IL-27의 그람 음성 박테리아 산물 및 살모넬라 티피무리움 감염

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IL-27은 그람 음성 박테리아 산물 및 살모넬라 티피무리움 감염에 대한 사이토카인 반응을 증폭합니다.

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• 출판일: 2018년 9월 12일 (수)

IL-27은 그람 음성 박테리아 산물 및 살모넬라 티피무리움 감염에 대한 사이토카인 반응을 증폭합니다.

• C. 피츠, 
• N. 오도아르디, 
• S. M. 플래터, 
• N. L. 마틴 & 
• 케이지(K. Gee) 

과학 보고서 volume 8, 문서 번호: 13704 (2018) 이 기사 인용

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추상적인

박테리아에 노출된 단핵구와 대식세포의 사이토카인 반응은 선천성 면역에 특히 중요합니다. 면역조절 사이토카인 인터루킨(IL)-27이 선천성 면역 체계 반응 조절에 미치는 영향에 초점을 맞추고, 박테리아 산물에 대한 인간의 면역 반응과 대장균 및 S. 티피무리움에 의한 박테리아 감염을 조사했습니다. 박테리아에 감염된 인간 골수성 세포에 대한 IL-27 치료의 효과에 대한 연구가 부족하기 때문에 염증 신호 전달 및 사이토카인 반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 IL-27과 LPS, 편모 또는 박테리아로 인간 단핵구와 대식세포를 처리했습니다. 대장균 또는 S. 티피무리움에서 유래한 IL-27과 LPS를 동시에 자극했을 때 LPS 단독에 비해 IL-12p40, TNF-α, IL-6 발현이 향상된 것을 확인했습니다. IL-27이 박테리아 감염에 대한 세포 반응을 조작하는지 밝히기 위해 IL-27 처리된 인간 대식세포를 S. 티피무리움으로 감염시켰습니다. IL-27은 S. 티피무리움 감염 또는 S. 티피무리움 유도 세포 사멸에 대한 감수성에 영향을 미치지 않았지만, IL-27은 감염된 세포에서 전염증성 사이토카인 생성을 크게 향상시켰습니다. 종합하면, 우리는 박테리아 감염에 대한 선천성 면역 반응을 조절하는 IL-27의 역할을 강조합니다.

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소개

사이토카인 인터루킨(IL)-27, Pflanz et al. 2002년에는 선천성 및 적응성 면역 조절에 근본적인 역할을 하는 이종 이량체 사이토카인의 IL-12 계열에 속합니다1,2년. IL-27p28(p28)과 엡스타인 바 바이러스 유도 유전자 3(EBI3) 서브유닛으로 구성된 IL-27은 골수성 세포의 박테리아 감염에 대한 반응으로 생성되며 전염증 및 항염증 기능을 모두 나타냅니다2,3호. IL-27에 결합된 수용체 복합체는 IL-27Rα(WSX-1)와 당단백질(gp)-130으로 구성되어 있습니다4. 유비쿼터스로 발현되는 gp130 수용체 서브유닛은 IL-6 계열에 속하는 모든 사이토카인에서 공유되어 다양한 면역 및 비면역 세포에서 신호 전달 능력을 발휘합니다5. 이에 비해 WSX-1은 주로 naive T 세포, 단핵구 및 수지상 세포를 포함한 림프구에서 발현됩니다4. 일차 인간 단핵구와 활성화된 대식세포는 WSX-1 및 gp130을 발현하므로 IL-27 자극에 반응하는 능력을 가지고 있습니다4,6년.

적응 면역 반응에서 IL-27은 CD4+ T 세포에 의한 인터페론(IFN)-γ 생산을 위한 I형 보조 T 세포(Th1) 계통으로의 분화를 촉진하는 특성을 잘 규명합니다2,7년; 그러나 최근 보고서에 따르면 IL-27은 단핵구와 대식세포에도 영향을 미친다고 합니다8,9,10,11,12,13. 특히, IL-27은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및 II 발현을 강화하고 단핵구와 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성을 조절합니다4,9,10. 또한, IL-27에 노출된 단핵구는 톨 유사 수용체(TLR)-4 발현을 증가시키고 지질다당류(LPS) 유도 염증성 사이토카인 생성을 강화했습니다11,13년. 이러한 발견은 TLR4와 같은 선천성 면역 센서의 발현을 변화시킴으로써 항균 방어에서 IL-27의 역할을 뒷받침합니다.

TLR은 바이러스 및 박테리아 성분을 감지하고 감염 제거에 필요한 면역 반응을 시작하는 패턴 인식 수용체입니다14,15,16년. LPS 및 편모와 같은 병원체 관련 분자 패턴은 각각 TLR4 및 TLR5에 의해 인식됩니다17,18년; TLR 매개 신호 반응은 대장균 및 살모넬라 티피무리움과 같은 그람 음성 박테리아 감염에 대한 보호에 필수적입니다14,15,16년. 대식세포의 직접적인 LPS 자극은 S. typhimurium 감염에 필적하는 유전자 발현, 신호 전달 및 사이토카인 유도에 상당한 변화를 유도하며, 이는 LPS 자극만으로도 그람 음성 박테리아에 대한 대식세포 반응을 모델링할 수 있음을 나타냅니다19,20,21년. TLR4 또는 TLR5를 통한 신호전달은 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(MyD88) 의존성 캐스케이드 및 종양괴사인자(TNF)-α, IL-6 및 IL-12p40을 포함한 전염증성 사이토카인의 핵인자(NF)-κB 매개 생성을 시작합니다.18,22,23년.

IL-27이 단핵구에서 TLR4 발현을 상향 조절한다는 연구 결과에 근거11이 연구는 IL-27이 LPS 및 편모를 포함한 박테리아 제품에 대한 대식세포 반응 또는 살아있는 박테리아 감염을 조절할 수 있는지 여부를 조사합니다. 당사의 데이터는 IL-27이 TLR4 및 TLR5 발현을 향상시켜 각각 LPS 및 편모 자극에 대한 반응으로 단핵구에 의한 더 큰 NF-κB/활성제 단백질(AP)-1 신호를 강화한다는 것을 보여줍니다. IL-27은 S. typhimurium 세포 침습 또는 박테리아 유도 세포 사멸에 영향을 미치지 않았지만, 대식세포의 IL-27 전처리 후 S. typhimurium에서 유래한 LPS로 자극하거나 S. typhimurium에 감염시킨 결과 처리되지 않은 세포에 비해 전염증성 사이토카인 생성이 증폭되었습니다. 종합하면, 우리의 데이터는 그람 음성 박테리아 산물 또는 S. 티피무리움 감염에 대한 반응으로 전염증성 사이토카인 생성에 대한 면역 조절 기능 외에도 인간 단핵구 및 대식세포에서 TLR4 및 TLR5 발현을 증가시키는 IL-27의 새로운 역할을 강조합니다.

결과

LPS와 IL-27의 동시 자극은 골수성 세포에서 전염증성 사이토카인 발현을 상향 조절합니다.

이전 연구에서는 IL-27을 사용한 전처리는 TLR4 상향 조절을 통해 인간 면역 세포에서 대장균 LPS 반응성과 사이토카인 생성을 향상시키는 반면, LPS와 IL-27을 병용처리하면 인플라마좀 활성과 IL-1β 발현을 향상시키는 것으로 나타났습니다11,13년. 우리는 처음에 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 1차 인간 단핵구뿐만 아니라 인간 단핵구 세포주인 THP-1의 반응을 테스트했습니다. IL-27 자극이 단핵구와 대식세포에 어떤 영향을 미치는지 모델링하기 위해 THP-1 세포와 PMA 분화 THP-1 세포(PMA-THP-1)의 반응을 비교했습니다. 모든 세포를 E. coli LPS(LPS-E; 100ng/ml)와 재조합 인간 IL-27(50ng/ml)로 밤새 자극했습니다. IL-12p40, TNF-α 및 IL-6의 분비 수준은 ELISA에 의해 cell-free 상층액에서 정량화되었습니다. 각 세포 유형은 LPS-E 단독 또는 IL-27과 LPS-E에 반응하여 검사된 모든 사이토카인을 생산했습니다(그림 D). 1A–D)를 참조하십시오. 또한, IL-27 단독으로는 검출 가능한 사이토카인 생성을 유도하지 못했지만, IL-27과 LPS를 동시에 첨가하면 모든 세포에서 IL-12p40, TNF-α, IL-6 생성이 유의하게 향상되었습니다. THP-1 세포와 비교했을 때, PMA-THP-1 세포는 LPS 단독으로 반응했을 때 24시간 후 더 높은 수준의 사이토카인 유도를 보인 반면, THP-1 세포는 IL-27 공동 자극 시 더 큰 증가를 보였다(Fig. 1C,D)입니다. 예상대로, CD14 발현 수준은 LPS-반응성과 상관관계가 있었다(Fig. 도 1, 우측 패널) CD14는 TLR4 매개 LPS 인식을 위한 공동 수용체입니다24,25년. PBMC는 단핵구, 림프구 및 과립구를 포함한 세포의 혼합 집단이기 때문에 CD14 높은 세포는 집단의 10%만을 구성하므로 이러한 세포는 정제된 단핵구에 비해 LPS 및 IL-27/LPS 유도 사이토카인 발현이 적습니다(그림 1). 1A,B, 오른쪽 패널). 유사하게, PMA-THP-1 세포는 THP-1 세포에 비해 더 높은 CD14 발현을 나타내며, 이는 THP-1 세포에 비해 PMA-THP-1 세포에서 상대적으로 더 높은 LPS-반응과 상관관계가 있다(Fig. 1C,D, 오른쪽 패널). 종합하면, 이러한 결과는 IL-27이 단핵구에 비해 대식세포에서 그 정도가 덜하지만 LPS 반응성을 향상시킨다는 것을 나타냅니다. 단핵구와 대식세포에서 관찰된 반응성의 차이를 추가로 분석하기 위해 THP-1 및 PMA-THP-1 세포에 대한 후속 실험에 초점을 맞췄습니다.

그림 1

IL-27과의 동시 자극은 인간 골수성 세포에서 LPS 유도 사이토카인 생성을 향상시켰습니다. 인간 PBMC(A), 일차 인간 단핵구(B), THP-1 세포(C) 및 PMA-THP-1 세포(D)를 LPS-E(100ng/ml), IL-27(50ng/ml) 또는 LPS-E와 IL-27 병용하여 24시간 동안 자극했습니다. IL-12p40, TNF-α 및 IL-6 수준(왼쪽 패널)은 ELISA에 의해 cell-free 상층액에서 측정되었습니다. CD14 발현은 휴지 세포(우측 패널)에서 유세포 분석으로 측정하였다. 히스토그램에는 CD14 발현과 각 세포 유형(A–D, 오른쪽 패널)의 자가형광이 포함됩니다. 데이터는 최소 3개의 서로 다른 헌혈자 또는 한 실험에서 ELISA 기술 반복의 평균 및 표준 편차를 보여주는 독립적인 반복 실험을 대표합니다. Mann Whitney U 검정은 표시된 대로 쌍 간의 통계 분석에 사용되었습니다. ns = 중요하지 않음; *p≤0.05; **피≤0.01; 피≤0.001.

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IL-27은 THP-1 세포에서 유도성 NF-κB/AP-1 신호전달을 향상시키지만 PMA-THP-1 세포에서는 강화하지 않습니다.

NF-κB 및 AP-1 전사 인자의 활성화는 LPS 유도 사이토카인 발현의 핵심입니다26; 또한, IL-27 매개 사이토카인 생산이 NF-κB 활성에 의존한다는 것을 입증한 바 있습니다10. 따라서 TLR4 매개 신호전달에 대한 IL-27 및 LPS의 동시 전달 효과를 평가하기 위해 E. coli 유래 LPS(LPS-E) 또는 S. typhimurium-derived LPS(LPS-S)와 함께 자극된 THP-1 및 PMA-THP-1 세포에서 면역블롯에 의한 NF-κBp65 인산화를 15분 동안 IL-27(50ng/ml)의 존재 또는 부재 상태에서 100ng/ml의 플라겔린 또는 500ng/ml의 편모를 측정했습니다. IL-27이 없는 경우, 두 세포 유형 모두 예상대로 LPS-E, LPS-S 및 LPS-S + Flag에 반응하여 NF-κBp65 인산화를 나타냈습니다(그림 1). 2A,B)를 참조한다. THP-1 세포에서 편모는 PMA-THP-1 세포에 비해 NF-κBp65 인산화의 더 큰 유도를 유도했습니다. IL-27 자극 단독으로 THP-1 세포의 배지 대조군에 비해 NF-κBp65 인산화가 약간 향상되었습니다. 그러나 IL-27과 TLR4 및 TLR5 작용제와의 동시 자극은 이들 세포에서 NF-κBp65 인산화를 감소시켰습니다(그림 1). 대조적으로, PMA-THP-1 세포의 IL-27 병용처리는 총 NF-κBp65 수준에 비해 LPS-E-, LPS-S- 또는 편모 매개 NF-κBp65 인산화를 무시할 수 있을 정도로 변화시켰다(그림 D). 2B)를 참조하십시오.

그림 2

IL-27은 THP-1 단핵구에서 TLR 매개 NF-κB/AP-1 활성을 변경했지만 PMA-THP-1 대식세포에서는 그렇지 않았습니다. THP-1 세포(A) 및 PMA-THP-1 세포(B)를 LPS-E(100ng/ml), LPS-S(100ng/ml), 편모(Flag)(500ng/ml), IL-27(50ng/ml) 또는 TLR 작용제와 IL-27의 병용요법으로 15분 동안 자극하였다. NF-κBp65 서브유닛(p-p65)의 인산화는 전체 세포 용해물에 대한 면역블로팅을 사용하여 제시되었습니다. 멤브레인을 벗겨내고 로딩 컨트롤로서 팬 NF-κBp65(팬 p65)에 대해 다시 프로빙했습니다. 표시된 이미지는 세 가지 독립적인 실험을 대표합니다. THP-1 XBlue 세포(C) 및 PMA-THP-1 XBlue 세포(D)를 LPS-E(100ng/ml), LPS-S(100ng/ml), 편모(Flag)(500ng/ml), IL-27(50ng/ml) 또는 TLR 작용제와 IL-27의 조합으로 24시간 동안 자극하여 NF-κB/AP-1 유도 SEAP 생성 및 분비를 허용했습니다. SEAP 생산은 비색 QUANTI-Blue™ 분석을 사용하여 정량화되었습니다. 중간 대조군(MED)에 대한 접힘 변화를 계산했습니다. 데이터는 세 가지 실험의 평균과 표준 편차를 나타냅니다. Mann Whitney U 테스트는 TLR 작용제와 MED(라인 없음) 또는 표시된 쌍 간(라인)의 통계 분석에 사용되었습니다. ns = 중요하지 않음; *p≤0.05; **피≤0.01.

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NF-κBp65의 인산화를 조사하는 것 외에도 THP-1 XBlue 세포를 사용하여 NF-κB와 AP-1 활성화의 결합 효과를 조사했습니다. 이 세포는 NF-κB/AP-1 유도 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 리포터 유전자를 발현하며 전사 활성에 대한 강력하고 정량적인 판독을 제공합니다27,28,29,30. IL-27(50ng/ml)의 존재 또는 부재 하에서 밤새 100ng/ml의 LPS-E 또는 LPS-S 또는 500ng/ml의 편모와 함께 THP-1 XBlue 및 PMA-THP-1 XBlue 세포를 공동 자극했습니다. THP-1 XBlue 세포에서 IL-27 단독으로는 NF-κB/AP-1을 유의하게 활성화하지 않았다(그림 1). 2C), 이전 연구와 달리11; 이러한 불일치는 현재 연구에서 더 낮은 용량의 IL-27(100ng/ml에 비해 50ng/ml)을 사용했기 때문입니다. THP-1 XBlue 세포와 PMA-THP-1 XBlue 세포의 용량 반응 실험에서 100ng/ml에서 IL-27을 자극하면 IL-27 및 자극되지 않은 세포의 50ng/ml에 비해 NF-κB/AP-1 활성이 크게 향상되는 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, PMA-THP-1 XBlue 세포에서 IL-27(50ng/ml)은 NF-κB/AP-1 활성을 유도했지만, 이는 TLR 작용제에 비해 중간 정도의 반응이었습니다(그림 1). THP-1 XBlue 세포에서 LPS-E 및 LPS-S 모두 NF-κB/AP-1 활성화를 유도했으며, 이는 동시 IL-27 처리에 의해 유의하게 향상되었습니다(그림 2). 도 2c), NF-κB 인산화 수준과 대조된다(그림 D). PMA-THP-1 XBlue 세포에서, NF-κB/AP-1 활성은 IL-27의 첨가 유무에 관계없이 LPS-E, LPS-S 또는 LPS-S + Flag 간에 유사하였다(도 2A). 2D) NF-κBp65의 인산화와 유사하다(그림 D). 종합하면, 이러한 결과는 단핵구와 대식세포 간의 IL-27 치료에 대한 차등 반응을 나타내며 NF-κB와 AP-1 전사 인자 활성화의 조합이 관여함을 시사합니다.

박테리아 작용제에 의해 시작된 사이토카인 반응에 대한 IL-27의 효과를 추가로 조사하기 위해 LPS-E와 LPS-S의 반응을 비교했습니다. THP-1 및 PMA-THP-1 XBlue 세포 모두에서 LPS-E 및 LPS-S 자극은 자극되지 않은 대조군에 비해 상당한 NF-κB/AP-1 활성화를 초래했습니다(그림 1). 2C,D)를 참조하십시오. THP-1 XBlue 세포에서 LPS-E는 LPS-S에 비해 더 큰 NF-κB/AP-1 활성화를 유도했습니다(그림 D). 도 2c), PMA-THP-1 XBlue 세포에서는 LPS-E 및 LPS-S 모두 유사한 NF-κB/AP-1 활성화를 나타냈다(도 2c). IL-27로 처리한 결과, THP-1 XBlue 세포에서는 LPS 유도 NF-κB/AP-1 활성이 유의하게 높아졌지만, PMA-THP-1 XBlue 세포에서는 그렇지 않았습니다. 또한, IL-27과 LPS-S의 동시 자극은 THP-1 XBlue 세포에서 LPS-E보다 NF-κB/AP-1 활성에서 더 큰 배 변화를 가져왔습니다(그림 1). 흥미롭게도, S. typhimurium flagellin 단독으로 자극하면 NF-κB/AP-1 활성이 향상되고 IL-27을 추가하면 PMA-THP-1 세포에서 통계적 유의성에 도달하지 못했지만 두 세포 유형 모두에서 편모에 의한 NF-κB/AP-1 활성의 중간 정도의 상향 조절이 이루어졌습니다(그림 1). 2C,D)를 참조하십시오. LPS-S와 편모를 함께 첨가하면 THP-1 XBlue 세포에서 LPS-S 또는 편모 단독에 비해 NF-κB/AP-1 활성이 더 커졌으며, 이는 IL-27 병용처리로 더욱 증가했습니다. 그러나, PMA-THP-1 XBlue 세포에서, LPS-S와 편모의 첨가는 LPS-S 단독의 그것보다 NF-κB/AP-1 활성을 증가시키지 않았고, IL-27의 첨가는 이러한 조건 하에서 NF-κB/AP-1 활성을 증가시키지 않았다. 종합하면, IL-27은 THP-1 세포에서 LPS 신호 전달 능력을 향상시키지만 PMA-THP-1 세포에서는 향상시키지 않습니다. 또한 IL-27은 THP-1 세포에서 LPS-E보다 LPS-S에 대한 반응을 더 크게 향상시켰습니다. 따라서 후속 실험에서는 IL-27이 S. 티피무리움 성분 및 감염에 대한 반응에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 두었습니다.

TLR4 및 TLR5 발현은 IL-27에 의해 향상됩니다.

S. typhimurium 성분에 대한 반응으로 NF-κB/AP-1 활성화에 대한 IL-27의 영향이 TLR4 및 TLR5 발현 수준이 다르기 때문인지 확인하기 위해 IL-27(50ng/ml)이 있거나 없는 THP-1 및 PMA-THP-1 세포를 16시간 동안 처리하고 유세포 분석으로 TLR4 및 TLR5의 표면 발현을 측정했습니다. 흥미롭게도, TLR4 및 TLR5 발현의 기저 수준은 PMA-THP-1 세포에 비해 THP-1 세포에서 더 높았습니다(그림 1). 3A,B)를 참조한다. 또한, TLR4 및 TLR5 발현 수준은 THP-1 및 PMA-THP-1 세포 모두에서 자극되지 않은 대조군에 비해 IL-27 처리에 대한 반응으로 향상되었습니다(그림 1). 3A,B)를 참조한다. 이는 IL-27이 단핵구와 대식세포에서 TLR4 및 TLR5 발현을 상향 조절하여 박테리아 성분에 대한 반응을 향상시킬 수 있음을 시사합니다.

그림 3

IL-27을 사용한 자극은 단핵구와 대식세포에서 TLR4 및 TLR5 발현을 증가시켰습니다. THP-1 세포(A) 및 PMA-THP-1 세포(B)를 IL-27(50ng/ml)의 유무에 관계없이 16시간 동안 자극했습니다. 세포는 유세포 분석에 의한 수용체 발현 정량을 위해 항인간 TLR4(상단 패널) 또는 TLR5(하단 패널) 항체로 염색되었습니다. 염색되지 않은 세포를 획득하여 각 세포 유형의 자가형광을 정량화했습니다. 데이터는 3회 이상의 독립적인 반복실험을 대표합니다.

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IL-27은 S. typhimurium 성분에 대한 사이토카인 반응을 향상시킵니다.

LPS 단독에 비해 IL-27이 LPS-E보다 LPS-S와 함께 자극했을 때 THP-1 세포에서 NF-κB/AP-1 활성이 더 크게 증가하고, IL-27이 THP-1 및 PMA-THP-1 세포에서 TLR4 및 TLR5 발현을 향상시킨다는 것을 확인한 후, 우리는 다음으로 S. 티피무리움 주도 사이토카인 생산에 초점을 맞췄습니다. THP-1 및 PMA-THP-1 세포는 IL-27(50ng/ml)의 존재 또는 부재 하에서 LPS-S(100ng/ml), S. 티피무리움 편모(500ng/ml) 또는 둘 다로 24시간 동안 자극되었습니다. ELISA에 의해 IL-12p40, TNF-α 및 IL-6의 생산을 위해 cell-free 상층액을 측정하였다. IL-27 단독으로 처리한 경우, 치료하지 않은 대조군에 비해 두 세포 유형 모두에서 유의한 사이토카인 수치를 유도하지 않았습니다(그림 1). 4A–F)를 참조하십시오. 그림에서 관찰된 NF-κB/AP-1 활성화와 일치합니다. 도 2, IL-12p40, TNF-α 및 IL-6 생산은 LPS-S 단독에 비해 24시간 동안 LPS-S 및 IL-27과 함께 자극된 THP-1 세포에서 유의하게 상향 조절되었다(Fig. 4A–C)를 참조한다. PMA-THP-1 세포의 IL-27 처리는 LPS 유도 사이토카인 발현의 중간 정도이지만 유의한 증가를 가져왔다(그림 1). 4D-F)에 속하지만, LPS 단독과의 비교에서 THP-1 세포에 비해 PMA-THP-1에서 차이가 적었다. 특히, PMA-THP-1 세포는 THP-1 세포에 비해 TNF-α 및 IL-6 생산 수준이 더 높았습니다. 편모를 사용한 자극은 PMA-THP-1 세포에서 IL-12p40 생산을 제외하고는 어느 세포 유형에서도 IL-27의 유무에 관계없이 검출 가능한 사이토카인 생성을 유도하지 않았다(그림 1). 도 4D). THP-1 및 PMA-THP-1 세포 모두에서, 편모와 LPS-S의 공동 자극은 LPS-S 단독에 비해 사이토카인 생성을 증가시키지 않았다는 점에 주목하는 것은 흥미롭다(Fig. 4). 또한, IL-27은 TLR5 발현의 증가에도 불구하고 THP-1 또는 PMA-THP-1 세포에서 편모 매개 사이토카인 생산을 변경하지 않았습니다(그림 D). 3).

그림 4

IL-27을 동시에 치료하면 TLR4/TLR5 작용제에 반응하여 사이토카인 생성이 증가합니다. THP-1 세포(A–C) 및 PMA-THP-1 세포(D–F)를 LPS-S(100ng/ml), 편모(Flag)(500ng/ml), IL-27(50ng/ml) 또는 TLR 작용제와 IL-27의 조합으로 24시간 동안 자극했습니다. IL-12p40(상단 패널), TNF-α(중간 패널) 및 IL-6(하단 패널) 수준은 ELISA에 의해 cell-free 상층액에서 측정되었습니다. 데이터는 한 실험에서 ELISA 기술 반복실험의 평균 및 표준 편차를 보여주는 최소 3개의 독립 반복실험을 대표합니다. Mann Whitney U 검정은 표시된 대로 쌍 간의 통계 분석에 사용되었습니다. ns = 중요하지 않음; *p≤0.05; **피≤0.01; 피≤0.001.

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IL-27 전처리는 S. 티피무리움 감염에 대한 사이토카인 반응을 향상시킵니다.

우리는 IL-27 치료가 세균 감염에 대한 반응을 조절할 수 있다고 추론했다. 이 실험을 위해 우리는 THP-1 세포에 비해 S. typhimurium에 더 쉽게 감염되는 PMA-THP-1 세포에 초점을 맞췄습니다(그림 D). 5ᅡ)31. S. typhimurium 감염이 PMA-THP-1 세포의 세포 사멸을 유도한다는 점을 감안할 때32, 우리는 IL-27이 보호 효과를 발휘할 수 있는지 테스트했습니다. 세포 사멸은 배지(대조군)에서 배양하거나 IL-27로 전처리한 후 1.5시간, 8시간 또는 12시간 동안 고정상 S. 티피무리움(또는 모의) 감염을 수행한 PMA-THP-1 세포에서 모니터링되었습니다. S. 티피무리움의 존재는 예상대로 PMA-THP-1 세포 사멸을 약 25%의 세포 사멸에서 12시간 후 약 60%로 증가시켰습니다32그러나 IL-27 전처리는 세포 사멸 수준을 변화시키지 않았다(그림 1). IL-27 전처리가 S. typhimurium의 세포 감염 능력에 영향을 미치는지 확인하기 위해, IL-27로 전처리된 세포에 대해 겐타마이신 보호 분석을 수행한 후 기하급수적 또는 고정상 박테리아에 감염시켰다(그림 1). 5C). 기하급수적 단계 S. typhimurium은 내재화를 향상시키는 것으로 알려진 독성 단백질을 활발하게 분비하는 반면, 고정상 박테리아는 덜 침습적이고 흡수는 식세포작용에 더 의존합니다33. 기하급수적 단계 S. 티피무리움의 더 높은 수준의 내재화는 감염 후 1.5시간의 고정상에 비해 감염 후 1시간에 검출되었습니다. 그러나, IL-27은 지수 또는 정지 위상 S. 티피무리움의 내재화에 영향을 미치지 않았다(Fig. 감염 후 8시간 및 12시간에 S. 티피무리움 내재화에 대한 IL-27의 영향을 추가로 분석한 결과, IL-27 치료가 통계적 유의성에 도달하지는 않았지만 이러한 후기 시점에서 기하급수적 S. 티피무리움의 생존율이 약간 감소하는 것을 관찰했다(Fig. 도 5D)를 참조한다.

그림 5

IL-27 전처리는 S. typhimurium 내재화 또는 감염 유발 세포 사멸에 영향을 미치지 않습니다. (A) THP-1 세포 및 PMA-THP-1 세포를 S. 티피무리움(MOI: 10)에 1, 2, 4시간 동안 감염시켰다. 내재화된 박테리아는 겐타마이신 보호 분석을 사용하여 정량화(콜로니 형성 단위(CFU)/ml)했습니다. (B) PMA-THP-1 세포를 IL-27(50ng/ml)의 유무에 관계없이 16시간 동안 처리한 후 1.5시간, 8시간 및 12시간 동안 고정상 S. 티피무리움 감염을 처리했습니다. 프로피듐 요오드화물 염색은 유세포 분석으로 PMA-THP-1 세포의 세포 사멸을 정량화하는 데 사용되었습니다. (C) PMA-THP-1 세포를 IL-27(50ng/ml)의 유무에 관계없이 16시간 동안 처리한 후 각각 60분 또는 30분 동안 고정상 또는 지수기 S. 티피무리움 감염을 처리했습니다. 감염 직후 내재화된 박테리아(CFU/ml)의 수를 측정하기 위해 겐타마이신 보호 분석법을 사용했습니다. (D) PMA-THP-1 세포를 IL-27(50ng/ml)의 유무에 관계없이 16시간 동안 처리한 다음, 각각 60분 또는 30분 동안 고정상 또는 지수기 S. 티피무리움에 감염된 후 8시간 및 12시간 배양했습니다. PMA-THP-1 관련 박테리아를 정량화했습니다(CFU/ml). Mann Whitney U 검정은 표시된 대로 개별 쌍 간의 통계 분석에 사용되었습니다. IL-27이 있거나 없는 세포에서 S. 티피무리움 감염 단계 간 비교를 위한 통계 분석에는 일원 분산 분석이 사용되었습니다. ns = 중요하지 않음; *p≤0.05; **피≤0.01; 피≤0.001; 피≤0.0001.

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IL-27이 박테리아 성분과 함께 자극될 때 TLR4 및 TLR5 발현을 상향 조절하고 사이토카인 반응을 증폭시킨다는 점을 감안할 때, IL-27이 S. 티피무리움 감염에 대한 대식세포 반응도 향상시킬 수 있는지 테스트했습니다. 처음에는 IL-27 유도 TLR4 및 TLR5 발현이 사이토카인 생성 향상과 일치하는지 확인하기 위해 PMA-THP-1 대식세포를 IL-27로 16시간 전처리한 후 LPS-S, 편모 또는 LPS-S와 편모를 8시간 또는 12시간 동안 자극했습니다. IL-27로 전처리한 결과, 처리되지 않은 세포에 비해 12시간 후 LPS-S에 반응하여 IL-12p40 생산이 크게 향상되었습니다(그림 1). 6A), 반면 IL-27 처리는 LPS-S 자극 후 8시간 및 12시간 모두에서 TNF-α 및 IL-6 생성을 증가시켰다(그림 1). 6B,C)를 참조한다. 편모 자극은 검출 가능한 사이토카인 생성을 단독으로 유도하지 않았으며, 편모와 LPS-S의 동시 첨가는 처리되지 않은 세포 또는 IL-27 전처리된 세포에서 LPS-S 단독에 비해 사이토카인 생산을 증가시키지 않았다(Fig. 6A–C)를 참조한다. IL-27 전처리가 전체 박테리아에 대한 대식세포 반응도 향상시킬 수 있는지 조사하기 위해 PMA-THP-1 세포를 고정상 S. 티피무리움에 감염되기 전에 IL-27로 8시간 및 12시간 동안 전처리했습니다. 상층액은 ELISA에 의해 IL-12p40, TNF-α 및 IL-6 생산에 대해 분석되었습니다. S. 티피무리움 성분을 이용한 자극과 유사하게, IL-27 전처리는 S. 티피무리움 감염 세포에서 치료되지 않은 감염된 세포에서 관찰된 것보다 더 큰 사이토카인 유도를 향상시켰습니다(그림 1). 6D-F)를 참조하십시오. 종합하면, 이러한 데이터는 IL-27이 인간 대식세포에서 S. 티피무리움 감염에 의해 유발된 사이토카인 방출을 증폭하는 기능을 한다는 것을 나타냅니다.

그림 6

IL-27로 전처리하면 S. 티피무리움 성분 및 감염에 대한 반응으로 사이토카인 생성이 증가합니다. PMA-THP-1 세포를 IL-27(50ng/ml)의 유무에 관계없이 16시간 동안 처리한 후 LPS-S(100ng/ml), 편모(Flag)(500ng/ml) 또는 지시된 TLR 작용제(A–C) 또는 고정상 S. 티피무리움(MOI: 10)(D–F)의 조합으로 8시간 또는 12시간 동안 처리했습니다. IL-12p40(상단 패널), TNF-α(중간 패널) 및 IL-6(하단 패널) 수준은 ELISA에 의해 cell-free 상층액에서 측정되었습니다. 데이터는 한 실험에서 ELISA 기술 반복실험의 평균 및 표준 편차를 보여주는 최소 3개의 독립 반복실험을 대표합니다. Mann Whitney U 검정은 표시된 대로 쌍 간의 통계 분석에 사용되었습니다. ns = 중요하지 않음; *p≤0.05; **피≤0.01; 피≤0.001.

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Discussion

Our data show that IL-27 enhances TLR4 and TLR5 expression‎ in human monocytes and macrophages. IL-27 treatment also enhances both TLR4- and TLR5-mediated NF-κB/AP-1 activation in human monocytes, but not in macrophages. Furthermore, co-stimulation with IL-27 and LPS enhances LPS-mediated cytokine production in both monocytes and macrophages, and pre-treatment with IL-27 enhances S. typhimurium-induced proinflammatory cytokine production. Given that S. enteritidis infection of murine BMDM induces IL-27 expression‎ in addition to other cytokines34, our study suggests that during bacterial infection, autocrine effects of IL-27 may result in the propagation of inflammatory responses from monocytes and macrophages. This is in contrast with studies outlining the regulation of proinflammatory cytokine expression‎ by IL-27 in the context of microbial infection that focus on Mycobacterium tuberculosis infection, where neutralization of IL-27 enhanced production of proinflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ as well as anti-microbial activity35,36. However, WSX-1-deficient mice are more susceptible to Listeria infection and show impaired initiation of Th1 responses37,38, while the addition of IL-27 to neutrophils in vitro resulted in significantly enhanced IL-1β and TNF-α production and bacterial survival following Burkholderia pseudomallei infection39. Collectively, these studies demonstrate a role for IL-27 in modulating inflammatory responses that is dependent on the type of bacterial infection model.

TLR4는 S. typhimurium의 성장을 조절하는 데 필수적인 기능을 가지고 있으며, TLR4 녹아웃 마우스는 박테리아 부하가 더 크고 전염증성 사이토카인 생성이 현저히 적다는 사실이 밝혀졌습니다40. 또한 TLR5 녹아웃 마우스 또는 TLR5가 결핍된 세포도 편모 또는 S. 티피무리움 감염에 대한 반응으로 사이토카인 생성이 감소합니다41,42,43. 또한 TLR4와 TLR5는 최적의 항균 반응을 위해 협력하는 것으로 생각됩니다41,44년. 따라서 이러한 수용체의 IL-27 매개 조절은 S. 티피무리움 감염에 대한 세포 반응을 향상시킬 수 있습니다.

골수성 세포에서 IL-27과 LPS 반응성 사이의 연관성을 시사하는 증거가 늘어나고 있습니다. 첫째, Kalliolias와 Ivashkiv는 IL-27 및 LPS로 처리된 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)가 있는 인간 단핵구가 IL-27 처리를 하지 않은 경우에 비해 STAT1 의존적 방식으로 TNF-α 및 IL-6 mRNA 및 사이토카인 생산을 향상시킨다는 것을 발견했습니다8. 마찬가지로, IL-27 및 LPS와 함께 자극된 호산구는 LPS 단독에 비해 더 큰 IL-8 생성을 유도했습니다45. 그 결과, 우리 연구팀은 1차 인간 단핵구의 IL-27 전처리가 LPS 유도 IL-6, TNF-α, MIP-1α 및 MIP-1β 발현을 향상시킨다는 것을 입증했습니다11. IL-27 전처리는 LPS 유도 NF-κBp50 및 p65 인산화 증폭 및 TLR4 발현 유도 및 더 큰 TLR4-CD14 공동 국소화11. 또한 단핵구를 IL-27 및 LPS에 동시에 노출시키면 LPS 유도 인플라마좀 형성 및 IL-1β 생성이 향상되는 것으로 나타났습니다13. 흥미롭게도 IL-27은 LPS 수용체인 TLR4와 퓨린성 ATP 수용체인 P2X7을 모두 강화하여 인플라마좀 활성화를 촉진했습니다13. 이러한 연구는 IL-27이 골수성 세포에서 LPS 유도 사이토카인 유도를 증폭한다는 개념을 뒷받침합니다.

이 연구에서 우리는 IL-27 자극에 대한 반응으로 TLR5 발현이 증가했음을 입증했으며, 이는 TLR5 의존성 항균 반응 조절에서 IL-27에 대해 이전에 정의되지 않은 역할을 나타냅니다. 또한, IL-27이 있는 THP-1 XBlue 세포에서 편모 유도 NF-κB/AP-1 활성화가 강화되는 것을 관찰하여 IL-27이 단핵구에서 TLR5 매개 신호 전달을 향상시킬 수 있음을 입증했습니다. 그러나 THP-1 또는 PMA 처리된 THP-1 세포의 편모 처리에 대한 반응으로 사이토카인 발현의 차이를 검출할 수 없었습니다. 다른 연구자들은 1–10 μg/ml의 농도로 Treponema pallidum에서 유래한 편모 단백질에 반응하여 THP-1 세포에서 IL-6 및 IL-8 발현을 검출했습니다46. 우리의 데이터와 일치하게, TNF-α mRNA 유도가 검출되었음에도 불구하고 100ng/ml의 S. typhimurium flagellin은 THP-1 세포에서 TNF-α, IL-12p40 또는 IL-1β 생성을 유도하지 않았습니다47. 2.5–100ng/ml의 살모넬라 편모충 유도 IFN-γ 유도 단백질 10(IP-10) 및 IL-8 생산으로 THP-1 세포 처리48,49년; 그러나 우리는 우리 모델에서 이러한 케모카인을 조사하지 않았습니다. 본 모델에서는 상당한 NF-κBp65 인산화 및 NF-κB/AP-1 활성화에도 불구하고 500ng/ml의 편모 투여량이 검출 가능한 수준의 IL-12p40, IL-6 또는 TNF-α 분비를 유도하기에 불충분했을 수 있습니다.

감염되면 단핵구가 조직에 모집되어 대식세포 또는 수지상세포로 분화합니다50. 분화 전에 전염증성 단핵구는 높은 CD14 발현과 낮은 CD16 발현으로 분류되는 반면, 순찰 단핵구는 CD14 발현이 낮고 CD16 발현이 높은 경향이 있습니다50,51년. 전염증성 단핵구는 식세포작용을 유도하여 전염증성 사이토카인의 분비를 통해 더 큰 항균 능력을 갖습니다52,53년. 이 연구에서는 LPS에 유사하게 반응하는 인간 단핵구와 대식세포의 모델로 THP-1 세포를 사용했습니다54,55,56. THP-1 세포의 PMA 처리는 표면 CD14 발현을 향상시키고 세포를 대식세포 표현형으로 분화시킵니다.57. 인간 전구구 U38 세포의 PMA 분화는 PMA를 처리하지 않은 U38 세포에 비해 살모넬라 편모충에 대한 반응으로 향상된 TNF-α 생산을 나타냅니다.58. 이에 따라 세포의 분화 상태의 결과로 E. coli와 S. typhimurium에서 유래한 LPS에 대한 반응으로 THP-1 세포에 비해 PMA-THP-1 세포에서 더 많은 사이토카인 생산이 관찰되었습니다. 또한, IL-27 처리는 S. 티피무리움에 감염된 PMA-THP-1 세포의 사이토카인 생성을 더욱 강화했습니다. 인간 대식세포에 의한 사이토카인 유도 증가는 적응 면역 세포를 모집하여 박테리아 감염을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실제로 IL-27은 세균 감염에 대한 CD4 T 도우미 세포 매개 보호를 촉진하는 것과 관련이 있습니다59,60년.

흥미롭게도, THP-1 세포에서 NF-κBp65의 인산화 수준은 IL-27과 LPS 또는 편모를 동시에 처리한 세포에서 SEAP 분석으로 검출된 전사 활성 수준과 직접적인 상관관계가 없었습니다. 특히, IL-27 첨가는 THP-1 세포에서 LPS/편모 유도 NF-κBp65 인산화를 감소시켰으며, SEAP 분석은 IL-27이 NF-κB/AP-1 활성을 향상시킨다는 것을 입증했습니다. THP-1 세포의 박테리아 성분에 대한 반응으로 NF-κBp65 인산화에 대한 IL-27과의 동시 자극의 잠재적인 부정적인 조절 효과는 IL-27 및 TLR 매개 신호 전달 경로 간의 누화를 시사할 수 있습니다. 반대로, PMA-THP-1 세포에서 NF-κBp65의 인산화는 SEAP 분석에 의해 검출된 NF-κB/AP-1 활성과 상관관계가 있습니다. 전반적으로, 관찰된 차이는 SEAP 분석이 결합된 AP-1 및 NF-κB 전사 활성에 대한 정보를 제공하는 이러한 분석의 판독값이 다르기 때문일 수 있습니다. IL-27과 박테리아 성분(LPS 및 편모)을 함께 처리한 PMA-THP-1 세포는 성분만 사용한 경우와 비교했을 때 TLR4 및 TLR5 유도 신호 활성에 큰 차이가 없다는 것은 NF-κB 또는 AP-1 이외의 전사 인자가 IL-27 처리 세포에서 사이토카인 발현을 더 많이 유도하는 역할을 한다는 것을 시사합니다. 또한 IL-27은 mRNA 안정성, 단백질 수송 또는 사이토카인 분비와 같은 과정에 관여하는 다른 분자에 영향을 미칠 수 있습니다.

골수성 세포의 그람 음성 세균 감염은 IL-27 생성을 유도하는 것으로 잘 설명되어 있습니다34,60,61; 이 연구는 IL-27이 S. typhimurium 또는 그 구성 요소 감염에 대한 전염증 반응을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다고 설명합니다. IL-27로 THP-1 세포 또는 PMA-THP-1 세포를 자극하면 세포 표면에서 TLR4 및 TLR5 발현이 증가하여 더 큰 LPS/편모 매개 신호 전달 및 다운스트림 IL-12p40, TNF-α 및 IL-6 생산을 유도합니다. IL-27은 S. typhimurium 내재화에 영향을 미치지 않지만, 사이토카인 생성을 강화하여 박테리아 감염과 싸우고 제거하는 보다 강력한 면역 반응을 제공합니다. 그람 음성 세균 감염 전에 IL-27 치료 시 염증 반응이 증가하면 적응 면역 반응 유도로 인해 감염 제거율이 높아질 수 있습니다.

재료 및 방법

세포주, 세포 배양 및 시약

THP-1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하고, 10% 소 태아 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco by Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. THP-1 XBlue 세포는 InvivoGen(캘리포니아주 샌디에이고)에서 구입하였다. 제오신(200μg/ml; InvivoGen) 선별 항생제를 배양 중인 Zeocin-resistant THP-1 XBlue 세포에 첨가하였다. THP-1 및 THP-1 XBlue 세포는 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, 10ng/ml; BioShop Canada Inc., Burlington, ON)을 48시간 동안 세척한 후 RPMI + 10% FBS로 세척한 후 신선한 배양 배지에서 48시간 배양합니다. 재조합 인간 IL-27은 R&D Systems(미네소타주 미니애폴리스)로부터 구입하였다. 대장균 0111:B4(LPS-E)의 LPS 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움(S. typhimurium)(LPS-S)의 LPS는 Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스)에서 구입했습니다. S. typhimurium의 Flagellin (Ultrapure)은 InvivoGen에서 구입했습니다.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)

전혈은 Canadian Tri-Council Policy Statement: Ethical Conduct for Research Involving Humans 및 Queen's University Health Sciences and Affiliated Teaching Hospitals Research Ethics Board(HSREB)의 권장 사항에 따라 얻은 건강한 지원자로부터 채취되었습니다. 인체 샘플에 대한 모든 연구는 Queen's University HSREB에서 설명한 관련 지침/규정에 따라 수행되었습니다. 모든 피험자는 헬싱키 선언과 HSREB가 승인한 프로토콜에 따라 서면 동의서를 제출했습니다. 샘플을 림프라이트 인간 세포 분리 배지(Cedarlane, Burlington, ON)에 오버레이하고 50ml 원뿔형 튜브에서 800g에서 20분 동안 밀도 원심분리로 처리했습니다. PBMC를 함유하는 버피 코트를 분리하고, PBS + 10mM EDTA + 2% FBS로 2회 세척한 후, PBMC를 1× 10에서 RPMI + 10% FBS에 재현탁시켰다6 세포/ml.

1차 인간 단핵구 분리

전혈 샘플은 제조업체의 지침에 따라 RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies, Vancouver, BC)로 처리되었습니다. 처리된 샘플은 Lympholyte-H(인간) 세포 분리 배지(Cedarlane, Burlington, ON)에 오버레이하고 50ml SepMate 튜브(STEMCELL Technologies)에서 800g에서 20분 동안 밀도 원심분리에 의해 처리되었습니다. 농축된 단핵구를 함유하는 버피코트를 분리하고 PBS + 10mM EDTA + 2% FBS로 2회 세척한 후, 단핵구를 1× 10에서 RPMI + 10% FBS에 재현탁시켰다6 세포/ml. 단핵구 집단은 유세포 분석에 의한 CD14 염색에 의해 결정된 바와 같이 순수도가 >95%였습니다.

박테리아 균주 및 배양 조건

이 연구에서는 Salmonella enterica serovar Typhimurium(S. typhimurium) 균주 SL1344를 사용했습니다. S. typhimurium은 단일 콜로니를 위해 냉동 된 스톡에서 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 37 ° C에서 밤새 성장시켰다. 고정상 세포의 경우, 단일 콜로니를 사용하여 3ml의 예열된 LB 육수를 접종하고 37°C에서 16시간 동안 회전식 셰이커에서 성장시켰습니다. 지수상 세포의 경우, 16시간 배양 0.75ml를 24.25ml의 예열된 LB-Miller 배지에 첨가하고, 전술한 바와 같이, 세포를 회전식 쉐이커(200rpm)에서 37°C에서 3.5시간 동안 성장시켰다33. 적절한 성장 단계에 도달하면, S. 티피무리움 배양액을 PBS로 희석하여 10× 1로 희석하였다8 cells/ml 및 5% CO에서 37°C에서 30분(지수기) 또는 60분(고정상) 동안 10의 감염 다중성(MOI)에서 PMA-THP-1 세포를 감염시키는 데 사용됩니다.2.

겐타마이신 보호 분석

세균 감염 후 겐타마이신(20μg/ml; BioShop Canada Inc.) 세포외 S. typhimurium을 죽이기 위해 30분 동안 혼합 배양액에 첨가하였다. 이어서, 배양 상층액을 제거하고, PBS에서 0.1% v/v Triton X-100 + 0.01% w/v SDS로 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 PBS에서 연속적으로 희석하고 LB 한천에 도배하여 내재화된 S. 티피무리움의 총 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정했습니다. 수정된 겐타마이신 보호 분석을 사용하여 시간이 지남에 따라 생존한 내재화된 S. 티피무리움을 정량화했습니다. 감염 및 겐타마이신 처리 후, 배양 상층액을 제거하고 20μg/ml의 겐타마이신이 보충된 예열된 RPMI 1640 + 10% FBS를 각 웰에 첨가하였다. 상층액의 사이토카인 생산 분석과 PMA-THP-1 세포 용해 및 S. 티피무리움 정량을 위해 세포를 최대 12시간 동안 배양했습니다.

엘리사

사이토카인 발현은 인간 IL-12p40, TNF-α 및 IL-6에 대한 제조업체의 지침에 따라 cell-free 상층액에서 정량화되었습니다(Thermo Fisher Scientific Invitrogen eBioscience, Carlsbad, CA). 흡광도는 450nm에서 ELx800 마이크로플레이트 리더(BioTek, Winooski, VT)로 측정하였다. 데이터는 최소 3개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± S.D.를 대표합니다.

면역블로팅(Immunoblotting)

세포 펠릿을 용해 완충액(1M HEPES, 0.5M NaF, 0.5M EGTA, 2.5M NaCl, 1M MgCl)으로 용해시켰다2, 10% 글리어콜, 1% 트리톤 X-100)과 PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제(스위스 바젤 로슈). 단백질 농도는 Bradford 분석(Sigma-Aldrich)으로 측정하였다. 샘플(10μg 단백질)을 Tris-HCl 완충액에서 10% 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE에서 분리한 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 옮겼습니다. 막은 2.5% 소 혈청 알부민(BSA; BioShop Canada Inc.) 0.1% 트윈이 포함된 트리스 완충 식염수(TBS)(BioShop Canada Inc.) (TBST) 2시간 동안. 이어서 2.5% BSA(BioShop Canada Inc.)에서 항-인산-NF-κBp65 (1:1000) (New England Biolabs, Whitby, ON) 및 항-pan-NF-κBp65 (1:300) (Santa Cruz Biotechnologies, Dallas, TX)로 멤브레인을 조사하고, 2.5% BSA(BioShop Canada Inc.)에서 마우스 항-토끼 IgG-HRP 2차 항체(1:10,000)를 조사하였다. 이미징을 위해 HD2 이미징 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Alpha Innotech HD2 이미저에서 Clarity ECL(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 면역블롯을 시각화했습니다. 전체 멤브레인 이미지가 제공됩니다(보충 그림 1).

SEAP QUANTI-Blue™ 어세이

NF-κB/AP-1 유도성 분비 배아 알칼리성 인산가수분해효소(SEAP)는 제조업체의 지침에 따라 측정되었습니다. 간단히 말해서, THP-1 XBlue 세포는 2 × 10에서 도말하였다5 cells/ml 및 배지, IL-27, LPS-E, LPS-S 및/또는 편모의 조합으로 37°C에서 5% CO로 24시간 동안 자극2. SEAP 생산은 20μl의 cell-free 상층액과 180μl QUANTI-Blue™ 완충액(InvivoGen)을 결합하여 정량화하고 37°C에서 4시간 동안 배양했습니다. 광학 밀도는 Varioskan 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, Hampton, NH)에서 650nm로 측정되었습니다.

유세포 분석

표면 염색을 위해 세포를 FACS 완충액(PBS + 0.01% 아지드화나트륨 + 2% FBS)에 재현탁시키고 항인간 TLR4 AlexaFluor488(Thermo Fisher Scientific Invitrogen eBioscience) 및 항인간 TLR5 AlexaFluor647(R&D Systems)로 배양했습니다. 세포 사멸률은 프로피듐 요오드화물(Sigma-Aldrich)을 사용하여 정량화하였다. 데이터는 Epics XL-MCL 또는 CytoFLEX 유세포 분석기(Beckman Coulter, Pasadena, CA)로 수집하고 FlowJo 소프트웨어, 버전 X 10.0.7r2를 사용하여 분석했습니다.

통계 분석

통계적 유의성은 지정된 쌍 간의 Mann Whitney U 검정을 사용하여 결정되었습니다. 그림에서. 그룹 간 비교를 위해 5B–D, 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 검정이 사용되었습니다.

데이터 가용성 선언문

현재 연구 중에 생성 및/또는 분석된 모든 데이터는 요청 시 교신 저자로부터 제공됩니다.

참조

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승인

이 연구는 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(KG: 342168; NLM: 184228)를 참조하십시오. CP는 온타리오 대학원 장학금, Robert John Wilson 박사 대학원 펠로우십 및 NSERC-PGS D 상의 지원을 받았습니다. NO는 NSERC-CGS M 어워드의 지원을 받았습니다.

작성자 정보

저자 및 소속

1. 캐나다 온타리오주 킹스턴에 있는 퀸즈 대학교 생물의학 및 분자 과학과 K7L 3N6

   C. Petes, N. Odoardi, S. M. Plater, N. L. Martin & K. Gee

기여

C.P. 및 N.O.는 도 1-4 및 도 6A-D.에 대한 실험을 수행 및 분석하였고, S.P.는 도 5 및 도 6E 및 F에 대하여 전체 박테리아 실험을 수행 및 분석하였다. 모든 저자는 연구를 설계하고 원고를 작성하고 검토했습니다.

교신저자

K. Gee에게 보낸 서신.

윤리 선언

Competing Interests

The authors declare no competing interests.

Additional information

Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

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Petes, C., Odoardi, N., Plater, S.M. et al. IL-27 amplifies cytokine responses to Gram-negative bacterial products and Salmonella typhimurium infection. Sci Rep 8, 13704 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-32007-y

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• Received23 February 2018

• Accepted29 August 2018

• Published12 September 2018

• DOIhttps://doi.org/10.1038/s41598-018-32007-y

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Keywords

• Flagellin
• Immunoregulatory Cytokine Interleukin
• Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase (SEAP)
• BioShop Canada
• TLR4 Expression‎

Subjects

• Bacterial host response
• Inflammation
• Interleukins
• Monocytes and macrophages
• Toll-like receptors

This article is cited by

• Genomic patterns of homozygosity and inbreeding depression in Murciano-Granadina goats
  • María Gracia Luigi-Sierra
  • Almudena Fernández
  • Marcel Amills

  Journal of Animal Science and Biotechnology (2022)

• Insights into inflammasome regulation: cellular, molecular, and pathogenic control of inflammasome activation
  • Naveen Challagundla
  • Bhaskar Saha
  • Reena Agrawal-Rajput

  Immunologic Research (2022)

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