negatives had an available MDS-UPDRS score.

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EBG components are linked to clinical PD measures

Having established that the EBG measure could distinguish PDs from controls, we next assessed whether the obtained results were linked to individual clinical PD disease parameters. To this end, we determined the potential relationships between the obtained EBG components and clinical measures using mixed-effect linear regression models. Specifically, we determined whether levels of the identified EBG components were associated with LEDD (i.e., medication dosage), disease duration, Hoehn and Yahr disease severity, and results on the 16-item ID test. We found that the values of both Component 4, t(31) = −3.07, p < 0.004, CI = [−0.83, −0.17], and Component 6, t(31) = 2.43, p < 0.021, CI = [0.055, 0.63], significantly predicted LEDD scores. Moreover, Component 4, t(31) = −2.52, p < 0.017, CI = [−1.85, −0.19], Component 5, t(31) = 2.10, p < 0.018, CI = [0.018, 1.35], and Component 6, t(31) = 2.34, p < 0.026, CI = [0.10, 1.54], were significantly related to disease duration. For PD H&Y disease severity, Component 2, t(31) = −2.35, p < 0.027, CI = [−0.60, −0.039], and Component 6, t(31) = 2.56, p < 0.015, CI = [0.073, 0.64], were significant. Finally, there were significant relationships between the values of Component 2, t(31) = 2.07, p < 0.046, CI = [0.005, 0.56], Component 5, t(31) = −2.33, p < 0.027, CI = [−0.56, −0.037], as well as Component 6, t(31) = −2.48, p < 0.018, CI = [−0.63, −0.062], and odor ID performance, Fig. 4a. Moreover, no correlation was found between the EBG components and age (all p-values above 0.18), but there was a significant negative correlation between MoCA and Component 3, r (16) = −0.60, p < 0.009, as well as Component 4, r(16) = −0.49, p < 0.04, in PDs.

Fig. 4: EBG components are associated with PD and olfactory performance.

a Beta values for EBG components that associate with Levodopa equivalent daily dose (LEDD), disease duration, Hoehn & Yahr (H&Y) disease severity, and odor ID performance in PD individuals. Error bars show the standard error of the mean (s.e.m). Asterisks show significant components (p < 0.05). b Thousand-randomization bootstrap test was carried out for the significant components and exact p-values were subsequently estimated.

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Finally, to further validate associations between the EBG components and clinical PD parameters, we resampled data using 1000-randomization bootstrap and extracted p-values. However, only two of the associations survived the bootstrap test, namely the association between H&Y disease severity and Component 2 as well as the association between odor ID and Component 6, Fig. 4b. The remaining associations demonstrated reduced statistical significance with the largest p-value being p = 0.15.

Discussion

Objective measurement of OB’s function has the potential to enable early diagnosis of PD, possibly several years before motor symptom onset. We previously found that EBG can reliably measure the function of OB in healthy participants15. Moreover, EBG was demonstrated to have high test-retest reliability (r = 0.81) similar to that of visual event-related potentials15. Here, we determined whether the EBG measure can be used as a PD detection tool by assessing whether the EBG measure alone is able to dissociate diagnosed PD patients from age-matched non-PD controls. Signals obtained using the EBG measure allowed us to identify OB response components, spread across frequencies and time intervals, that enabled us to discriminate between the PD and the control group. Individual EBG components were further demonstrated to be associated with clinical outcome parameters. Moreover, using logistic regression models, the EBG measure was able to dissociate PDs from Controls on the individual level to the same degree as a model based on odor ID performance. Albeit further development is needed before implementation as a clinical tool, these proof-of-concept results indicate that the EBG measure might be used as a potential early marker of PD.

We found different patterns of EBG signal’s power between Controls and PD patients in the gamma, beta, and theta bands during odor processing. Because the gamma band is mainly attributed to the within-OB processes20,24, the detected differences support the well-established neuronal loss-dependent impairment of OB processing in PD8. Moreover, activities in the beta/theta bands are likely generated by top-down projections16 which is further supported by their late latency in the present data. This result suggests an impairment in the bi-directional interaction between the OB and higher olfactory cortex regions (e.g., amygdala and the orbitofrontal cortex) that are involved in processing different aspects of odor perception and valence25. Notably, a behavioral study has found that odor valence perception is impaired in PD26, and in the results presented within this paper, the majority of identified components are relatively late in the neural processing cascade. This might be of special relevance given that previous olfactory event-related potential studies in PD patients have shown that the amplitude of the late components is lower compared to the healthy controls10, hence indicating that OB upstream communication is inhibited. The exact involvement of various brain areas in the obtained results should be assessed in future studies. However, it is worth noting that the sample size of this study is relatively small. Therefore, to discern the generalizability of our findings, we estimated the ICC which demonstrated medium to high agreement of Components across participants on the trial level. These ICC results suggest that it is likely that our findings can be replicated in a larger and independent sample.

The model including EBG components fitted the data with a slightly higher specificity than the 16-item odor ID model. Moreover, the false negatives occurring in the 16-item odor ID model were correctly assigned to the PD cohort in the EBG model. This result suggests that EBG, a measure that does not rely on cognitive and individualized judgment, can potentially be used to dissociate PDs from Controls. One of the early EBG components (Component 2) demonstrating the strongest correlation with PD disease severity appeared in the gamma band, a frequency attributed to within-OB processing. Hence, this potentially means that it is within-OB processing, or initial OB processing, that demonstrates the closest link to behavioral odor measures in PD. Moreover, no correlation was found between this component and cognitive measure, thereby suggesting that Component 2 is less dependent on the higher-order brain function. Previous studies suggest that olfactory loss is a common symptom in PD3,4,27. Accordingly, the late components (Components 5 and 6) were clearly and inversely associated with odor ID, a test that is partly dependent on cognitive functions9 such as the processing of labels and cues. Component 6 also demonstrated a direct relationship with H&Y disease severity, thus the change of the directionality of Component 6 association with H&Y disease severity compared to odor ID, indicated that PD individuals with high EBG values (i.e., good OB responses) had olfactory function more similar to Controls and were lower in the H&Y disease severity. However, when we tested the associations with a conservative 1000-randomization bootstrap test, only associations between H&Y disease severity as well as odor ID with EBG components marginally survived suggesting that these findings should be interpreted with caution and replicated in a larger sample. It is worth noting, however, that statistical permutation testing is a conservative test that controls for multiple statistical testing.

The current study is an attempt to use EBG, a measure of OB function, to aid the diagnosis of PD. However, it is not the first olfactory-related electroencephalography measure that has been used10,11,27. Contrary to other olfactory-related electroencephalography measures, however, the EBG method targets the OB directly, one of the first sites of insult in PD. Accordingly, the EBG measure is a promising candidate for predicting early PD development in at-risk groups. Importantly, it is also independent of cognitive performance and therefore might be a more suitable measure than behavioral odor ID tests which can be biased and affected by dementia and other cognitive impairments commonly found in PD28,29. Finding a reliable biomarker for PD using EEG has been the objective of many past research studies. However, a larger meta-analysis concluded that there is no evidence to support the use of electrophysiological tests as PD biomarker30. That said, all studies included in the meta-analysis assessed either ERPs or global power change, measures that are too general to target any specific area in the cortex. On the other hand, more recent studies assessing oscillatory responses in PD patients document more promising results where one study demonstrated that assessments of gamma power can dissociate PD from controls31. However, results are reported only on group level and lack sensitivity and specificity analysis. Likewise, a study employing PCA-based classification and focusing only on slow oscillations found an in- and out-sample accuracy of 85%32. Comparably, in the present study, we achieved a 94% accuracy, probably due to specifically targeting a region in the human brain that is a key region in early PD disease progression, the OB. That said, the EBG model’s in-sample prediction in the current dataset, despite having a higher specificity and similar sensitivity, nominally underperformed the 16-item odor ID model. One possible reason that the EBG model and the 16-item odor ID model have similar prediction error and sensitivity could be that several of the PD patients had already developed clear olfactory deficits, thereby rendering the sensitivity and prediction error of the 16-item odor ID model to be similar to the EBG model. It is worth highlighting that the two false negatives identified in the two models are different individuals. In the 16-item odor ID model, the two false negatives are both patients who did not demonstrate a reduced sense of smell, whereas these two patients were correctly assigned to the PD group in the EBG model. Hence, these differences in performance of the two models indicated that the EBG model is not merely reflecting olfactory dysfunction but relates to specific effects of PD. Using full olfactory performance testing instead of odor ID alone is likely to improve the olfactory-based methods but this improvement might not alleviate their dependency on olfactory dysfunction whereas the EBG seems to depend on PD-relevant aspects beyond mere olfactory dysfunction. The two false negatives in the EBG model did not seem to have any apparent commonalities in PD or demographic parameters that led to misclassification in the EBG model. That said, the increased specificity in the EBG model should be replicated in data with a larger sample size and more specifically, in an at-risk group. However, the general aim of this first study was to determine the feasibility of dissociating PD patients from healthy controls by means of the EBG measure. Given that the included PD patients in this proof-of-concept study had already received their PD diagnosis and the common and early pre-diagnostic occurrence of olfactory deficits, it is likely that the EBG model’s sensitivity would outperform the 16-item odor model in either pre-diagnostic PD patients, or in an at-risk group population, without clear olfactory dysfunction.

It should be stressed that these data support the use of EBG as a potential clinical tool for early PD screening but do not demonstrate an implementation-ready method. Further studies in at-risk populations and PD sub diagnoses are needed. That said, the clinical usefulness of a developed EBG-based PD screening method is considerable given that EBG assessments can be performed in a fully automatic manner with minimum dependency on the individual’s motor, cognitive, and verbal abilities, i.e., the test has the potential to be a non-invasive and easily accessible clinical test that estimates of the probability of developing PD can be based upon. However, the current method has limitations. The present electrode setup and the volume conduction do not allow us to dissociate between the left and right OB. A measure of hemispheric differences in potential early PD patients would add diagnostic value given from the clear laterality of early disease stages. However, further developments of the method might enable this in the future33. Moreover, patients with late stages of PD might have reduced sniff functions34. However, we did not find differences in the early theta band, the known sniff-dependent frequency, at the time window of relevance. Moreover, by removing the sniff-triggered event-related signal, we limited this potential difference. Also, although we use a sniff-triggered presentation, the odors are delivered at the same speed for all participants to a point high up in the nasal cavity, thus reducing potential differences in sniff magnitudes between participants34 rendering an odor percept largely independent of sniff magnitude. Another possible limitation of this study is the low number of included women. Relatedly, we were unable to assess potential sex-dependent effects on the results due to the small number of included women; however, it is worth noting that a recent meta-analysis indicated that the sex-dependent effect is small to non-existing in human olfaction35. Nonetheless, before introducing the EBG as a PD diagnostic tool, potential effects or confounds of the individual’s sex, as well as its ability to detect subtypes of PD, should be assessed in a larger sample.

To conclude, we used a non-invasive measure of OB function—the EBG—to dissociate PD from age-matched controls. The spectrogram of the EBG measures was used to assess the differences in odor processing in PDs and Controls. Specifically, we found different patterns of synchronization for PD as compared to Control and identified six specific EBG components, including gamma, beta, and theta band during both early and late time points. Using these EBG components, we marginally out-performed a clinical odor ID test while keeping a similar level of sensitivity and in-sample error prediction. Finally, these EBG components are specifically related to disease characteristics and the late components are related to olfactory tests. Taken together we argue that this method can be further developed to facilitate early diagnosis of PD and provide a robust and objective biomarker.

토론

OB의 기능을 객관적으로 측정하면

운동 증상이 나타나기 몇 년 전에

PD를 조기에 진단할 수 있는 잠재력이 있습니다.

우리는

이전에 EBG가 건강한 참가자의 OB 기능을

안정적으로 측정할 수 있다는 사실을 발견했습니다15.

또한,

EBG는

시각적 사건 관련 전위와 유사한

높은 검사-재검사 신뢰도(r= 0.81)를 보이는 것으로 입증되었습니다15.

여기서는

EBG 측정만으로

진단된 PD 환자를 연령이 일치하는 비PD 대조군으로부터 분리할 수 있는지 평가하여

EBG 측정이 PD 감지 도구로 사용될 수 있는지 여부를 확인했습니다.

EBG 측정을 사용하여 얻은 신호는 주파수와 시간 간격에 걸쳐 분산된 OB 반응 구성 요소를 식별하여 PD와 대조군을 구별할 수 있게 해 주었습니다. 개별 EBG 구성 요소는 임상 결과 매개변수와 연관성이 있음이 추가로 입증되었습니다. 또한 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 EBG 측정은 냄새 ID 성능에 기반한 모델과 동일한 수준으로 개별 수준에서 PD와 대조군을 분리할 수 있었습니다. 임상 도구로 구현하기 전에 추가 개발이 필요하지만, 이러한 개념 증명 결과는 EBG 측정이 잠재적인 PD의 초기 마커로 사용될 수 있음을 나타냅니다.

냄새를 처리하는 동안

감마, 베타, 세타 대역에서

대조군과 PD 환자 간에 서로 다른 패턴의 EBG 신호 파워를 발견했습니다.

감마 대역은 주로 후각 처리 과정20,24에 기인하기 때문에,

감지된 차이는 PD8에서 후각 처리의 신경세포 손실 의존성 손상이

잘 확립되어 있음을 뒷받침합니다.

또한 베타/세타 대역의 활동은

하향식 투영에 의해 생성된 것으로 보이며16,

이는 현재 데이터에서 늦은 지연 시간으로 더욱 뒷받침됩니다.

이 결과는 냄새 지각과 원자가의 다양한 측면을 처리하는 데 관여하는 OB와 상위 후각 피질 영역(예: 편도체 및 안와전두피질) 간의 양방향 상호 작용에 장애가 있음을 시사합니다25. 특히, 행동 연구에 따르면 냄새 원자가 지각이 PD26에서 손상된다는 사실이 밝혀졌으며, 이 논문에서 제시된 결과에서 확인된 대부분의 구성 요소는 신경 처리 캐스케이드에서 비교적 늦은 단계에 있습니다. 이는 PD 환자를 대상으로 한 이전의 후각 사건 관련 잠재성 연구에서 후기 구성 요소의 진폭이 건강한 대조군에 비해 낮다는 사실이 밝혀진 것을 고려할 때 특별한 의미가 있을 수 있습니다10, 따라서 OB 업스트림 통신이 억제됨을 나타냅니다. 얻어진 결과에서 다양한 뇌 영역의 정확한 관련성은 향후 연구에서 평가되어야 합니다. 그러나 이 연구의 표본 크기가 상대적으로 작다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 따라서 연구 결과의 일반화 가능성을 파악하기 위해 임상시험 수준에서 참가자 간 구성 요소의 중간에서 높은 일치도를 보인 ICC를 추정했습니다. 이러한 ICC 결과는 본 연구 결과가 더 크고 독립적인 표본에서 재현될 수 있음을 시사합니다.

EBG 구성 요소를 포함한 모델은 16개 항목으로 구성된 냄새 ID 모델보다 약간 더 높은 특이도로 데이터에 적합했습니다. 또한 16개 항목 냄새 ID 모델에서 발생하는 위음성(false negative)은 EBG 모델에서 PD 코호트에 올바르게 할당되었습니다. 이 결과는 인지적이고 개별화된 판단에 의존하지 않는 측정치인 EBG가 잠재적으로 PD를 대조군으로부터 분리하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. PD 질환 중증도와 가장 강력한 상관관계를 보인 초기 EBG 구성 요소 중 하나(구성 요소 2)는 감마 대역에서 나타났으며, 이는 내-OB 처리에 기인하는 주파수입니다. 따라서 이는 잠재적으로 PD의 행동 냄새 측정과 가장 밀접한 연관성을 보여주는 것이 OB 내 처리 또는 초기 OB 처리라는 것을 의미합니다. 또한, 이 구성 요소와 인지 측정 간에는 상관관계가 발견되지 않아 구성 요소 2가 고차원적인 뇌 기능에 덜 의존한다는 것을 시사합니다. 이전 연구에 따르면 후각 상실은 PD의 흔한 증상입니다3,4,27. 따라서 후기 구성 요소(구성 요소 5 및 6)는 라벨 및 단서 처리와 같은 인지 기능9에 부분적으로 의존하는 테스트인 냄새 ID와 명확하고 반비례하는 것으로 나타났습니다. 구성요소 6은 또한 H&Y 질환 중증도와 직접적인 관계를 보였으며, 따라서 냄새 ID와 비교한 구성요소 6의 H&Y 질환 중증도 연관성의 방향성 변화를 보면, EBG 값이 높은(즉, OB 반응이 좋은) PD 개인은 후각 기능이 대조군과 더 유사하고 H&Y 질환 중증도가 낮다는 것을 나타냅니다. 그러나 보수적인 1000-랜덤화 부트스트랩 테스트를 통해 연관성을 테스트한 결과, H&Y 질환 중증도와 냄새 ID와 EBG 성분 간의 연관성만 약간 살아남아 이러한 결과를 신중하게 해석하고 더 큰 표본에서 재현해야 함을 시사했습니다. 그러나 통계적 순열 테스트는 여러 통계적 테스트를 통제하는 보수적인 테스트라는 점에 주목할 필요가 있습니다.

이번 연구는 시신경 기능의 척도인 EBG를 사용하여 PD 진단에 도움을 주려는 시도입니다. 그러나 후각 관련 뇌파 측정이 사용된 것은 이번이 처음은 아닙니다10,11,27. 그러나 다른 후각 관련 뇌파 측정법과는 달리, EBG 측정법은 PD의 첫 번째 손상 부위 중 하나인 후각을 직접 대상으로 합니다. 따라서 EBG 측정은 위험군에서 파킨슨병의 초기 발병을 예측할 수 있는 유망한 후보입니다. 중요한 점은 인지 능력과 무관하기 때문에 치매 및 기타 인지 장애로 인해 편향되고 영향을 받을 수 있는 행동 냄새 ID 테스트보다 더 적합한 척도가 될 수 있다는 것입니다28,29. 뇌파를 사용하여 신뢰할 수 있는 PD의 바이오마커를 찾는 것이 과거 많은 연구의 목표였습니다. 그러나 대규모 메타 분석에서는 전기생리학적 검사를 PD 바이오마커로 사용하는 것을 뒷받침할 증거가 없다는 결론을 내렸습니다30. 즉, 메타분석에 포함된 모든 연구는 대뇌피질의 특정 영역을 대상으로 하기에는 너무 일반적인 측정치인 ERP 또는 전체 전력 변화를 평가했습니다. 반면, PD 환자의 진동 반응을 평가한 최근 연구에서는 감마 파워를 평가하여 PD를 대조군으로부터 분리할 수 있다는 보다 희망적인 결과가 보고되었습니다31. 그러나 결과는 그룹 수준에서만 보고되었으며 민감도 및 특이도 분석이 부족합니다. 마찬가지로 PCA 기반 분류를 사용하고 느린 진동에만 초점을 맞춘 연구에서는 샘플 내 및 샘플 외 정확도가 85%32로 나타났습니다. 이에 비해 본 연구에서는 94%의 정확도를 달성했는데, 이는 아마도 초기 파킨슨병 진행의 핵심 영역인 뇌의 전두엽을 특별히 표적으로 삼았기 때문인 것으로 보입니다. 즉, 현재 데이터 세트에서 EBG 모델의 샘플 내 예측은 더 높은 특이도와 비슷한 민감도를 보였음에도 불구하고 명목상으로는 16개 항목의 냄새 ID 모델보다 성능이 떨어졌습니다. EBG 모델과 16개 항목 냄새 ID 모델의 예측 오류와 민감도가 비슷한 이유 중 하나는 일부 PD 환자가 이미 뚜렷한 후각 결손이 발생하여 16개 항목 냄새 ID 모델의 민감도와 예측 오류가 EBG 모델과 비슷해졌기 때문일 수 있습니다. 두 모델에서 확인된 두 개의 오탐은 서로 다른 개체라는 점을 강조할 필요가 있습니다. 16개 항목 냄새 ID 모델에서 위음성 환자 두 명은 모두 후각이 저하되지 않은 환자인 반면, EBG 모델에서는 PD 그룹에 올바르게 배정되었습니다. 따라서 두 모델의 이러한 성능 차이는 EBG 모델이 단순히 후각 기능 장애를 반영하는 것이 아니라 PD의 특정 효과와 관련이 있음을 나타냅니다. 냄새 ID만 사용하는 대신 전체 후각 성능 테스트를 사용하면 후각 기반 방법은 개선될 수 있지만 이러한 개선이 후각 기능 장애에 대한 의존성을 완화하지는 못할 수 있는 반면, EBG는 단순한 후각 기능 장애를 넘어 PD 관련 측면에 의존하는 것으로 보입니다. EBG 모델에서 두 개의 위음성은 PD 또는 인구통계학적 매개변수에서 명백한 공통점이 없어 EBG 모델에서 오분류로 이어진 것으로 보입니다. 즉, EBG 모델의 특이도 증가는 표본 규모가 더 큰 데이터, 특히 위험군에서 재현되어야 합니다. 그러나 이 첫 번째 연구의 일반적인 목표는 EBG 측정을 통해 PD 환자를 건강한 대조군으로부터 분리하는 것이 가능한지 확인하는 것이었습니다. 이 개념 증명 연구에 포함된 PD 환자들이 이미 PD 진단을 받았으며 진단 전 후각 결손이 흔하고 조기에 발생한다는 점을 고려할 때, 진단 전 PD 환자 또는 명확한 후각 기능 장애가 없는 위험군 집단에서 EBG 모델의 민감도가 16개 항목 냄새 모델보다 우수할 가능성이 높습니다.

이러한 데이터는 조기 PD 선별을 위한 잠재적 임상 도구로서 EBG의 사용을 뒷받침하지만, 실행 가능한 방법을 입증하지는 못한다는 점을 강조해야 합니다. 위험군 및 PD 하위 진단에 대한 추가 연구가 필요합니다. 하지만, 개발된 EBG 기반 PD 선별 검사의 임상적 유용성은 개인의 운동, 인지, 언어 능력에 대한 의존도를 최소화하면서 완전 자동 방식으로 EBG 평가를 수행할 수 있다는 점, 즉 이 검사가 비침습적이고 쉽게 접근할 수 있는 임상 검사로서 PD 발병 확률을 추정할 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 점을 고려하면 상당히 높다고 할 수 있습니다. 그러나 현재의 방법에는 한계가 있습니다. 현재의 전극 설정과 체적 전도로는 왼쪽과 오른쪽 OB를 분리할 수 없습니다. 잠재적인 초기 PD 환자의 반구적 차이를 측정하면 초기 질병 단계의 명확한 측면성에서 진단적 가치를 더할 수 있습니다. 그러나 이 방법이 더 발전하면 향후 이를 가능하게 할 수도 있습니다33. 또한, 말기 PD 환자는 후각 기능이 저하되어 있을 수 있습니다34. 그러나 스니핑에 의존하는 주파수로 알려진 초기 세타 대역에서는 관련성 있는 시간대에서 차이를 발견하지 못했습니다. 또한, 스니핑에 의해 트리거되는 이벤트 관련 신호를 제거함으로써 이러한 잠재적 차이를 제한했습니다. 또한 스니핑 트리거 프레젠테이션을 사용하지만 모든 참가자에게 동일한 속도로 비강의 높은 지점까지 냄새가 전달되므로 참가자 간 스니핑 크기의 잠재적 차이가 줄어들어34 냄새 지각이 스니핑 크기와 크게 독립적으로 이루어집니다. 이 연구의 또 다른 한계는 포함된 여성의 수가 적다는 점입니다. 이와 관련하여 포함된 여성의 수가 적어 결과에 대한 잠재적인 성별 의존 효과를 평가할 수 없었지만, 최근 메타 분석에 따르면 인간의 후각에서 성별 의존 효과는 작거나 존재하지 않는 것으로 나타났습니다35. 그럼에도 불구하고, PD 진단 도구로 EBG를 도입하기 전에 더 많은 표본에서 개인의 성별에 따른 잠재적 영향이나 혼동, 그리고 PD의 하위 유형을 감지하는 능력을 평가해야 합니다.

결론적으로,

저희는 비침습적인 OB 기능 측정 방법인 EBG를 사용하여

연령이 일치하는 대조군으로부터 PD를 분리해냈습니다.

EBG 측정의 스펙트로그램을 사용하여 PD와 대조군의 냄새 처리의 차이를 평가했습니다. 특히, 대조군과 비교하여 PD의 동기화 패턴이 다른 것을 발견하고 초기 및 후기 시점의 감마, 베타, 세타 대역을 포함한 6가지 특정 EBG 구성 요소를 확인했습니다. 이러한 EBG 구성 요소를 사용하여 비슷한 수준의 감도와 샘플 내 오류 예측을 유지하면서 임상 냄새 ID 테스트보다 약간 더 나은 성능을 보였습니다. 마지막으로, 이러한 EBG 구성 요소는 특히 질병 특성과 관련이 있으며 후기 구성 요소는 후각 테스트와 관련이 있습니다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 이 방법을 더욱 발전시켜 PD의 조기 진단을 용이하게 하고 강력하고 객관적인 바이오마커를 제공할 수 있다고 주장합니다.

Methods

Participants

A total of 40 individuals were initially enrolled in the study. However, two individuals from the healthy control group were excluded, either due to poor EEG signal quality or identified functional anosmia. Consequently, the final sample in the study included 20 PD patients (age = 46–75, 4 women), who were clinically diagnosed with PD by a neurologist within the Karolinska University Hospital and based on the United Kingdom Parkinson’s Disease Society Brain Bank Diagnostic Criteria with Hoehn and Yahr (H&Y) severity 1–336, and 18 healthy age-matched controls (age = 41–74, 4 women). PD patients were invited to the experiment by their attending physician at the end of a regular clinical visit. Also, the patients included in this study are a subsample of an ongoing longitudinal study37. Being the very first study on this topic and a proof-of-concept study, we included a broad set of PD patients with the only inclusion criteria that they should be in the early stages of the disease and with the exclusion criteria that they should not have been diagnosed as being anosmic prior to participation. See Table 1 for a summary of the group demographic, PD patient disease, and medication characteristics. Notably, the MDS-UPDRS and MoCA tests were collected from the patients within ±1 year from the olfactory and EEG/EBG test. All participants had no history of head trauma, were not habitual smokers, and had the intact cognitive capability. Informed signed consent was obtained from all participants and the study was approved by the Swedish Ethical Review Authority.

Table 1 Summary of Parkinson Disease (PD) patient and healthy control group demographics and clinical characteristics.

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Behavioral olfactory testing

Olfactory functions were determined by the clinical Sniffin’ Sticks cued odor identification test23 which consists of a total of 16 odors where the participant has to identify each odor given four alternatives to choose from. Normative values acquired in healthy older adults (age > 51) indicate that the normative mean score of the 16-item odor identification test is 12.62 ± 4.4538. Moreover, a correct ID value of 11, the 10th percentile of a score of 16–60 years old subjects, is often used as the threshold for labeling an individual as hyposmics38, therefore all the included healthy participants were classified as normosmic (mean, 13.78, SD ± 1.26) and scored above the threshold (i.e. 11) in the odor identification test. Of note, one individual in the Controls had the exact score of 11 who later occurred as false positive in the odor ID model. On the other hand, PD patients had an average correct score of 7.3 (SD ± 3.36) and were classified as either normosmic (n = 3, of whom 2 occurred as false negative in odor ID model) or hyposmic/anosmic (n = 17), according to the normative values.

Odors and odor delivery method

To increase the ecological validity and the generalizability of the results three different odors were selected; grapefruit oil (Sigma Aldrich, CAS 8016-20-4), 5-nonanone (Sigma Aldrich, CAS 623-93-8), and mushroom alcohol or 1-octen-3-ol (Sigma Aldrich, CAS 3391-86-4). Odors were diluted to 11%, 4.5%, and 1.1% volume/volume concentrations, respectively, in neat diethyl phthalate (99.5% pure, Sigma Aldrich, CAS 84-66-2). The concentrations were selected based on a pilot study to evoke iso-intense olfactory perception with limited to no perceivable trigeminal perception. We picked these odors considering three parameters: (1) having low trigeminal component at the concentrations used in the study, (2) including both food and non-food odors, and (3) covering different chemical structures (we maximized the diversity of chemical structure by choosing two odor mixtures (grapefruit and mushroom) and a monomolecular symmetrical ketone [5-nonanone, a floral-like scent that was labeled and introduced to participants as “Flower”]).

All odors were delivered for a length of 1 s (condition: Odor) using a computer-controlled olfactometer with a rising time of no more than 200 ms39 and a total birhinal flow rate of 3 L/min. To control for the potential confounding effect on the results of laterality in PD patients, odors were delivered alternatively monorhinaly (left/right nostril) or birhinally in both PD and healthy controls. Therefore, for 2/3 of the odor trials, the odor was delivered to either left (1/3 of trials) or right nostril (1/3) with clean air with the same flow to the contralateral nostril. For the remaining 1/3 of odor trials, the odor was delivered to both nostrils in a birhinal fashion. Whether the odor was delivered to left/right or both nostrils were pseudorandomly assigned to the odor trials, controlling for a balanced division. A total of 72 odor trials per individual were tested and subsequently the power spectrums of all trials were averaged. Interspersed with the odor trials were 24 trials consisting of 1 s of 3 L/min clean air to assess neural processing during no odor nasal sniffing (condition: Sniff) as well as to assess potential tactile sensations caused by possible air fluctuation at the onset of a trial originating from valve switching. Moreover, to avoid tactile stimulation at the onset of a stimulus, a constant clean airflow of 0.3 L/min was maintained during the whole experiment, and stimuli were added to that ongoing flow. Hence, the total airflow per nostril was held constant at 1.65 L/min, a flow below the threshold known to cause nasal irritation39. We further prevented the potential effect of onset-expectation by using a sniff-triggered design in which all trials were initiated in phase with inhalation and unbeknown to the participant. Given that 50% of all mitral and tufted cells in the OB are locked to respiration21, synchronizing the onset of trials to the onset of the inhalation increase the signal-to-noise ratio (SNR). We achieved sniff triggering by monitoring the self-phased sniff pattern using a temperature pod attached next to the right nostril with an individualized threshold to trigger the olfactometer just before the nadir of the respiratory cycle and consequently match stimuli onset (factoring in the known rise-time) with nasal inspiration. The temperature change was sampled at the rate of 400 Hz (Powerlab 16/35, ADInstruments, Colorado) and processed in LabChart Pro version v7.3.8.

All timing and stimulus triggering were implemented within E-prime 2 (Psychology Software Tools, Pennsylvania). Recordings were conducted in a sound-attenuated booth with high flow-through ventilation. Participants wore headphones playing white noise throughout the experiment to mask potential auditory onset cues due to shifting airflow from the olfactometer. The volume of the noise was individually adjusted to a comfortable level. A jittered pre-stimulus interval (600–2000 ms) was implemented before the onset of each trial to further minimize the predictability of odor onset by participants. Moreover, to limit odor habituation effects, a long average inter-trial interval (14,000 ms) was used.

Electrobulbogram measures

Four-channel EBG data were collected and digitalized at the rate of 512 Hz using active electrode EEG (ActiveTwo, BioSemi, Amsterdam, The Netherland). The EBG electrodes were placed according to Iravani and colleagues15 on the forehead, Fig. 1a. Prior to recording, offsets of electrodes were manually inspected within the ActiView software (BioSemi, Amsterdam, The Netherland) and those above 40 mV were adjusted until the offset reached below the threshold. The total testing session, including behavioral odor testing, required 75–85 min to complete.

EBG recordings were epoched from 2000 ms pre-stimulus to 2000 ms post-stimulus and re-referenced to the average of left and right mastoid electrodes. The signal was then notched filtered at 50 Hz to remove the power line noise and adjusted for the olfactometer trigger delay (150 ms), i.e., the time it takes from the electric triggering of the olfactometer until the odor reaches the nasal cavity. Furthermore, to remove non-signal related artifacts, trials with muscle and blink artifacts were identified by an automatic algorithm and removed from subsequent analysis. The automatic artifact identification algorithm included: filtering, Hilbert transform, z-scoring the envelope signal, and thresholding with a cutoff z-value of 8 for muscle and 4 for blink artifacts (for more details, please see15). For Controls, 72.45 ± 11.07% of Odor and 74.54 ± 12.28% of Sniff trials were identified as artifact-less and included in the analysis. Conversely, for PD, 69.24 ± 15.28% of Odor trials and 70.00 ± 15.45% Sniff trials were included in the analysis. However, given that the main concern for EBG signals is eye blink artifacts due to the close proximity of the EBG electrodes to the eyes, an additional ocular correction was performed on the remaining trials using the bilateral vertical EOG channels according to Croft and Barry40.

To determine odor-dependent OB responses and assess the difference between two cohorts, the pre-processed and corrected EBG signals were decomposed into time-frequency maps using multi-tapering sliding window across frequency (range: 0.5–100 Hz with step 0.5 Hz) and time (range: −2 to 2 s with step 0.01 s). Hence, the power at each time-frequency bin was estimated using 2 tapers from discrete prolate spheroidal sequences (DPSS). The length of the tapers was selected as a function of frequency such that it captures at least two cycles of each frequency bin. The frequency smoothing parameter was set to 80% of the frequency of each bin. To remove potential motor responses originating from sniffing, the baseline-corrected Odor trials were contrasted against the baseline-corrected Sniff trials for non-phase locked and phased locked responses and converted to decibels (dB). Finally, the EBG recorded responses were derived by removing the phase-locked from non-phase-locked maps and averaged over the four EBG electrodes. All the preprocessing steps and the time-frequency decompositions were carried out in the open-source toolbox Fieldtrip 2018 within MATLAB R2019b41.

Statistical analysis

Initially, we eval‎uated the time-frequency map between PD patients and age-matched healthy controls using a nonparametric Monte Carlo permutation test. This allowed us to control for multiple testing and, because non-parametric statistics are not making assumptions about the distribution, the results from the EBG measure enabled a greater degree of generalizability. A total of 1000 permutation tests were used to determine significant clusters that were different (p < 0.05 and a cluster size larger than 100 bins) between PD and Control within time-frequency maps. The identified clusters were named according to their latency (e.g., Component 1, Component 2, etc. Fig. 1g). To further validate these components, we separately assessed the agreement between PD and Control individuals using intra-class correlation (ICC). The use of a non-parametric permutation test, together with assessments of the ICC, makes us believe that there is a high probability of replicating these components in an independent sample. Next, to determine if these components were associated with whether an individual belongs to the pre-defined PD or the control group, we used z-scored power values from the components as independent variables in a mixed effect logistic regression model with by-participant random intercept. Furthermore, to determine whether the EBG measure was more specific for PD than a standardized clinical odor ID test, we also dissociated PD from healthy Control using only odor ID performance as an independent variable in a similar logistic model, Fig. 2. Subsequently, the individuals who occurred as the false negatives in the EBG and odor ID model were identified, and their demographic and disease parameters were compared to pinpoint their differences, Fig. 3. We further assessed the associations between PD disease parameters and EBG response using a mixed effect linear model by examining if individual EBG components as independent variables (with by-participant random intercept) predict PD disease parameters where EBG components were found to associate with L-dopa equivalent daily dose (LEDD), H&Y disease severity, or clinical 16-item odor identification score. Finally, we performed a bootstrap test, a more conservative statistical test, thereby a 1000–resampling permutation test was carried out and in each iteration, 80% of PDs and healthy controls were randomly selected to assess the association between PD parameters, odor identification score, and EBG components, Fig. 4. All the t-tests were two-tailed tests where applicable.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.

Data availability

Data is freely and publicly available at: https://osf.io/v2837/?view_only = c0a8014b29b94a22a27a7ac44fb41dba. A reporting summary for this article is available as a Supplementary Information file.

Code availability

Code to reproduce data visualized in Figs. 1d, 1c, 2d, and 4 are available in the above-mentioned link in the Data Availability section.

References

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