염화리튬은 바로아응애를 효과적으로 죽입니다.

[우성(旴成) 평택]

염화리튬은 전신 작용 방식을 통해 꿀벌 기생충 바로 아 소멸자 를 효과적으로 죽입니다.

초록
꿀벌은 작물과 야생 식물의 수분에 점점 더 중요해지고 있습니다. 관리되는 꿀벌 군집의 약화 및 주기적인 높은 손실에 대한 최근 보고는 양봉가, 농부 및 과학자들을 놀라게 했습니다. 체외기생 진드기 바로아 소멸자 (Varroa destructor) 와 관련 바이러스의 침입이 이러한 건강 문제의 중요한 원인으로 확인되었습니다.

꿀벌 군집의 붕괴를 방지하기 위해 매년 처리가 필요하지만 효과적인 살비제의 수가 적고 지난 25년 동안 새로운 활성 화합물이 등록되지 않았습니다. RNAi 기반 방법은 최근 유망한 새로운 도구로 제안되었습니다. 그러나 공개된 프로토콜에 따라 이러한 방법을 적용하면 놀라운 발견이 이루어졌습니다.

여기에서 우리는 RNA 및 기타 리튬 화합물을 침전시키는 데 사용된 염화리튬이 낮은 밀리몰 농도로 숙주 꿀벌에게 공급될 때 바로 아 응애 를 죽이는 데 매우 효과적이라는 것을 보여줍니다. 우리에 갇힌 벌과 여왕벌과 수천 마리의 벌로 구성된 알을 낳지 않은 인공 떼를 사용한 실험은 효과적이고 적용하기 쉬운 제어 개발을 위한 유망한 기초를 제공하는 일벌의 내약성이 우수한 살충제로서 리튬의 잠재력을 명확하게 보여줍니다.

진드기 치료방법.

소개
꿀벌은 수분매개자로서 농업에서 중심적인 역할을 하며 식량 생산에 대한 꿀벌의 전 세계 경제적 기여는 연간 2,350억~2,850억 달러로 추산됩니다

생태계에 대한 꿀벌의 가치는 꿀벌이 곤충 수분 식물의 90% 이상을 수분시킨다는 사실에 있으며, 일반 식물로서 수분 네트워크를 완충하는 데 중요합니다
그러므로, 꿀벌의 전반적인 약화에 대한 최근의 보고는 관리되는 벌통의 주기적인 높은 손실을 가져왔고 양봉가와 꿀벌 과학자들을 놀라게 했을 뿐만 아니라 대중의 우려를 불러일으켰습니다. 높은 군집 손실은 꿀벌 군집 관리를 악화시킬 뿐만 아니라 수분 서비스 비용을 크게 증가시켜 전 세계 작물 생산에 영향을 미칩니다.

현재 꿀벌 건강 문제의 원인이 완전히 밝혀지지는 않았지만, 용혈흡인 체외기생 진드기인 Varroa 파괴자 는 꿀벌( Apis mellifera ) 군체의 이러한 세계적인 곤경의 결정적인 동인으로 간주됩니다. 그리고 양봉의 오랜 역사 속에서 다른 어떤 기생충이나 병원균도 꿀벌의 건강이나 양봉에 비슷한 영향을 미치지 않았습니다. 원래 는 V. 파괴자는 동부 꿀벌인 Apis cerana 에만 기생했습니다 .

새 호스트에서는 A . mellifera 진드기 개체군은 꿀벌 군집이 번식하는 기간 동안 기하급수적으로 증가합니다. 왜냐하면 암컷 진드기는 봉인된 일벌 세포 또는 수벌 세포 내에서만 번식할 수 있기 때문입니다. 진드기 감염 수준이 높으면 혈림프 손실로 인해 심각한 숙주 손상이 발생하고 특정 꿀벌 바이러스의 전파 및 활성화로 인해 더욱 악화됩니다. 섭식을 통한 바이러스 전파와 군집 내의 꿀벌 간의 접촉 및 Varroa 에 의한 바이러스 전파 사이의 가장 눈에 띄는 차이점 은 응애가 바이러스를 혈림프에 직접 주입하여 숙주 방어 메커니즘을 우회한다는 것입니다.

이동성 양봉 관행과 높은 군체 밀도는 진드기 벡터를 통해 이웃 군체 사이에 꿀벌 바이러스의 수평 전파를 선호함으로써 문제를 더욱 악화시켰습니다. 이 시나리오로 인해 꿀벌 바이러스의 독성이 더 높은 종의 유병률이 증가했으며 그 결과 진드기에 감염된 꿀벌 군집의 손상 임계값이 지난 20년 동안 감소했습니다 .

높은 군집 밀도, 떼 예방 및 주기적인 응애 방제를 특징으로 하는 비열대 지역의 일반적인 양봉 관행 조건 하에서는 보다 균형 잡힌 숙주-기생충 관계를 달성하는 것이 어려운 것 같습니다. 지금까지 A 의 장기 생존이 이루어졌습니다 . 어떠한 통제 조치도 없는 mellifera 군체는 거의 독점적으로 야생 개체군 또는 자연 선택 압력 하에서 지속적으로 유지되는 군체 에서 보고됩니다 .

대부분의 경우 이러한 생존이 숙주에 대한 손상을 제한함으로써 내성으로 인한 것인지 아니면 오히려 기생충의 번식 성공을 감소시킴으로써 저항성 메커니즘으로 인한 것인지조차 명확하지 않습니다. 위생적인 행동 및/또는 낮은 진드기 번식을 위한 선택적 육종의 유망한 접근 방식에도 불구하고 관용 육종 만으로 가까운 미래에 세계적인 바로아 문제를 해결할 수 있을지는 다소 의심스럽습니다 . 따라서 현재 관리되는 거의 모든 벌집에는 연간 처리가 필요하며 이는 향후 수십 년 동안 더욱 필요할 가능성이 매우 높습니다.

세계 양봉업에 대한 이러한 도전을 고려할 때, 현재 등록된 모든 Varroosis 제어용 합성 수의학 제품이 단지 몇 가지 화합물(즉, 유기인산염 쿠마포스, 일부 피레스로이드 및 포름아미딘 아미트라즈)만을 기반으로 한다는 것은 주목할 만한 일입니다. 25년 이상 동안 새로운 활성 화합물이 등록되지 않았습니다. 그 결과, 바로 아 진드기는 이용 가능한 모든 합성 살비제에 대한 내성을 갖게 되었습니다 . 불행하게도 유기산과 에센셜 오일을 대체적으로 사용하면 효능이 다양하고 일관되지 않습니다

Varroa 치료 에 대한 관심이 높아졌음에도 불구하고 유럽과 북미의 거의 모든 국가에서 주기적인 높은 집락 손실이 보고되었습니다 . 이는 Varroosis에 대한 새롭고 보다 효과적인 약제를 개발하기 위해서는 Varroa 치료에 대한 더 많은 연구 활동이 시급히 필요하다는 것을 분명히 보여줍니다.

Garbian et al 은 최근 실제 새로운 접근법을 보고했습니다 . Varroa 침입을 통제하기 위한 RNAi의 사용을 개괄한 32 . 간단히 말해서, 필수 Varroa 유전자 와 일치하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 꿀벌에게 공급하고 섭취된 혈림프를 통해 기생충 진드기에 수평으로 전달했습니다. 이 접근법은 숙주 유기체를 벡터로 사용하여 선택적이고 치명적인 dsRNA를 기생충에 전달합니다. 실제로 저자는 Varroa 에서 dsRNA가 표적 유전자를 녹다운시키고 2개월 이내에 진드기 손실을 최대 60%까지 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 접근법에 흥미를 느낀 우리는 필수 Varroa 특정 유전자 의 새로운 선택을 목표로 하여 더 높은 활성과 더 짧은 치료 기간으로 방법을 개선하기 시작했습니다 . 그러나 초기 파일럿 연구에서는 Varroa 진드기 의 전신 치료에 대한 완전히 새로운 접근 방식으로 이어지는 예상치 못한 결과가 나타났습니다 .

결과 및 토론
파일럿 연구: RNAi에서 염화리튬까지
예비 연구에서 진드기에 감염된 꿀벌을 우리에 가두고 잠재적으로 필수적인 Varroa 유전자의 dsRNA가 포함된 자당 시럽을 먹였습니다(보충 표 S1 ). 일반 자당 시럽(미처리) 및 녹색 형광 단백질 GFP(dsGFP ctrl)에 대한 코딩 서열을 기반으로 하는 dsRNA가 포함된 시럽이 대조군으로 사용되었습니다. GFP는 생물발광 하이드로조아 해파리 Aequorea victoria 에서 발현됩니다 .

꿀벌이나 바로 아 응애 의 게놈에는 상동성 유전자가 존재하지 않기 때문에 GFP 서열을 대조군으로 선택했습니다 . 처리되지 않은 그룹에서는 진드기 사망률이 5% 미만이었습니다. 대조적으로, Varroa 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 함유한 수크로스 용액을 받은 꿀벌의 모든 응애는 3일 이내에 효과적으로 사멸되었습니다. 그러나 꿀벌에게 GFP dsRNA를 공급한 대조 실험에서도 진드기에 대한 동일한 효과가 관찰되었습니다(보충 그림 S1 ). 이러한 결과는 제안된 RNAi 매개 메커니즘을 배제했지만 아직 알려지지 않은 RNA의 효과나 테스트 용액 내 다른 구성 요소의 활성을 시사했습니다.

dsRNA 생산에 고농도의 염화리튬(LiCl)이 사용되어 dsRNA와 함께 꿀벌에게 공급되었으므로 우리는 Varroa 응애에 대한 활성을 테스트하기 위해 자당 용액에 LiCl을 갇힌 꿀벌에게 공급하기로 결정 했습니다 . 놀랍게도, dsRNA 용액의 계산된 농도에 해당하는 25mM 농도의 LiCl은 dsRNA를 함유한 테스트 물질만큼 효과적으로 진드기를 죽였습니다. 더욱이, LiCl이 광범위한 세척(dsGFP ctrl 세척)에 의해 dsRNA에서 대부분 제거된 후, 살충 활성은 지연된 개시 및 감소된 활성에 의해 표시된 바와 같이 실질적으로 감소되었습니다(보충 그림 S1 ). 이러한 데이터로부터 우리는 RNA 녹다운이 아닌 LiCl이 Varroa 진드기 에 대한 관찰된 활성을 매개하며 바로 산제로서 LiCl의 잠재력을 분석하는 것이 가치가 있다고 결론지었습니다.

염화리튬의 유효 농도
파일럿 연구의 주요 관찰을 확증하기 위해 우리는 강력한 통계 분석을 위해 다양한 농도의 LiCl을 사용하여 케이지 실험을 설정했습니다. 파일럿 연구에서 효과적인 것으로 밝혀진 25mM 농도 외에도 효능의 하한 임계값을 결정하기 위해 2mM, 4mM 및 10mM의 농도를 사용했습니다.

결과는 이전 연구의 결과를 뒷받침하고 진드기 사망률이 실질적으로 증가하는 2mM만큼 낮은 LiCl 농도에 대한 상당한 살충 효과를 입증했습니다 ( P  <0.001, 로그 순위 테스트, 보충 표 S2 ). 10mM 및 25mM의 더 높은 농도는 둘 다 처리 2일차부터 진드기 사망률을 크게 향상시켰으며 실험이 끝날 때 처리된 진드기의 96% 이상의 박멸을 달성했습니다(그림 1a , 보충 표 S2 ). 먹이 용액에 LiCl이 없는 대조 실험에서 진드기 사망률은 평균 9.3%에 도달했으며 따라서 다양한 환경 조건에서 처리되지 않은 우리 꿀벌에 보관된 진드기에 대해 얻은 사망률 범위 내에 있었습니다 . 이러한 결과를 바탕으로 우리는 2mM에서 25mM 사이의 농도 범위에서 진드기 생존율에 대한 LiCl의 명확한 효과를 확인했습니다.

우리에 갇힌 벌에게 염화리튬(LiCl)을 먹인 후 영동체 바로아 응애 와 꿀벌 의 사망률 . ( a ) 2 mM ~ 25 mM 농도의 LiCl을 공급한 우리에 갇힌 꿀벌에 보관된 암컷 Varroa 응애의 Kaplan-Meier 생존 곡선(0 mM(대조군), 2 mM의 경우 n = 33, 9, 9, 12 및 9 케이지) , 4 mM, 10 mM 및 25 mM). 모든 농도에서 처리군에서 진드기의 생존율은 대조군과 유의하게 달랐습니다( P  < 0.001, Bonferroni 보정을 사용한 로그 순위 테스트). ( b ) 24시간 LiCl 노출 후 우리에 갇힌 일벌과 암컷 Varroa 응애의 Kaplan-Meier 생존 곡선(n = 9 케이지). 처리군의 응애 생존율은 대조군과 유의미한 차이가 있었지만( P  < 0.001, 로그 순위 테스트), 벌 사망률에는 유의미한 그룹 차이가 없었습니다.

이 실험에서, 모든 응애가 처리에 의해 죽을 때까지 우리에 갇힌 꿀벌에게 며칠에 걸쳐 각각의 농도의 LiCl을 공급했습니다. 그러나 양봉 실무에 잠재적으로 사용하려면 더 짧고 정의된 치료 기간이 바람직합니다. 따라서 우리는 가장 효과적인 농도의 25mM LiCl(그림 1a )을 24시간 동안 투여한 후 추가로 6일 동안 설탕 용액을 공급하는 추가 실험을 수행했습니다.

관찰 기간이 끝날 때, 진드기의 92.9%(n = 225 진드기, P  < 0.001, 로그 순위 테스트)가 처리된 벌에 대한 어떠한 유의미한 영향도 없이 사멸되었습니다(다음 단락 참조). 이 결과는 25mM LiCl의 단기 공급조차도 진드기 개체수를 실질적으로 감소시키는데 충분하다는 것을 분명히 보여줍니다.

기생 진드기를 죽이는 데 필요한 꿀벌의 LiCl 섭취량을 정확하게 결정하기 위해 새로 부화한 꿀벌 12마리에게 4mM ~ 100mM의 LiCl 용액 10μl를 인공적으로 공급하고 5일 동안 영동 진드기와 함께 개별적으로 케이지에 보관했습니다. 각각 1.7 μg 및 4.2 μg의 LiCl 섭취에 해당하는 4 mM 및 10 mM 용액의 경우 효과는 처리되지 않은 대조군과 크게 다르지 않았습니다(n = 12 진드기, P  = 1.000, 로그 순위 테스트, 보충 표 S3 ). 그러나 벌이 소비한 LiCl 10.6μg에 해당하는 25mM의 단일 용량은 48시간 이내에 영동 응애를 100% 죽이는 데 충분했습니다(그림 2 ).

4mM에서 100mM 범위의 농도로 10μl의 염화리튬 용액을 개별적으로 공급한 꿀벌에 서식하는 영동성 바로아 응애 의 사망률 . 실험 시작 시 꿀벌에게 LiCl을 한 번만 먹인 다음 5일에 걸쳐 자당 시럽을 먹였습니다. 각 농도에 대해 벌 1마리와 바로 아 응애 1마리가 있는 12개의 우리를 분석했습니다. 25 mM 이상의 농도를 꿀벌에게 먹인 경우 대조군에 비해 진드기의 생존율이 유의하게 감소했습니다( P  < 0.001, log-rank test).

일벌에 미치는 영향
일벌에 대한 LiCl의 내약성 분석을 위해 응애 사망률 분석에 사용된 시험 케이지(도 1a )에 일벌의 사망률을 추가로 기록하였다. 진드기 살충 활성을 나타내는 것으로 알려진 2mM, 10mM 및 25mM LiCl에 노출된 후 처리된 일벌 사망률은 다양한 먹이 그룹 내에서 평균 3~7% 범위였습니다. 10 mM LiCl 그룹(n = 12 케이지, P  = 0.015, 로그 순위 테스트, 보충 표 S4 ) 을 제외하고 값은 치료되지 않은 대조군의 4% 사망률과 크게 다르지 않았습니다.

더욱이, 우리의 대조군의 사망률은 독성학 시험에서 대조군 으로 요구되는 처리되지 않은 우리 벌의 사망률 범위 내에 있었고 , 따라서 우리의 테스트 시스템의 타당성을 확인했습니다. 또한 LiCl을 사용한 24시간 처리는 일벌의 사망률에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1b , n = 9 케이지, P  = 0.308, 로그 순위 테스트). 꿀벌에 대한 LiCl의 우수한 내약성은 일벌 사망률 의 유의 한 증가를 유도하지 않은 단일 용량 (진드기 사망률 에 대해서는 그림 2 참조)을 공급함으로써 확인되었습니다 ( P  = 1.000, 로그 순위 테스트, 보충 표 S5 ).

다음으로, 장기 노출에 대한 반응을 조사하기 위해 우리에 갇힌 마지막 벌이 죽을 때까지 다양한 농도의 LiCl을 지속적으로 공급했습니다. 여기서 처리는 갓 부화한 일벌의 평균 수명을 처리되지 않은 대조 케이지의 26일에서 2mM 및 10mM LiCl의 경우 각각 23일 및 22일로 크게 줄였습니다(n = 60마리의 꿀벌, P  = 0.024, 로그 순위 테스트). , 보충 표 S6 ). 가장 높은 농도의 25mM LiCl을 투여받은 꿀벌의 경우 수명은 평균 19일로 크게 감소했습니다(그림 3a ).

우리에 갇힌 꿀벌에게 염화리튬을 먹인 후 꿀벌의 사망률. ( a ) 만성 LiCl 노출 동안 갇힌 일벌의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 2mM, 10mM 및 25mM 농도의 LiCl 사료를 마지막 벌이 죽을 때까지 자유롭게 공급했습니다(n = 각각 10마리의 벌이 있는 6개의 케이지). 모든 치료 그룹의 생존율은 설탕 시럽 대조군과 유의하게 달랐습니다( P  <  0.01, Bonferroni 보정을 사용한 로그 순위 테스트). ( b ) 24시간 LiCl 노출 후 우리에 갇힌 일벌의 Kaplan-Meier 생존 곡선. 2mM, 10mM 및 25mM 농도의 LiCl 사료를 부화 후 처음 24시간 동안 임의로 공급한 다음 자당 시럽으로 대체했습니다(n = 각각 10마리의 꿀벌이 있는 12개의 케이지). 모든 처리군의 생존율은 설탕 시럽 대조군과 크게 다르지 않았습니다( P  > 0.1, Bonferroni 보정을 사용한 로그 순위 테스트).

그러나 LiCl은 부화 후 처음 24시간 동안 LiCl을 공급한 후 마지막 우리에 갇힌 벌이 죽을 때까지 자당 시럽으로 대체한 추가 실험에서 알 수 있듯이 장기간에 걸쳐 투여한 경우에만 벌의 생존을 방해하는 것으로 보입니다. .3b ) . 여기서 갓 부화한 일벌의 평균 수명은 처리 간 큰 차이 없이 22일(10mM)에서 24일(대조군) 범위였습니다(처리당 n = 120마리의 꿀벌, P  ≥ 0.126, 로그 순위 테스트; 보충 표 S7 ).

우리에 갇힌 꿀벌의 데이터를 바탕으로 우리는 단기적인 LiCl 처리만으로도 일벌 의 생존 가능성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않고 바로아 응애 침입을 완전히 박멸하는 데 충분하다는 결론을 내렸습니다. 통제된 조건 하의 케이지 테스트에서 얻은 이러한 결과는 Varroa 치료 에 대한 새로운 접근 방식을 향한 성공적이고 유망한 첫 번째 단계를 나타냅니다 . 다만, 효율성과 부작용은 현장 조건에서 확인해야 한다.

인공 떼에서 염화리튬을 사용한 현장 테스트
대략적인 현장 조건을 위해 여왕벌과 각각 약 20,000마리의 벌로 구성된 9개의 새끼가 없는 인공 떼에서 25mM 및 50mM LiCl을 테스트했습니다. 이러한 농도는 짧은 적용 시간(25mM)에서 꿀벌이 여전히 견딜 수 있는 최고 용량을 사용하여 갇힌 꿀벌을 사용한 이전 실험을 기반으로 선택되었습니다. 약 20,000마리의 벌로 이루어진 전체 인공 떼 전체에 자당 시럽을 균일하게 분포시키는 것이 어려웠을 수 있으므로, 각 벌이 충분한 양의 리튬에 노출되었는지 확인하기 위해 50mM 농도의 LiCl을 추가로 테스트했습니다. 따라서, 떼 에 25 mM LiCl(n = 6) 또는 50 mM(n = 3)을 함유한 자당 시럽을 3일 동안 임의로 공급 한 후 Perizin®을 국소 적용했습니다. 유기인산염 쿠마포스를 활성 성분으로 함유한 Perizin®은 대조 치료제로 흔히 사용되는 매우 효과적인 바로산제입니다.

진드기 사망률을 5일 동안 모니터링했습니다. 대조군 처리 전에, 25mM LiCl은 인공 떼 내에 존재하는 진드기의 약 90%를 사멸시켰습니다(표 1 ). 그러나 더 높은 농도의 용액(50mM)은 이 효과를 증가시키지 않았습니다(χ2 테스트, P  = 0.953). 전체적으로, 케이지 테스트에 비해 효능은 다소 낮았습니다. 한 가지 설명은 수천 마리의 벌 무리 내에서 LiCl의 분포가 마지막 개별 벌이 각 기생 진드기를 죽이기에 충분한 양을 소비할 때까지 더 많은 시간이 필요하다는 것입니다. 20,000마리 이상의 벌이 있는 거대한 개체의 필요한 먹이 시간은 추가 실험에서 분석되어야 합니다.

기타 리튬 화합물 및 비리튬염의 효능
Varroa 응애 에 대한 효과의 활성 성분인 리튬을 확인하기 위해 우리는 일련의 리튬 화합물을 테스트하고 비리튬 염과 진드기 살충 효과를 비교했습니다. 특히 흥미로운 것은 3개의 리튬 이온, 황산리튬 및 탄산리튬을 포함하는 화합물인 구연산리튬이었습니다.

LiCl에는 1개의 리튬이온이 있는 데 비해 2개의 리튬이온이 포함되어 있습니다. LiCl과 비교하여 효능과 내약성을 분석하기 위해 하나의 리튬 이온(젖산리튬, 아세트산리튬)을 포함하지만 용해도, 화학 반응성 및 가격이 다른 추가 화합물을 포함했습니다.

케이지 실험에서 모든 화합물은 3일(구연산리튬 및 아세트산리튬)에서 4일(황산리튬, 젖산리튬 및 탄산리튬) 내에 25mM에서 진드기를 100% 제거했습니다. 또한 4mM 시험액은 탄산리튬을 제외하고 5일(구연산리튬, 황산리튬, 아세트산리튬)~7일(유산리튬) 이내에 영동응애를 완전히 사멸시켰다(표 2, 보충 표 S8 ).

일벌 사망률은 25mM 황산리튬 및 25mM 리튬 젖산염을 제외하고는 처리되지 않은 대조군 벌과 비교하여 어느 농도에서도 유의하게 증가하지 않았습니다(보충 표 S9 ). 이러한 실험을 통해 우리는 다른 리튬 화합물이 전신 살비제로 사용할 수 있는 유사한 잠재력을 가지고 있음을 확인할 수 있었습니다. 이는 수의학 제품의 가능한 디자인에 대한 유연성을 증가시킬 수 있습니다. 가격을 고려하면 염화리튬과 구연산리튬이 가장 저렴한 화합물이다. 황산리튬은 벌에 대한 내성이 낮기 때문에 덜 적합하고, 탄산리튬은 상대적으로 낮은 수용해도로 인해 적합하지 않습니다.

리튬 화합물의 농도 의존적 ​​효능을 보다 자세히 알아보기 위해 LiCl과 분자당 리튬 이온 수의 차이가 가장 큰 구연산 리튬(Li 3 C 6 H 5 O 7 )을 5가지 농도에서 비교하였습니다. 1mM~25mM 범위. 구연산리튬의 모든 농도는 LiCl에 비해 상당히 높은 살비 활성을 나타냈으나, 벌의 사망률에는 차이가 없었다(표 3 , 보충 표 S9 및 S11 ). 따라서 구연산리튬은 훨씬 더 나은 활성 성분을 나타낼 수 있습니다.

리튬이 없는 대조군으로서 그리고 활성제인 염화물을 배제하기 위해 우리는 알칼리성 염인 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl), 염화마그네슘(MgCl)도 25mM에서 테스트했습니다. NaCl 또는 KCl에 대한 Varroacidal 효과는 관찰되지 않았습니다 (n = 3 케이지, P = 1.000, 로그 순위 테스트, 보충 표 S12 ). MgCl2를 이용한 실험에서 우리에 갇힌 벌은 100%가 5일 이내에 죽었고(P<0.001, log-rank test), 벌의 수가 감소함에 따라 진드기에 대한 영향을 분석하기 전에 실험을 종료했습니다. 이러한 실험을 바탕으로 우리는 리튬이 실제로 용량 의존 방식으로 살비 활성을 매개하며 구연산리튬이 지금까지 테스트한 모든 화합물 중 가장 유리한 특성을 나타낸다는 결론을 내렸습니다.

새로운 바로산제로서의 리튬 화합물의 잠재력
우리는 필수 Varroa 유전자에 대해 초기에 가정된 이중 가닥 RNA가 아니라 놀랍게도 리튬 염이 우리에 갇힌 꿀벌과 인공 떼의 Varroa 진드기 에 대한 강력한 살비 효과를 중재한다는 것을 보여주었습니다 . 따라서, 이러한 결과는 리튬 화합물이 뛰어난 잠재력과 꿀벌에 의한 매우 우수한 내약성을 지닌 새로운 종류의 살비제를 대표한다는 것을 보여줍니다. LiCl에 대한 진드기와 벌의 서로 다른 민감성은 희석 효과로 인해 벌의 혈림프에 있는 LiCl의 농도가 아마도 벌에게 공급되는 농도보다 상당히 낮을 것이라는 점을 고려하면 훨씬 더 놀랍습니다.

중요한 것은 우리의 연구 결과가 Garbian et al. 에 의해 발표된 RNAi 기반 접근법의 살비 효과를 암시하지 않는다는 것입니다 . 32는 일반적으로 LiCl에 의해 매개됩니다. 60일에 걸쳐 dsRNA 혼합물을 꿀벌에게 공급한 후 Garbian et al . 32는 단지 60%의 최종 치료 효능으로 진드기 사망률의 느린 증가를 기록했습니다. LiCl을 사용한 치료에 대한 인공 떼의 빠르고 효과적인 반응을 고려할 때 다양한 작용 모드가 있을 수 있습니다. RNAi 매개 효과는 장기적인 효과를 발휘하는 것처럼 보이지만 리튬 화합물은 빠른 발병과 높은 효능을 가진 독립적인 메커니즘을 나타냅니다.

바로산제로서 LiCl은 다음 조합에서 독특한 몇 가지 특징을 나타냅니다. (i) LiCl은 꿀벌 먹이를 통해 전신적으로 작용합니다("적용이 용이함"). (ii) 수용성이므로 밀랍에 축적되지 않습니다. 친유성 특성을 지닌 합성 바로산제를 사용하는 장기 치료 개념에서 중요한 문제입니다 36 , 37 (iii) 대부분의 리튬 화합물의 포유동물에 대한 경구 독성은 상대적으로 낮습니다 38 (iv) 관련 식품 내 공급 용액에 기피 효과가 없습니다 2-25mM 39 의 농도 범위 및 (v) 적당한 가격으로 이용 가능합니다. 매우 유망한 점은 개별 벌당 25mM 용액(10.6μg의 LiCl 용량에 해당)에 단 10μl의 LiCl을 한 번 적용하면 영동 진드기를 죽이기에 충분하다는 사실입니다. 추가 연구의 과제는 모든 꿀벌이 임계량의 활성 화합물을 받을 수 있도록 실제 크기의 벌떼와 군집을 위한 스마트 응용 기술을 개발하는 것입니다.

현재 우리는 LiCl이 어떻게 영동성 Varroa 진드기를 죽이는지 알지 못하며 LiCl이 곤충에 미치는 영향에 대한 출판물도 거의 없습니다 40 . 인간 의학에서 리튬은 1870년대부터 사용되어 왔으며 조울증 치료 및 양극성 장애 유지 치료에 사용되는 기분 안정제입니다 41 . 치료 용도를 고려하여 리튬 화합물과 독성 프로필이 주의 깊게 조사되었습니다. 지금까지 대사, 발달, 조혈 및 기타 과정에 작용하는 수많은 효소가 잠재적인 표적으로 제안되었습니다 42 , 43 . 이들 효소는 금속 이온을 필요로 하며 리튬은 비경쟁적인 방식으로 활성을 발휘하는데, 이는 2가 양이온을 치환함으로써 발생할 가능성이 가장 높습니다. 물론, 우리는 현재 리튬 화합물의 관찰된 진드기 살충 효과가 유사한 작용 방식에 의존한다는 징후를 가지고 있지 않습니다.

우리는 또한 우리의 결과가 새로운 수의학 제품 개발을 향한 첫 번째 단계일 뿐이라는 사실도 알고 있습니다. 자유롭게 날아다니는 벌집에서의 현장 테스트는 성체 벌과 꿀벌 무리에 대한 치명적이지 않은 장기적인 부작용과 꿀에서 발생할 수 있는 잔류 문제에 대한 분석만큼 필요합니다.

그러나 여기에 제시된 결과는 LiCl이 인공 및 자연 벌떼, 특히 미국에서 수분을 위해 사용되는 엄청난 수의 벌벌에 대해 효과적이고 적용하기 쉬운 치료법으로서의 잠재력을 가지고 있음을 이미 나타냅니다 11 , 44 . 더욱이, 작용 메커니즘의 해명은 바로아 응애 퇴치 를 위한 수의학 제품의 목표 개발을 위한 새로운 길을 열 수 있습니다 .

행동 양식
케이지 테스트의 일반 구성
처리된 꿀벌의 섭식인 바로아 응애 에 대한 염화리튬, 기타 리튬염 및 대조 염의 효과를 600ml 플라스틱 용기(Lock and Lock®)로 구성된 케이지 테스트 45 에서 평가했습니다 . 용기 중앙에 왁스 파운데이션(9cm × 3.5cm)을 부착하고 바닥에 10ml 공급 주사기(Injekt®, Roth)용 구멍을 뚫었습니다(보조 그림 S2 ). 케이지를 뒤집어 플라스틱 뚜껑 대신 스타킹으로 닫았습니다.

장수 및 단회 투여 수유 실험은 스타킹과 10ml 급식 주사기(Injekt®, Roth)가 장착된 40ml 용기(Rotilabo®, Roth)에서 수행되었습니다. 꿀벌은 바로 아 감염 수준이 낮은 군집에서 유래되었으며 L5(다섯 번째 유충 인스타르) 꿀벌 유충이 포함된 벌집에서 수집되었습니다. 일벌의 전체 수명 및 단회 투여 실험에는 인큐베이터에 보관된 벌집에서 갓 부화한 벌을 사용하였다.

암컷 바로 아 응애 는 착빙 설탕 방법 46을 사용하여 심하게 감염된 군체로부터 수집하고 , 미지근한 물로 세척하고 건조시킨 후 우리에 갇힌 꿀벌에게 옮겼습니다. 모든 케이지에 진드기와 꿀벌이 장착되자마자, 먹이 주사기에 테스트 또는 대조 먹이 용액(Apiinvert®, Südzucker; 건조 물질 함량: 30% 자당, 31% 포도당, 39% 과당)을 채우고 우리에 넣습니다. 어두운 인큐베이터(Memmert, 27°C, 60% RH)에 보관했습니다. 매일 죽은 개체의 수를 세고 제거한 다음, 먹이 용액을 교체했습니다.

파일럿 연구: RNAi에서 염화리튬까지
첫 번째 단계에서 우리는 생물정보학을 사용하여 필수 Varroa 유전자를 식별했습니다. 발표된 Varroa 소멸자 contig 에서 파생된 서열은 Drosophila melanogaster 및 Caenorhabditis elegans 의 주석이 달린 게놈에 대해 폭발되었습니다 . 후속 단계에서 이들 유기체에 필수적인 것으로 밝혀진 서열이 선택되었습니다. 이러한 필수 서열과의 상동성을 기반으로 Varroa 게놈에서 영향을 미칠 가능성이 높은 12개 유전자(Rpn1, Rpn3, Noi, GC2807, RPL7, ATP syn-beta, AlphaTub 84B, His2B, Med, RPL15, Blw 및 So)를 선택했습니다. RNAi 매개 녹다운 후 진드기 생존 가능성 (보충 표 S1 ).

RNA를 얻기 위해 Varroa 진드기를 액체 질소에서 동결시키고 막자사발과 막자를 사용하여 균질화했습니다. 제조사의 지침에 따라 Tri-Reagenz(Sigma Aldrich)를 사용하여 RNA를 분리했습니다. 20μl 반응량의 cDNA 합성(BioRad iScript Kit)에는 약 1μg의 RNA가 사용되었고, PCR 반응에는 0.5μl의 cDNA가 사용되었습니다. 각 PCR 은 T7 RNA 폴리머라제 의존성 RNA 전사를 허용하기 위해 5' 말단에 추가적인 T7 폴리머라제 프라이머 서열을 갖는 Varroa 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 수행되었습니다 .

각 유전자에 대해 두 개의 PCR이 수행되었습니다. 하나는 센스 가닥에 대한 T7 프라이머 사이트이고 다른 하나는 안티센스 가닥에 대한 T7 프라이머 사이트입니다. 이 단계는 각 유전자의 가닥 특이적 시험관 내 전사를 가능하게 하기 위해 수행되었습니다 . 시험관 내 전사 후 , 2.5M 최종 농도의 LiCl을 사용하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 완전히 제거하고 RNA를 RNAse가 없는 물에 녹였습니다. 센스 및 안티센스 RNA 전사체를 등몰 농도로 함께 혼합하고 95°C에서 5분 동안 가열한 후 약 50°C까지 천천히 냉각하여 어닐링했습니다. 그러면 어닐링된 RNA(dsRNA)가 케이지 테스트에 사용할 준비가 되었습니다.

케이지 당 100마리의 꿀벌에게 30마리의 바로아 응애를 감염시키고 유전자당, 꿀벌당, 일당 0.8μg의 dsRNA가 함유된 설탕 시럽을 먹였습니다. 따라서 매일 총 960μg의 dsRNA를 공급했습니다. 설탕 시럽 외에도 녹색 형광 단백질 GFP(dsGFP ctrl)의 코딩 서열을 기반으로 하는 유사한 양의 dsRNA가 대조군 역할을 했습니다(각각 n = 3 케이지). 연속적인 실험에서는 세척된 dsGFP(n = 1 케이지)와 25 mM 농도의 LiCl(n = 2 케이지)을 함유한 설탕 시럽을 꿀벌에게 공급했습니다. 꿀벌은 4일의 전체 관찰 기간 동안 각각의 먹이를 받았습니다.

염화리튬의 유효 농도
염화리튬(로스 ≥ 99%)의 살비 효과는 감염된 꿀벌(n = 6, 9, 9, 12, 각각 1mM, 2mM, 4mM, 10mM 및 25mM용 케이지 9개). 케이지당 꿀벌 50마리(±2)와 바로 아 응애 25 마리(±2)를 사용했습니다. 모든 진드기가 죽자마자 시험 용액을 설탕 시럽으로 대체했습니다. 7일 후, 남아있는 벌과 진드기를 동결시켜서 계수하였다. 7일의 실험 기간이 여기에 사용되었습니다. 왜냐하면 10mM과 25mM의 가장 효과적인 두 가지 농도로 이미 모든 진드기가 이 기간 내에 죽었고 우리는 진드기 사망률에 대한 만성 적용의 효과를 테스트할 의도가 없었기 때문입니다. 일벌의 장기 생존 테스트를 위해 더 긴 기간이 사용되었습니다(아래 참조). LiCl과 3개의 리튬 이온이 있는 화합물을 비교하기 위해 구연산 리튬(Roth ≥ 98% Ph. Eur)을 동일한 농도 범위(n = 3, 6, 6, 6 및 1mM, 2에 대해 3개 케이지)에서 테스트했습니다. 각각 4mM, 10mM, 25mM).

우리는 24시간 동안만 25 mM 염화리튬을 공급하여 단기 치료 효과를 추가로 테스트했습니다(n = 9 케이지). 그 후 염화리튬 공급 용액을 6일 동안 Apiinvert®로 교체했습니다.

기생충인 바로 아 응애 를 효과적으로 죽이는 임계 용량을 정의하기 위해 새로 부화한 꿀벌에게 3시간 동안 굶은 후 설탕 시럽 10μl 또는 4 mM ~ 100 mM 범위의 염화리튬/자당 용액 10 μl를 개별적으로 공급했습니다. . 농도별로 12마리의 꿀벌을 먹이고 개별적으로 사육하였다. 각 꿀벌은 손으로 먹이를 준 직후에 한 마리의 바로 아 진드기에 감염되었고 다음 관찰 기간인 5일 동안 설탕 시럽 사료를 받았습니다.

일벌에 미치는 영향
염화리튬을 먹인 꿀벌의 수명은 설탕 시럽 또는 2mM, 10mM 및 25mM 농도의 염화리튬 용액을 포함하는 별도의 케이지 테스트에서 테스트되었습니다(각각 n = 6개의 케이지). 각 우리에는 갓 부화한 꿀벌 10마리가 들어 있었고, 모든 꿀벌이 죽을 때까지 각각의 용액을 지속적으로 먹였습니다.

인공 떼에서 염화리튬을 사용한 현장 테스트
자연 조건과 유사하게 하기 위해, 우리는 새끼가 없는 인공 떼 47 에서 염화리튬의 살비 활성을 테스트했습니다 . 따라서 각각 약 2kg의 꿀벌과 우리에 갇힌 여왕벌이 포함된 9개의 인공 떼를 밀폐된 상자에 넣고 어둠 속에서 15°C로 유지했습니다. 인공 떼가 확립된 후, 3일 동안 용기를 통해 25mM(n=6) 또는 50mM(n=3) 염화리튬이 포함된 자당 시럽을 공급했습니다. 처리 후, 모든 떼를 상자에서 양봉장의 벌집으로 옮겨서 먹이를 먹도록 했습니다. 음식은 자유롭게 제공되었고 진드기 사망률은 매일 모니터링되었습니다. 나머지 진드기는 떼당 50ml의 Perizin®을 사용하여 살수 및 2일에 걸쳐 진드기 수를 세어 제거했습니다.

기타 리튬 화합물 및 비리튬염의 효능
우리는 구연산리튬(Roth ≥ 98% Ph. Eur), 황산리튬(Roth ≥ 99%), 탄산리튬(Roth ≥ 99%), 아세트산리튬(Roth ≥ 99%) 및 젖산리튬(Sigma Aldrich 95%)을 추가로 테스트했습니다. 4 및 25mM 농도(n = 각각 3개의 케이지). 대조 테스트에서는 우리에 갇힌 꿀벌에게 Apiinvert®만 먹였습니다(n = 33개 우리). 추가 대조군으로 염화마그네슘(Roth ≥ 98.5%)과 알칼리염인 염화칼륨(Roth ≥ 99%) 및 염화나트륨(Roth ≥ 99%)을 동일한 방식으로 25mM(n = 각각 케이지 3개). LiCl과의 자세한 비교를 위해 구연산리튬을 추가 농도에서 테스트했습니다. 모든 케이지 테스트는 "염화리튬의 유효 농도"에 설명된 것과 동일한 방식으로 수행되었습니다.

통계
케이지 테스트에서 얻은 데이터 세트는 SPSS 22 통계 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. Kaplan-Meier 생존 추정을 수행하여 Varroa 진드기와 꿀벌 의 연속 사망 시간으로부터 생존 분포를 추정했습니다 . 치료 간의 생존율을 쌍으로 비교하고 로그 순위 테스트와 Bonferroni 보정을 통해 중요성을 테스트했습니다. 카이제곱 테스트를 사용하여 두 가지 서로 다른 염화리튬 농도로 처리한 인공 떼의 진드기 낙하 데이터를 비교했습니다. P < 0.05 인 그룹 간의 차이는  통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

https://www.nature.com/articles/s41598-017-19137-5#Tab2

[김국원/포항]

이 중요한 자료를 이제야 봤네요.
설탕물과 염화리튬이나 구연산리튬을 20,000마리 기준으로 각각 10아이크로그람을 급이 하라는 뜻으로 이해했습니다.
혹시 제가 잘못 이해했으면 댓글주시면 감사하겠습니다.
온도는 15도 기준 이군요.
좋은 자료 올려 주심에 항상 감사드립니다.