Re: 발효 산물이 면역세포에 미치는 영향 2013 nature

[문형철]

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Fermentation products: immunological effects on human and animal models

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• Integrated Mechanism Review
• Published: 13 May 2013

Fermentation products: immunological effects on human and animal models

• Audrey Granier, 
• Olivier Goulet & 
• Cyrille Hoarau 

Pediatric Research volume 74, pages238–244 (2013)Cite this article

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Abstract

Infant formulas have been shown to influence the development of the gut microbiota. Besides the probiotic- and prebiotic-containing formulas, fermented milk–based infant formulas offer an additional means for modulation of gut immunity and/or gut microbiota. These formulas are produced by the fermentation of cow’s milk with specific lactic acid bacteria strains, followed by heat treatment; they do not contain viable bacteria or added prebiotic oligosaccharides but contain specific products resulting from the fermentation process. This review is focused on the effects of fermentation products, distinguishing them from those of living bacteria and prebiotic compounds on the immune system. Besides the possible modulation of gut microbiota composition, in vitro and in vivo studies suggest that specific fermentation products can actively participate in the establishment of immune balance and oral tolerance. Although further research is needed to confirm‎ the clinical benefits observed in infants to better characterize the active fermentation compounds and to delineate the involved pathways, these fermented formulas appear to deserve interest.

유아용 조제 분유는 장내 미생물총의 발달에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 함유된 조제 분유 외에도, 발효유 기반 유아용 조제 분유는 장 면역 및/또는 장내 미생물총을 조절하는 추가적인 수단을 제공합니다. 이러한 조제 분유는 특정 유산균을 첨가하여 우유를 발효시킨 후 열처리하여 생산됩니다.

이 조제 분유에는

생존 가능한 박테리아나 추가된 프리바이오틱 올리고당이 포함되어 있지 않지만,

발효 과정에서 생성된 특정 제품이 포함되어 있습니다.

이 리뷰는

발효 산물이 살아있는 박테리아와 프리바이오틱 화합물로부터 생성되는 것과 비교하여

면역 체계에 미치는 영향에 초점을 맞추고 있습니다.

장내 미생물 군집의 구성에 영향을 미칠 수 있다는 것 외에도,

체외 및 체내 연구에 따르면 특정 발효 산물이

면역 균형과 구강 내성 형성에 적극적으로 관여할 수 있다고 합니다.

활성 발효 화합물을

더 잘 특성화하고 관련된 경로를 설명하기 위해

영아에게서 관찰된 임상적 이점을 확인하기 위한 추가 연구가 필요하지만,

이러한 발효 포뮬라는 관심을 가질 만한 가치가 있는 것으로 보입니다.

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Main

Exclusive breast feeding is recommended for feeding infants from birth to 6 mo (1). Human milk provides protection against infectious diarrhea, especially rotavirus-related diarrhea, and against upper respiratory tract infections (2). Moreover, maternal milk promotes the development of a bifidobacteria-dominant intestinal microbiota. This microbiota, progressively augmented during the first weeks of life (3), is crucial in the development of the gut immune system (4) and results in protective effects against enteric pathogens and possibly against allergic diseases (5).

Conventional infant formulas have been shown to influence the development of the intestinal microbiota (6). In breast-fed infants, bifidobacteria become dominant, whereas in most standard formula–fed infants, similar amounts of Bacteroides and Bifidobacterium (~40% each) are found. The fecal microbiota from breast-fed infants contains Lactobacillus and Streptococcus, whereas stools from formula-fed infants often contain Staphylococcus, Escherichia coli, and Clostridia (6). Developing infant formulas that modulate the infant intestinal microbiota in promoting the development of bifidobacteria appears to be a relevant approach.

Both probiotic- and prebiotic-containing formulas have been shown to have bifidogenic effects (7,8). Probiotics are “live microorganisms, which when administered in adequate amounts confer a health benefit to the host” (9). Prebiotics are nondigestible food ingredients that selectively stimulate the growth and/or activity of one or a limited number of bacteria in the gut microbiota that confer health benefits to the host (10). The clinical effects of probiotic- or prebiotic-containing infant formulas on the incidence and/or severity of gastrointestinal disorders and early childhood–onset allergic diseases have been reviewed elsewhere (11,12).

Fermented milk–based infant formulas (FMBIFs) are produced by the fermentation of formula based on cow’s milk with lactic acid–producing bacteria (LAB) (13), followed by heat treatment to kill viable bacteria after fermentation. These formulas do not contain the live bacteria that are present in probiotic-based infant formula, nor added (prebiotic) oligosaccharides; instead, they contain products resulting from the fermentation process, the properties of which might offer specific means to interact with the intestinal mucosa. An FMBIF based on the fermentation of cow’s milk by Bifidobacterium breve and Streptococcus thermophilus has been reported to have beneficial effects in infants. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial aimed to determine whether the size of the intestinal bifidobacterial flora can influence the immune response to poliovirus vaccination in infants (14). This study involved 30 infants, although 20 completed the study. From birth to 4 mo, 11 infants were fed FMBIF fermented from S. thermophilus and B. breve and 9 infants received a standard formula. Bifidobacteria were quantified monthly in infant stools. Anti-poliovirus IgA response to Pentacoq (Pasteur Mérieux Serums and Vaccines, Lyon, France; acellular pertussis, diphtheria, Haemophilus-adsorbed influenza type b conjugate, inactivated poliomyelitis, and tetanus) was assessed before and 1 mo after the second injection. Results indicate that the fecal bifidobacterial level was significantly higher (P < 0.04) in the FMBIF group at 4 mo of age. Anti-poliovirus IgA titers increased after Pentacoq vaccination, but the rise was significantly higher (P < 0.02) in the FMBIF-fed group. Antibody titers correlated with bifidobacteria, especially with B. longum infantis and B. breve levels (P < 0.002). Infants who harbored B. longum infantis also exhibited high levels of anti-poliovirus IgA (P < 0.002). This study showed that anti-poliovirus response can be enhanced by an FMBIF that is able to favor intestinal bifidobacteria. Another randomized, double-blind, placebo-controlled trial (15) confirmed the interest in FMBIFs by demonstrating the upregulation of fecal secretory IgA. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial studied the effects of an FMBIF with B. breve C50 and S. thermophilus 065 on thymus size and stool pH of healthy term infants (16). A total of 90 term neonates were separated into three different groups: 30 newborns were exclusively breast-fed, and the remaining 60 were randomly assigned to receive either an FMBIF or a standard formula. Eval‎uations were performed on the third day of life and on the first, second, third, and fourth months of life. Thymus sizes and thymus indexes were measured by using ultrasound examinations, and measurements of stool pH, an indicator of gut flora functionality, were done at the same time. The difference in thymus indexes was statistically significant over repeated measurements among the groups. The FMBIF infants had similar thymus indexes as the breast-fed infants. The fecal pH of the breast-fed group was lower than the standard formula group (P < 0.05), whereas it was similar to that of the FMBIF group on the third postnatal day, persisting for the entire 4 mo of the study.

The randomized controlled trial performed by Thibault et al. (17) assessed the clinical effects of an FMBIF fermented formula on the incidence of acute diarrhea and its severity in healthy infants. This study involved 971 infants aged 4 to 6 mo over a period of 5 mo. They consumed daily either an FMBIF fermented with B. breve C50 and S. thermophilus 065 (n = 464) or a standard infant formula of the same nutritional composition (n = 449). The number and duration of acute diarrhea episodes were recorded, and the severity of the episodes was eval‎uated by the number of hospital admissions, the incidence of dehydration, the number of medical consultations, the number of oral rehydration solution prescriptions, and the number of formula changes. Incidence, duration of diarrheal episodes, and number of hospital admissions did not differ significantly among the groups. However, episodes were less severe in the FMBIF group because there were fewer cases of dehydration 2.5 vs. 6.1% (P = 0.01), fewer medical consultations (46 vs. 56.6%, P = 0.003), fewer oral rehydration solute prescriptions 41.9 vs. 51.9% (P = 0.003), and fewer changes to other formulas (59.5 vs. 74.9%, P = 0.0001).

For allergy, the impact of an FMBIF was tested on the incidence of allergy-like events in 129 children at high risk of atopy, in a multicenter, randomized, double-blind, controlled study (18). Infants received an FMBIF or a standard formula from birth until 1 y of age, and were followed at 4, 12, and 24 mo. Skin prick tests for six foods and six aeroallergens were systematically performed. In case of potentially allergic adverse events, allergy could be further tested by skin prick tests, patch tests, and quantification of specific IgEs. If cow’s milk allergy was suspected, an oral challenge could also be performed. The use of FMBIF milk did not alter the proportion of cow’s milk allergy, but decreased the proportion of positive skin prick tests to cow’s milk (1.7 vs. 12.5%, P = 0.03), and the incidence of digestive (39 vs. 63%, P = 0.01), and respiratory potentially allergic events (7 vs. 21%, P = 0.03 at 12 mo).

Although such FMBIFs are currently available to an increasing number of infants, the preclinical data regarding the mechanisms elicited by fermentation products have not been reviewed until now. This review thus aims to emphasize the basic concept of fermentation and the effect of fermentation products on gut microbiota and immune function.

주요 내용

출생부터 6개월(1)까지의 유아에게 모유 수유를 독점적으로 하는 것이 좋습니다. 모유는 감염성 설사, 특히 로타바이러스 관련 설사와 상기도 감염(2)을 예방하는 데 도움이 됩니다. 또한, 모유는 비피더스균이 우세한 장내 미생물총의 발달을 촉진합니다. 이 미생물 군집은 생후 첫 주(3)에 점차적으로 증가하며, 장 면역 체계(4)의 발달에 매우 중요하며, 장내 병원균과 알레르기 질환(5)에 대한 보호 효과를 가져옵니다.

기존의 유아용 조제 분유는 장내 미생물 군집의 발달에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(6). 모유 수유 유아의 경우 비피더스균이 우세하게 나타나지만, 대부분의 표준 조제 분유를 먹는 유아의 경우 박테로이드와 비피더스균이 비슷한 양(각각 ~40%)으로 발견됩니다. 모유 수유 유아의 대변 미생물 군집에는 락토바실러스와 스트렙토코커스가 포함되어 있는 반면, 조제 분유를 먹는 유아의 대변에는 포도상구균, 대장균, 클로스트리듐이 포함되어 있는 경우가 많습니다(6). 유아용 분유를 개발하는 것은 유아 장내 미생물총의 발달을 촉진하여 비피더스균의 발달을 촉진하는 것과 관련이 있는 것으로 보입니다.

프로바이오틱스와 프리바이오틱스를 모두 함유한 분유는 비피더스균의 생성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(7,8). 프로바이오틱스는 “적절한 양으로 투여할 경우 숙주에게 건강상의 이점을 제공하는 살아있는 미생물”입니다(9). 프리바이오틱스는 소화되지 않는 식품 성분으로, 장내 미생물 군집에 있는 하나 또는 제한된 수의 박테리아의 성장과/또는 활동을 선택적으로 자극하여 숙주에게 건강상의 이점을 부여합니다(10). 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱스가 함유된 유아용 조제 분유가 위장 장애 및 유아기 발병 알레르기 질환의 발생률 및/또는 심각도에 미치는 임상적 효과는 다른 곳에서 검토되었습니다(11,12).

발효유 기반 유아용 조제분유(FMBIF)는 젖소의 우유를 원료로 유산균(LAB)을 배양하여 발효시킨 후, 발효 후 생존 가능한 박테리아를 죽이기 위해 가열 처리하여 생산됩니다(13). 이 포뮬러에는 프로바이오틱스 기반 유아용 조제 분유에 존재하는 살아있는 박테리아나 추가된(프리바이오틱스) 올리고당이 포함되어 있지 않습니다. 대신, 발효 과정을 통해 생성된 제품이 포함되어 있으며, 그 특성은 장 점막과 상호 작용하는 특정 수단을 제공할 수 있습니다. 비피도박테리움 브레베와 스트렙토코쿠스 써모필러스에 의한 우유 발효에 기반한 FMBIF가 유아에게 유익한 효과가 있는 것으로 보고되었습니다. 무작위, 이중맹검, 위약대조 시험을 통해 유아의 장내 비피더스균의 크기가 유아의 소아마비 백신 접종에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있는지 확인하고자 했습니다(14). 이 연구에는 30명의 유아가 참여했지만, 20명이 연구를 완료했습니다. 출생부터 4개월까지 11명의 유아에게 S. thermophilus와 B. breve로 발효시킨 FMBIF를 먹였고, 9명의 유아에게는 표준 분유를 먹였습니다. 유아의 대변에서 비피더스균을 매달 정량화했습니다. 펜타코크(프랑스 리옹에 위치한 파스퇴르 메리외 세럼 앤 백신, 비세포성 백일해, 디프테리아, 헤모필루스-흡착형 b형 인플루엔자 복합체, 불활성화 소아마비, 파상풍)에 대한 소아마비 항체 IgA 반응을 두 번째 주사 전과 1개월 후에 평가했습니다. 결과에 따르면, 생후 4개월에 FMBIF 그룹의 대변 내 비피더스균 수치가 유의미하게 더 높았습니다(P < 0.04). 소아마비 항체인 IgA 역가는 펜타코크 백신 접종 후에 증가했지만, FMBIF를 먹인 그룹에서 증가폭이 유의미하게 더 높았습니다(P < 0.02). 항체 역가는 비피더스균, 특히 B. longum infantis와 B. breve 수준과 상관관계가 있었습니다(P < 0.002). B. longum infantis를 보유한 유아들도 높은 수준의 항폴리오바이러스 IgA를 나타냈습니다(P < 0.002). 이 연구는 장내 비피더스균을 선호하는 FMBIF가 항폴리오바이러스 반응을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다. 또 다른 무작위, 이중맹검, 위약대조 시험(15)은 분변 분비형 IgA의 상향 조절을 입증함으로써 FMBIF에 대한 관심을 확인했습니다. 무작위, 이중맹검, 위약대조 시험은 건강한 만삭아의 흉선 크기 및 대변 pH에 대한 B. breve C50과 S. thermophilus 065를 이용한 FMBIF의 효과를 연구했습니다(16). 총 90명의 신생아를 세 그룹으로 나누어, 30명은 모유만 먹이고, 나머지 60명은 FMBIF 또는 표준 분유를 무작위로 먹였습니다. 생후 3일째와 생후 1, 2, 3, 4개월째에 평가를 실시했습니다. 흉선 크기와 흉선 지수는 초음파 검사를 통해 측정되었고, 장내 세균총 기능의 지표인 대변 pH 측정도 동시에 이루어졌습니다. 흉선 지수의 차이는 그룹 간 반복 측정에서 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다. FMBIF 유아의 흉선 지수는 모유 수유 유아의 흉선 지수와 비슷했습니다. 모유 수유 그룹의 대변 pH는 표준 분유 그룹보다 낮았지만(P < 0.05), 3일째에는 FMBIF 그룹과 비슷해졌으며, 연구 기간 내내 4개월 동안 지속되었습니다.

Thibault et al.(17)이 수행한 무작위 대조 시험에서는 건강한 유아의 급성 설사 발생률과 그 심각도에 대한 FMBIF 발효 분유의 임상 효과를 평가했습니다. 이 연구는 5개월 동안 4~6개월의 유아 971명을 대상으로 진행되었습니다. 그들은 매일 B. breve C50과 S. thermophilus 065로 발효된 FMBIF(n = 464) 또는 동일한 영양 성분의 표준 유아 조제 분유(n = 449)를 섭취했습니다. 급성 설사 발병 횟수와 기간을 기록하고, 입원 횟수, 탈수 발생률, 진료 횟수, 경구용 수분 보충제 처방 횟수, 분유 변경 횟수 등을 통해 설사 발병의 심각성을 평가했습니다. 설사 발병 횟수, 기간, 입원 횟수는 그룹 간에 큰 차이가 없었습니다. 그러나, FMBIF 그룹의 경우 탈수증의 발생률이 2.5% 대 6.1%로 낮았고(P = 0.01), 의료 상담의 빈도도 46% 대 56.6%로 낮았으며(P = 0.003), 경구용 수분 보충제 처방 빈도도 41.9% 대 51. 9% (P = 0.003), 그리고 다른 공식에 대한 변경이 적었습니다 (59.5% vs. 74.9%, P = 0.0001).

알레르기의 경우, 아토피 위험이 높은 129명의 어린이를 대상으로 다기관, 무작위, 이중맹검, 대조군 연구(18)에서 FMBIF의 알레르기 유사 사건 발생률에 대한 영향을 테스트했습니다. 유아들은 출생부터 1세까지 FMBIF 또는 표준 분유를 섭취했고, 4, 12, 24개월에 추적 검사를 받았습니다. 6가지 식품과 6가지 공기 중 알레르기 유발 물질에 대한 피부 단자 검사를 체계적으로 실시했습니다. 알레르기 부작용이 발생할 가능성이 있는 경우, 피부 단자 검사, 패치 검사, 특정 IgE의 정량화를 통해 알레르기를 추가로 검사할 수 있습니다. 젖소 알레르기가 의심되는 경우, 경구 과민 반응 검사를 실시할 수도 있습니다. FMBIF 우유를 사용해도 젖소 알레르기의 비율은 변하지 않았지만, 젖소에 대한 피부 단자 검사 양성 반응의 비율은 감소했습니다(1.7% vs. 12. 5%, P = 0.03), 소화기(39 vs. 63%, P = 0.01), 호흡기 잠재적 알레르기성 사건(12개월 시점 7 vs. 21%, P = 0.03)의 발생률.

이러한 FMBIF가 현재 점점 더 많은 유아들에게 제공되고 있지만, 발효 산물에 의해 유발되는 메커니즘에 관한 전임상 데이터는 지금까지 검토되지 않았습니다. 따라서 이 리뷰는 발효의 기본 개념과 장내 미생물군과 면역 기능에 대한 발효 산물의 효과를 강조하는 것을 목표로 합니다.

What Are Fermented Products?

Fermentation has been used since ancient times, primarily to enhance food preservation, and to aid development of specific foods and beverages. Besides these technological advantages, fermentation processes increase the nutritional interest of numerous foods and enhance bioavailability of nutrients. These links between fermentation, nutrition, and health have been popularized with products such as fermented milks. Yogurt, the most documented example, is defined as a coagulated milk product that results from fermentation of lactose, the milk sugar, into lactic acid by Lactobacillus bulgaricus and S. thermophilus. The transformation of lactose into lactic acid is the most significant phenomenon, but fermented milks also contain a wide range of potentially active components, still not comprehensively characterized. Triglyceride lipolysis is negligible because of the absence of lipase in LAB, but the weak proteolytic activity of LAB determines the lysis of 1 to 2% of the casein and liberation of amino acids and peptides (19). In parallel, bacterial enzymes can metabolize milk carbohydrates into a wide variety of oligosaccharides, some of which have prebiotic properties (20). FMBIFs also contain several types of growth factors and hormones and a range of components originating from the LAB themselves, from the cell walls (peptidoglycans, lipoteichoic acid), or from the cytoplasmic content (bacterial DNA) (21). These compounds, usually present in small amounts, are thought to exhibit specific properties, mostly in the area of immunostimulation (21). Some fermentation products are metabolized by the microorganisms that have produced them, whereas others accumulate in the FMBIF and may exhibit functional properties (22).

Whereas lactic acid production is a feature common to all LAB, the production of other compounds depends on the bacterial strains and on the conditions of the fermentation process, including the medium that is fermented. The LAB strains most often used to ferment milk are S. thermophilus, usually in association with bifidobacteria, such as B. breve C50, B. lactis-longum, and B. animalis, or with lactobacilli such as L. acidophilus, L. rhamnosus, L. johnsonii, and L. casei. These different species produce different fermentation products, which may help to explain the different results sometimes encountered.

In most fermented milk, the LAB remain alive in the product and may transiently interact with endogenous intestinal microbiota and with the cells of the intestinal wall. These products may also contain fermentation products, but they are not usually considered relevant because the health benefit is supposed to be given by the living bacteria, and no attempt is made to optimize the fermentation products. This is not the case in FMBIFs in which fermentation conditions are specifically designed, via the choice of the LAB strains and a thorough control of technological processes (23).

Because of the variety of strains and complexity of the fermentation substrate, the exact composition and molecular structure of fermentation products are not exhaustively known. Molecular identification of compounds should be a research objective in this new area because identification is necessary for a detailed understanding of the effects and ultimately for their maximization. One of the most studied heat-treated fermented formulas is obtained in a two-step fermentation; the S. thermophilus 065 strain, selected for its high β-galactosidase production, ferments a lactose solution and produces galacto-oligosaccharides by transgalactosylation of lactose, with ~30% of newly produced di-, tri-, and tetrasaccharides (24). A separate fermentation of cow’s milk by B. breve C50 leads to a specific carbohydrate pattern, different from the one obtained with other B. breve strains; the fermented milk also contains specific peptides (European patent 1615657, Gervais-Danone, Leval‎lois Perret, France). Both fermented substrates are then mixed and heat treated.

With such a process, FMBIF contains fermentation products but also whole dead cells and fragments of heat-inactivated LAB, which may elicit effects on gut mucosa or microbiota. This is why, in preclinical studies investigating the mechanisms and components involved, the FMBIFs are submitted to further ultracentrifugation and ultrafiltration to specifically study products that are between 100 and 300 kDa, the expected molecular range of fermentation products.

발효 제품이란 무엇인가?

발효는 고대부터 주로 식품 보존을 강화하고 특정 식품과 음료의 개발을 돕기 위해 사용되어 왔습니다. 이러한 기술적 이점 외에도 발효 과정은 수많은 식품의 영양적 가치를 높이고 영양소의 생체 이용률을 향상시킵니다. 발효, 영양, 건강 사이의 이러한 연관성은 발효유와 같은 제품으로 대중화되었습니다.

가장 잘 알려진 예인 요구르트는

락토바실러스 불가리쿠스와 S. 테르모필러스에 의해 유당(우유당)이

젖산으로 발효되어 생성되는 응고된 우유 제품으로 정의됩니다.

유당이

젖산으로 변하는 것이 가장 중요한 현상이지만,

발효유에는 아직 완전히 밝혀지지 않은

다양한 잠재적 활성 성분이 포함되어 있습니다.

트리글리세라이드 지방분해는

락토바실러스에 리파아제가 없기 때문에 무시할 수 있지만,

락토바실러스의 약한 단백질 분해 활성은

카제인의 1~2%를 용해시키고 아미노산과 펩타이드를 방출하도록 결정합니다(19).

이와 동시에,

세균성 효소는 우유의 탄수화물을 다양한 종류의 올리고당으로 대사할 수 있으며,

그 중 일부는 프리바이오틱 특성을 가지고 있습니다(20).

FMBIF에는 여러 종류의 성장 인자와 호르몬, 그리고 세포벽(펩티도글리칸, 리포테이코산), 세포질 성분(박테리아 DNA) 등 LAB 자체에서 유래된 다양한 성분도 포함되어 있습니다(21). 이러한 화합물은 보통 소량으로 존재하며, 주로 면역 자극 영역에서 특정한 특성을 나타내는 것으로 여겨집니다(21). 발효 산물의 일부는 그것을 생성한 미생물에 의해 대사되지만, 다른 일부는 FMBIF에 축적되어 기능적 특성을 나타낼 수 있습니다(22).

젖산 생성은 모든 LAB에 공통된 특징인 반면, 다른 화합물의 생성은 발효되는 배지 등 발효 과정의 조건과 세균 균주에 따라 달라집니다. 우유를 발효시키는 데 가장 많이 사용되는 LAB 균주는 S. thermophilus이며, 보통 B. breve C50, B. lactis-longum, B. animalis와 같은 비피도박테리아 또는 L. acidophilus, L. rhamnosus, L. johnsonii, L. casei와 같은 락토바실러스와 함께 사용됩니다. 이 다양한 종은 서로 다른 발효 산물을 생산하기 때문에 때때로 다른 결과가 나타나는 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

대부분의 발효유 제품에서 락토바실러스는 제품 내에 살아 있는 상태로 남아 있으며, 일시적으로 장내 미생물군과 장벽 세포와 상호 작용할 수 있습니다. 이러한 제품에는 발효 산물이 포함되어 있을 수도 있지만, 일반적으로 관련성이 있는 것으로 간주되지 않습니다. 건강상의 이점은 살아 있는 박테리아에 의해 제공되는 것으로 간주되기 때문에 발효 산물을 최적화하려는 시도가 이루어지지 않습니다. 발효 조건이 특별히 설계된 FMBIF의 경우에는 그렇지 않습니다. 이는 LAB 균주의 선택과 기술적 과정의 철저한 통제를 통해 가능합니다(23).

다양한 균주와 발효 기질의 복잡성 때문에 발효 산물의 정확한 구성과 분자 구조가 완전히 밝혀지지 않았습니다. 분자 수준의 화합물 식별은 이 새로운 영역에서 연구의 목표가 되어야 합니다. 식별은 그 효과를 상세히 이해하고 궁극적으로 그 효과를 극대화하는 데 필요하기 때문입니다. 가장 많이 연구된 열처리 발효 포뮬러 중 하나는 2단계 발효를 통해 얻어집니다. β-갈락토시다아제 생산량이 높은 것으로 선택된 S. thermophilus 065 균주는 락토오스 용액을 발효시키고, 락토오스의 트랜스갈락토실화 반응을 통해 갈락토올리고당을 생산하며, 새로 생산된 디-, 트리-, 테트라-당류는 약 30%를 차지합니다(24). B. breve C50에 의한 우유의 개별 발효는 다른 B. breve 균주에서 얻은 것과는 다른 특정 탄수화물 패턴을 생성합니다. 발효된 우유에는 특정 펩타이드도 포함되어 있습니다(유럽 특허 1615657, Gervais-Danone, Leval‎lois Perret, 프랑스). 그런 다음 두 가지 발효된 기질을 혼합하고 열처리합니다.

이러한 과정을 거치면 FMBIF는 발효 산물을 포함할 뿐만 아니라 장 점막이나 미생물 군집에 영향을 미칠 수 있는 열 불활성화 LAB의 전체 사멸 세포와 파편도 포함하게 됩니다. 이것이 바로 관련 메커니즘과 구성 요소를 조사하는 전임상 연구에서 FMBIF를 추가적인 초원심분리 및 한외여과에 적용하여 발효 산물의 예상 분자 범위인 100~300kDa 사이의 제품을 구체적으로 연구하는 이유입니다.

Fermentation Products are Modulators of the Intestinal Microbiota

The effects of the products issued from LAB fermentation on the composition of the intestinal microbiota have been studied in healthy adults who, for 1 wk, received either a cell-free concentrated whey from B. breve C50–fermented milk (whey group) or a diluted milk (control group) (25). The total counts of bifidobacteria were higher in the feces of the whey group as compared with control group. Because the gut microbiota of healthy adults is known to be quite stable for a given subject, these results suggest that the components produced during fermentation have a strong potential to modulate the composition of the gut microbiota. Similar results have been obtained in human adults fed an oligosaccharide obtained from lactose fermented by B. bifidum NCIMB 41171, confirm‎ing that LAB can be used to produce prebiotic compounds (26).

Studies have compared gut microbiota composition and metabolism during the colonization period between newborn infants receiving from birth either a standard non-fermented formula or FMBIF (14). Feces were sampled monthly for 4 mo and infants fed the fermented formula had a higher mean proportion of bifidobacteria with fewer adult-like species. These infants were more frequently colonized by B. longum infantis and B. breve, species mostly encountered during breast feeding and associated to an enhanced barrier function and immune priming (27). Indeed, adequate maturation of the infant immune system is known to be connected to gut colonization by microbiota (28) and especially to some specific Bifidobacterium species, including the ones found in breast-fed infants (29).

발효 제품은 장내 미생물 군집의 조절자입니다.

LAB 발효로 생산된 제품의 장내 미생물 군집 구성에 미치는 영향은 건강한 성인을 대상으로 1주 동안 B. breve C50 발효 우유(유청 그룹) 또는 희석 우유(대조군)에서 유청을 분리하지 않은 농축 유청을 섭취한 경우를 비교하여 연구되었습니다(25). 대조군에 비해 유청 그룹의 대변에서 비피더스균의 총 수가 더 많았습니다. 건강한 성인의 장내 미생물 군집은 주어진 대상에 대해 상당히 안정적이라는 것이 알려져 있기 때문에, 이 결과는 발효 과정에서 생성된 성분이 장내 미생물 군집의 구성을 조절할 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있음을 시사합니다. B. bifidum NCIMB 41171에 의해 발효된 유당에서 얻은 올리고당을 섭취한 성인에게서도 유사한 결과가 얻어졌으며, 이는 LAB가 프리바이오틱 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있음을 확인시켜 줍니다(26).

연구에 따르면, 표준 비발효 분유를 섭취하는 신생아와 FMBIF(14)를 섭취하는 신생아의 장내 미생물 구성과 식민지화 기간 동안의 신진대사를 비교했습니다. 4개월 동안 매달 대변 샘플을 채취한 결과, 발효 분유를 섭취한 신생아의 비피더스균 비율이 더 높았고, 성인형 종의 비율이 더 낮았습니다. 이 유아들은 B. longum infantis와 B. breve에 의해 더 자주 식민지화되었으며, 이 두 종은 모유 수유 중에 주로 발견되며, 장벽 기능 강화 및 면역 프라이밍과 관련이 있습니다(27). 실제로, 유아 면역 체계의 적절한 성숙은 미생물총에 의한 장내 식민지화(28)와 특히 모유 수유 유아에서 발견되는 종을 포함한 일부 특정 Bifidobacterium 종과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다(29).

Fermentation Products Modulate the Immune System

Live commensal microbiota is essential for the development of the gut’s immune system and for tolerance to food antigens (30,31). The interactions between bacteria and the immune system are only partially understood, as are those induced by specific metabolites produced after the fermentation process. Dendritic cells (DCs) play a key role in this interaction as antigen-presenting cells. These initially immature cells reside in nonlymphoid organs, notably in the gut mucosa, where they capture and process antigens. In the presence of “danger” signals, DCs migrate into the T-cell areas of lymphoid organs and mature to acquire the ability to present antigens to naive T cells and to induce specific immunogenic responses. DCs also have the capacity to induce negative regulation of immune responses, by the generation of regulatory T cells (32).

The balance between “immunogenic” or “tolerogenic” DCs seems to be partially dependent on the DC type, the levels of co-stimulatory molecule expression‎, the cytokine production profile, and the survival capacity of the DCs (33,34). The specific DC functionalities result from the integration of different intracellular signals induced by the microenvironment, particularly from pathogen-associated molecular patterns from specific bacteria (35). To sense the microenvironment, DCs express receptors as Toll-like receptors (TLRs) that recognize pathogen-associated molecular patterns (36). TLR engagement can induce a wide variety of signal transduction pathways, as mitogen-activated protein kinases or phosphatidylinositol 3-kinase, to regulate the nature, magnitude, and duration of the immune responses, and thus the capacity to induce “immunogenic” or “tolerogenic” DCs. The different human TLRs recognize a broad spectrum of specific highly conserved microbial structures. The transduction pathway depends on the bacteria strain and thus on the TLR engaged, which could explain the different effects observed on DC functionality (37). Because of these properties and their capacity to elicit various responses to different stimuli, DCs represent a potential target for fermentation products, through which they can trigger a range of immunomodulatory properties.

발효 제품 면역 체계 조절

살아있는 공생 미생물 군집은 장의 면역 체계 발달과 음식 항원에 대한 내성을 위해 필수적입니다(30,31). 발효 과정 후에 생성되는 특정 대사 산물에 의해 유도되는 것과 마찬가지로, 박테리아와 면역 체계 사이의 상호 작용은 부분적으로만 이해되고 있습니다. 수지상 세포(DCs)는 항원 제시 세포로서 이 상호 작용에서 핵심적인 역할을 합니다. 이 미성숙 세포는 비림프 기관, 특히 장 점막에 존재하며, 그곳에서 항원을 포획하고 처리합니다. “위험” 신호가 있을 때, DC는 림프 기관의 T 세포 영역으로 이동하여 성숙하여, 항원을 미숙 T 세포에 제시하고 특정한 면역 반응을 유도하는 능력을 얻습니다. 또한, DC는 조절 T 세포(32)의 생성을 통해 면역 반응의 부정적 조절을 유도하는 능력도 가지고 있습니다.

면역원성 또는 관용성 DC 사이의 균형은 부분적으로 DC 유형, 공동 자극 분자 발현 수준, 사이토카인 생산 프로필, 그리고 DC의 생존 능력에 따라 달라지는 것으로 보입니다(33,34). 특정 DC 기능은 미세환경에 의해 유도된 다양한 세포 내 신호, 특히 특정 박테리아의 병원체 관련 분자 패턴의 통합으로 인해 발생합니다(35). 미세환경을 감지하기 위해 DC는 병원체 관련 분자 패턴(36)을 인식하는 Toll-like receptors(TLRs)를 수용체로 표현합니다. TLR의 결합은 면역 반응의 성질, 크기, 지속 기간을 조절하기 위해 다양한 신호 전달 경로(mitogen-activated protein kinases 또는 phosphatidylinositol 3-kinase)를 유도할 수 있으며, 따라서 “면역원성” 또는 “관용성” DC를 유도하는 능력을 조절할 수 있습니다. 다양한 인간 TLR은 광범위한 특정 고도로 보존된 미생물 구조를 인식합니다. 전달 경로는 박테리아 균주와 이에 관여하는 TLR에 따라 달라지므로, DC 기능에 대해 관찰되는 다양한 효과를 설명할 수 있습니다(37). 이러한 특성과 다양한 자극에 대한 다양한 반응을 이끌어내는 능력 때문에, DC는 발효 산물의 잠재적 표적이 될 수 있으며, 이를 통해 다양한 면역 조절 특성을 유발할 수 있습니다.

In Vitro Studies

Several studies have shown that bacteria can affect the maturation and cytokine secretion profile of DCs depending on the bacterial strain (38,39). In particular, LAB can interact with monocyte-derived DCs to modulate their properties (32,40,41,42). This effect is probably linked to the bacterial characteristics, including cell wall components, cytoplasmic compounds, and DNA fragments, whereas the natural fermentation process occurring in the gut might produce active components as well. Active bacterial components from B. breve C50 can cross an intestinal monolayer of epithelial cells and modulate cytokine production (43).

Our team has recently studied in vitro the effects of media fermented with different strains of B. breve (A. Granier et al., unpublished data). In these fermented media, bacteria were separated from the supernatant via centrifugation and ultrafiltration. Unlike other strains, the supernatant from B. breve C50 strain culture (BbC50sn) induced maturation ( Figure 1a ) and activation of human DCs ( Figure 1b – e ), but only after fermentation of a milk whey–based medium ( Figure 2 ). BbC50sn induced a specific interleukin-10 (IL-10)-rich cytokine profile ( Figure 1b ) and prolonged DC survival via a TLR2 pathway (44). IL-10 is involved in inducing immune tolerance and controlling the contact duration between DCs and T cells, a key point in this induction that depends on DC survival (45). The antiapoptotic BbC50sn signal surpasses the proapoptotic effect of lipopolysaccharide on DCs. Furthermore, the induction of potential “tolerogenic” DC properties by fermentation products has been confirmed in human DCs treated with BbC50sn, which could induce CD4 and CD8 regulatory T cells.

Figure 1

Phenotype and activation of dendritic cells. (a) Dendritic cell (DC) phenotype. Staining of markers CD80, CD83, CD86, and CD25 was analyzed by cytometry for immature DCs (iDCs) and DCs treated with 50 ng/ml of LPS (LPS-DCs) or with 50 µg/ml of BbC50sn (BbC50sn-DCs). Secretion of (b) IL-12, (c) IL-10, (d) IFN-γ, and (e) IL-6 by iDCs, LPS-DCs, and BbC50sn-DCs, assessed by ELISA. Each point represents a donor, and bars represent means. For statistical data, the Wilcoxon test was used; *P < 0.05. BbC50sn and LPS induced maturation, and IL-10 secretion was higher for BbC50sn-DCs. ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IFN, interferon; IL, interleukin; LPS, lipopolysaccharide.

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Figure 2

Dendritic cell (DC) phenotype analysis by cytometry. CD83, CD86, and HLA-DR were studied on DCs in the presence of (a) casein-hydrolysate in the presence of BbC50, (b) whey hydrolysate fermented by BbC50, or (c) whey hydrolysate without BbC50. The x-axes represent the intensity of fluorescence (IF) and the y-axes the cell counts. Bold histograms represent specific staining of the indicated cell-surface markers, and thin histograms correspond to isotype controls: DC maturation (upregulation of CD83, CD86, and HLA-DR) is observed only when the fermentation process occurs with whey hydrolysate medium. HLA, human histocompatibility leukocyte antigen.

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The maturation process of DCs induced by BbC50sn appears to involve nuclear factor-κB (44) and to differentially activate mitogen-activated protein kinase, glycogen synthase kinase-3, and phosphatidylinositol 3-kinase pathways (46). These results give new insights on the fine-tuned balance inducible by specific fermentation products.

Animal Studies

Several in vivo studies confirm‎ the immunomodulatory properties of fermentation products (47). Infant formula containing fermentation products can alter immune responses: the systemic responses, especially Th1 and IL-10, were increased in ovalbumin-immunized mice fed FMBIF as compared with control mice. The development of oral tolerance was not affected in mice fed FMBIF, whereas the local production of interferon-γ, IL-12p40, and IL-10 was significantly increased (48).

Similarly, nonbacterial fractions of milk fermented by Lactobacillus helveticus, containing specific peptides and oligosaccharides, were shown to modulate mucosal immunity. IgA production was increased in the gut of mice fed the bacteria-free fermented milk product. Cytokine production, particularly IL-10, was affected in mucosal cells (49). In a mouse model, exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens could modulate immune responses (50). Furthermore, in mice infected with Salmonella enterididis, the survival of mice fed with a nonbacterial fraction of fermented milk was enhanced as compared with the control group (51).

In a model of starved mice, the reconstitution of the immune system was studied after renutrition with milk, probiotic fermented milk, or a bacteria-free supernatant of probiotic fermented milk. Probiotic fermented milk and probiotic fermented milk supernatant increased bifidobacteria in the intestinal microbiota and the number of IgA+ cells, macrophages, and, especially in the supernatant, the number of DCs (52)

These results suggest that specific products of fermentation, independently of living bacteria, can modulate mucosal immune responses. These products could induce Th1 or regulatory T cells, and thus could actively participate in the establishment of immune balance and tolerance in infants.

Discussion

The critical role of infant feeding in gut colonization and subsequent maturation of the mucosal immune system is widely recognized, as is the recommendation for breast feeding to reach optimal immune function. When infant formulas are to be used, several options exist that aim at getting closer to the function of human milk in establishing balanced gut immunity and ultimately contributing to prevent allergic or infectious diseases. In addition to probiotic- or prebiotic-containing formulas, fermentation products, whose production involves specific bacterial strains, appear as an additional route. They may act through modulation of the gut microbiota, but also through direct interactions with the mucosal immune system, promoting immune balance by inducing regulatory T cells.

To discuss the advantages that fermentation products could bring in addition to probiotic- or prebiotic-containing infant formulas, one would need direct comparison among the three concepts. Unfortunately, the clinical studies are set up in different ways (i.e., food matrix, infant population, intake duration, and clinical outcomes), making the comparison difficult. Clinical trials in infants have suggested a beneficial role of fermented products in formulas. However, these trials investigate the effects of heat-treated fermented milks that may still contain bacterial fragments, possibly involved in the observed effects (53). High-quality randomized controlled trials are required to distinguish the immune effects of fermentation products from those elicited by bacterial cell walls and to definitely confirm‎ the specific immune-modulatory properties suggested in preclinical experiments. Nevertheless, FMBIFs have specific features that are scientifically and clinically relevant.

FMBIFs do not contain living organisms and are therefore stored easily. In addition, and even though the risk of bacterial translocation appears limited to fragile infant populations, this risk does not exist in FMBIFs. One single clinical trial reported that some newborns consuming a formula containing a high amount of heat-inactivated L. rhamnosus GG exhibited symptoms of gut discomfort (54). In the currently marketed FMBIFs, dead bacterial bodies come from bacterial species that have not been associated with any adverse effects.

Fermentation products do not depend on in vivo fermentation processes, which can vary widely according to subjects and conditions, as may be the case for prebiotic-containing formulas. Probiotics in infant formulas may act via interactions with the mucosa (55), whose nature and magnitude will depend on the nature, number, and physiological status of the LAB strain actually reaching the mucosa. This variability could contribute to the variance in effects, which is sometimes observed in randomized controlled trials with prebiotics or probiotics, and could be reduced when fermented products are directly provided, because their activity will not depend on further steps within the gut. Fermentation products can be controlled through precise monitoring of the technological process, which will ensure reproducibility. However, research should be focused on the molecular characterization of fermentation products and bacterial strains. The target immune cells and the target population should be defined through better insights into the mechanisms involved.

In clinical practice, the beneficial effects of the three types of infant formula (i.e., prebiotic, probiotic, and fermented) may be close or even similar, but their mechanisms of action exhibit some differences. A better understanding of their action at the gut and mucosal levels may contribute to a better knowledge of mucosal immune maturation and to the necessary discussion regarding the use of infant formulas oriented to immunomodulation. Fermented products and their presence in infant formulas thus provide relevant additions in the landscape of infant feeding.

토론

유아의 모유 수유가 장내 세균총의 정착과 그에 따른 점막 면역체계의 성숙에 중요한 역할을 한다는 사실은 널리 알려져 있으며, 최적의 면역 기능을 달성하기 위해 모유 수유를 권장하는 것도 마찬가지입니다. 유아용 조제 분유를 사용할 때, 균형 잡힌 장내 면역력을 확립하고 궁극적으로 알레르기 또는 전염병 예방에 기여하는 모유의 기능에 근접하는 것을 목표로 하는 몇 가지 옵션이 있습니다. 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱스가 함유된 분유 외에도 특정 박테리아 균주를 포함하는 발효 제품이 추가적인 경로로 등장하고 있습니다. 이들은 장내 미생물총의 조절을 통해 작용할 수 있지만, 점막 면역계와 직접 상호 작용하여 조절 T 세포를 유도함으로써 면역 균형을 촉진할 수도 있습니다.

발효 제품이 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱스가 함유된 유아용 분유에 더해 가져다줄 수 있는 이점에 대해 논의하려면 세 가지 개념을 직접 비교해야 합니다. 안타깝게도 임상 연구는 다양한 방식으로 설정되어(즉, 식품 매트릭스, 유아 인구, 섭취 기간, 임상 결과 등) 비교가 어렵습니다. 유아를 대상으로 한 임상 시험에서 분유에 발효 제품이 유익한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다. 그러나 이러한 임상 시험에서는 열처리된 발효 우유의 효과를 조사하고 있으며, 이 우유에는 관찰된 효과와 관련이 있을 수 있는 세균 조각이 여전히 포함되어 있을 수 있습니다(53). 발효 산물의 면역 효과를 세균 세포벽에 의해 유도된 효과와 구별하고 전임상 실험에서 제시된 특정 면역 조절 특성을 확실히 확인하기 위해서는 고품질의 무작위 대조 시험이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, FMBIF는 과학적, 임상적으로 관련된 특정 특징을 가지고 있습니다.

FMBIF는 살아있는 유기체를 포함하지 않으므로 쉽게 보관할 수 있습니다. 또한, 세균 전이의 위험이 취약한 유아 인구 집단에 한정되어 있는 것으로 보이지만, FMBIF에는 이러한 위험이 존재하지 않습니다. 한 임상 시험에서 열 불활성화 L. 람노서스 GG를 다량 함유한 분유를 섭취한 일부 신생아가 장 불편 증상을 보인 것으로 보고되었습니다(54). 현재 시판 중인 FMBIF에서 죽은 세균체는 어떤 부작용과도 관련이 없는 세균 종에서 유래합니다.

발효 제품은 프리바이오틱스가 함유된 분유와 같이 피험자와 조건에 따라 크게 달라질 수 있는 생체 내 발효 과정에 의존하지 않습니다. 유아용 조제 분유의 프로바이오틱스는 점막과의 상호 작용을 통해 작용할 수 있으며(55), 그 성질과 크기는 점막에 실제로 도달하는 LAB 균주의 성질, 수, 생리적 상태에 따라 달라집니다. 이러한 가변성은 프리바이오틱스나 프로바이오틱스를 이용한 무작위 대조 시험에서 때때로 관찰되는 효과의 차이에 기여할 수 있으며, 발효된 제품이 직접 제공될 때 감소될 수 있습니다. 발효된 제품은 기술적 과정을 정밀하게 모니터링함으로써 제어할 수 있으며, 이를 통해 재현성을 보장할 수 있습니다. 그러나 발효된 제품과 세균 균주의 분자 특성에 대한 연구가 집중되어야 합니다. 면역세포와 대상 집단은 관련된 메커니즘에 대한 더 나은 통찰력을 통해 정의되어야 합니다.

임상 실습에서 세 가지 유형의 유아용 조제분유(즉, 프리바이오틱, 프로바이오틱, 발효)의 유익한 효과는 비슷하거나 심지어 유사할 수 있지만, 그 작용 메커니즘은 약간의 차이를 보입니다. 장 및 점막 수준에서의 그들의 작용에 대한 더 나은 이해는 점막 면역 성숙에 대한 더 나은 지식과 면역 조절을 지향하는 유아용 조제 분유 사용에 관한 필요한 논의에 기여할 수 있습니다. 발효 제품과 유아용 조제 분유에 발효 제품이 존재한다는 것은 유아 수유 환경에 중요한 추가 요소를 제공합니다.

Statement of Financial Support

Some research projects carried out in the teams of O.G. and C.H. have been supported by Danone Baby Nutrition.

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