Biopurification --＞ plant protein 냄새 제거 2024 nature

[문형철]

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Biopurification using non-growing microorganisms to improve plant protein ingredients

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• Published: 31 July 2024

Biopurification using non-growing microorganisms to improve plant protein ingredients

• Avis Dwi Wahyu Nugroho, 
• Saskia van Schalkwijk, 
• Sabri Cebeci, 
• Simon Jacobs, 
• Wilma Wesselink, 
• Guido Staring, 
• Soenita Goerdayal, 
• Andrei Prodan, 
• Ann Stijnman, 
• Emma Teuling, 
• Kerensa Broersen & 
• Herwig Bachmann 

npj Science of Food volume 8, Article number: 48 (2024) Cite this article

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Abstract

Securing a sustainable global food supply for a growing population requires a shift toward a more plant-based diet. The application of plant-based proteins is therefore increasing, but unpleasant off-flavors complicate their use. Here, we screened 97 microorganisms for their potential to remove off-flavors in a process with limiting amounts of fermentable sugar. This allowed the production of a more neutral-tasting, purified food ingredient while limiting microbial growth and the production of typical fermentation end products. We demonstrate that various lactic acid bacteria (LAB) and yeasts remove “green” aldehydes and ketones. This conversion can be carried out in less than one hour in almond, pea, potato, and oat proteins. Heterofermentative LAB was best at aldehyde and ketone neutralization with minimum de novo formation of microbial volatiles such as ethylacetate (sweet, fruity) or alpha-diketones (butter- and cheese-like). While sensory properties were improved, changes in protein solubility, emulsification, foaming, and in vitro digestibility were limited.

증가하는 인구를 위한 지속 가능한 글로벌 식량 공급을 확보하기 위해서는 식물성 식단으로의 전환이 필요합니다. 따라서 식물성 단백질의 사용이 증가하고 있지만, 불쾌한 이취가 사용을 어렵게 만들고 있습니다. 여기서는 발효 가능한 당의 양을 제한하는 과정에서 97개의 미생물을 선별하여 이취 제거 가능성을 조사했습니다. 이를 통해 미생물의 번식과 전형적인 발효 최종 산물의 생성을 제한하면서 보다 중성적인 맛의 정제된 식품 원료를 생산할 수 있었습니다.

다양한 젖산균(LAB)과 효모가

“녹색” 알데하이드와 케톤을 제거한다는 것을 입증했습니다.

이러한 전환은

아몬드, 완두콩, 감자, 귀리 단백질에서

1시간 이내에 수행될 수 있습니다.

헤테로발효성 젖산균은

알데하이드와 케톤의 중화에 가장 뛰어나며,

에틸아세테이트(단맛, 과일향)나 알파디케톤(버터, 치즈 같은 향)과 같은

미생물 휘발성 물질의 새로운 생성을 최소화합니다.

감각적 특성이 개선되었지만,

단백질 용해도,

유화,

거품,

체외 소화율의 변화는 제한적입니다.

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Introduction

Plant-based food is currently the largest source of non-animal-derived, alternative protein with a continuous growth in global consumption1. Regarding price parity, technological maturity, regulatory support, and consumer acceptance2,3,4, plant proteins score highest in comparison with other alternative proteins such as microbial-, recombinant- or tissue culture-derived proteins. Overall, a plant-based diet is often described to be more sustainable and healthier than a meat-based diet5,6,7,8,9. To successfully replace animal products, sensory characteristics, and overall liking are crucial, and most consumers are unwilling to compromise on taste10,11. However, the use of plant-protein is regularly hampered by off-flavors that are described as “green”, “grassy”, and “beany” which are the result of the presence of common volatiles12,13. In legumes, off-flavor-associated volatiles are contributed by saturated aldehydes (e.g., hexanal), unsaturated aldehydes (e.g., cis-3-hexenal), and methoxypyrazines14. The formation of such “green” aldehydes is a result of fatty acid oxidation, particularly polyunsaturated fatty acids (PUFAs). Plant seeds accumulate these compounds as nutrient reserves14, and they occur in their cell membranes. Hence, these off-flavor precursors can be found in many plant-based raw materials, including non-oleaginous materials, such as potato tubers15. In plant-based foods, lipoxygenase (LOX)-catalyzed degradation of PUFAs is believed to be the main formation pathway of off-flavors16. Strategies to prevent off-flavor formation include LOX-null plants15,17,18, heat-induced LOX inactivation, enzymatic removal of precursors (phospholipids)19, or solvent treatments. However, such strategies often adversely affect protein techno-functionality, e.g., solubility20. The microbial reduction of off-flavors is an alternative approach that is mild and robust and typically applied through conventional fermentation21,22,23,24. Depending on the processing conditions, plant-based products can be at risk of outgrowth of resident spoilage and pathogenic microbes25,26. Fermentation can prevent such outgrowth, but the production of organic acids, ethanol, microbial volatiles, or the degradation of plant proteins results in an altered sensory profile. A common bias exists that microbial fermentation obliterates protein functionality, while improvements have been widely seen when a methodical approach is taken27.

Here, we investigated an alternative approach where we design and test a process in which the production of fermentation end-products is limited, but the desired metabolic conversions of off-flavors are still active. We consider this a biopurification process, which we carried out with diverse lactic acid bacteria (LAB) and yeasts to lower the amount of off-flavor molecules in almond, oat, pea, and potato proteins. The identified strains allowed for a rapid (≤1 h) reduction of aldehydes and ketones with negligible production of microbial (off) flavors or organic acids and minimum alterations of protein techno-functionality.

소개

식물성 식품은 현재 비동물성 대체 단백질의 가장 큰 원천이며, 전 세계적으로 소비가 지속적으로 증가하고 있습니다1. 가격, 기술적 성숙도, 규제 지원, 소비자 수용도2,3,4와 관련하여 식물성 단백질은 미생물, 재조합 또는 조직 배양에서 추출한 단백질과 같은 다른 대체 단백질에 비해 가장 높은 점수를 받았습니다. 전반적으로, 식물성 식단은 육식 식단보다 지속 가능하고 건강에 좋다고 알려져 있습니다5,6,7,8,9.

동물성 제품을 성공적으로 대체하기 위해서는

감각적 특성과 전반적인 선호도가 중요하며,

대부분의 소비자는 맛에 대한 타협을 원하지 않습니다10,11.

그러나

식물성 단백질의 사용은

흔히 “녹색”, “풀”, “콩”과 같은 불쾌한 맛으로 인해 방해를 받는데,

이는 일반적인 휘발성 물질12,13의 결과입니다.

콩과 식물에서, 불쾌한 냄새와 관련된 휘발성 물질은

포화 알데히드(예: 헥산알),

불포화 알데히드(예: 시스-3-헥센알),

메톡시피라진14에 의해 생성됩니다.

이러한 “녹색” 알데히드의 형성은

지방산 산화, 특히 다중불포화지방산(PUFA)의 산화 결과입니다.

식물 종자는

이러한 화합물을 영양분으로 축적하여14,

세포막에 존재하게 됩니다.

따라서 이러한 냄새 유발 물질은

감자 괴경과 같은 비유성 식물을 포함한

많은 식물성 원료에서 발견될 수 있습니다15.

식물성 식품에서

리폭시게나제(LOX)에 의해 촉매되는 PUFA의 분해는

냄새 유발 물질의 주요 형성 경로로 여겨집니다16.

부패 방지 전략에는

LOX-null 식물15,17,18, 열에 의한 LOX 불활성화,

전구체(인지질)의 효소 제거19,

용매 처리 등이 포함됩니다.

그러나 이러한 전략은 종종 단백질 기술적 기능에 악영향을 미치기도 합니다(예: 용해도20).

미생물로 인한 냄새의 감소는

온화하고 강력한 대안적 접근법으로,

일반적으로 전통적인 발효 과정을 통해 적용됩니다21,22,23,24.

가공 조건에 따라

식물성 제품이 부패균과 병원성 미생물의 증식 위험에 처할 수 있습니다25,26.

발효는 이러한 증식을 방지할 수 있지만,

유기산, 에탄올, 미생물 휘발성 물질의 생산 또는 식물성 단백질의 분해는

감각적 특성의 변화를 초래합니다.

미생물 발효가

단백질의 기능을 없애버린다는 편견이 존재하지만,

체계적인 접근 방식을 취할 경우 개선이 이루어지는 경우가 널리 알려져 있습니다27.

여기서는 발효 최종 생성물의 생산은 제한되지만,

바람직하지 않은 맛의 대사 전환이 여전히 활발하게 이루어지는 과정을 설계하고 테스트하는

대체 접근 방식을 조사했습니다.

우리는 이것을

바이오 정화 과정이라고 생각합니다.

우리는 다양한 젖산균(LAB)과 효모를 사용하여

아몬드, 귀리, 완두콩, 감자 단백질에 있는 불쾌한 맛 분자의 양을 줄였습니다.

확인된 균주를 사용하면

미생물(불쾌한) 맛이나 유기산의 생산을 무시할 수 있을 정도로 빠르게(1시간 이내)

알데히드와 케톤을 줄일 수 있으며,

단백질 기술적 기능의 변화는 최소화할 수 있습니다.

Results

Biopurification allows volatile degradation in the absence of a carbon source

To study the role of microbial conversion of molecules occurring in the seeds of four diverse plant families, we characterized volatile compounds present in almond (stone fruit), oat (gras), pea (legume), and potato (tuber) protein and found considerable overlap between substrates (Supplementary Information S1). Detected differences are partially explained by the source of the raw material or are the result of the protein purification process itself (Supplementary Information S2). Analysis of the sugar composition (Supplementary Information S3) shows that no sugars were detected in the pea and potato protein isolates used in this study. The oat protein concentrate used contained a small amount of sucrose in the powder (6 mg/g), while the almond protein concentrate contained a higher amount of sucrose (94 mg/g) as well as small amounts of stachyose (4 mg/g), raffinose (10 mg/g), and mannose (6 mg/g). In addition to the measured sugars, carbon may be present in the form of a wide range of glycosides naturally present in plant protein ingredients, e.g., phenolic compounds and saponins28,29, and if liberated through enzymatic processes, these sugar groups may facilitate the growth of microorganisms. Microbial sugar catabolism may be crucial for volatile reduction since it regenerates the required redox cofactors in the cell (e.g., NAD(H))30. Under growing conditions, an increase in the number of cells may enhance volatile reduction. However, high acidity or ethanol production may eventually halt cellular activity31, and enzyme activities might alter protein functionality. This raises the question of whether volatile reduction can occur in a situation where growth is limited due to e.g., a lack of fermentable carbon32,33.

To investigate this, we incubated a diverse set of microorganisms, mainly of food origin, with plant protein solutions in either the presence or the absence of added sugars (Supplementary Section 4). Following 24 h of incubation, the pH values of the protein solutions were determined as a proxy of sugar utilization (acidification) and/or microbial growth. We would like to note that the assumption that a pH decrease coincides with growth might not always be fully accurate for some of the yeast strains used. Without the addition of sugar, limited pH changes across samples were seen in pea and potato protein isolates (Fig. 1A). In almond and oats, the pH decreased from 6.4 to a minimum of 4.3 and 5.0, respectively, independent of whether yeast or LAB was used. The pH drop is in line with the measured levels of sugars, but it is also obvious that not all strains led to the same pH decrease. The data further show that a declining pH coincides with lower levels of most ketones and aldehydes. At the same time, the alcohols increased (Fig. 1B), and sugar utilization correlated with ethyl-acetate production (Supplementary Information S4). Together, these results demonstrate the potential of lowering plant-derived volatiles using microbial metabolism. However, while sugar utilization by microorganisms improves the number of aldehydes and ketones that can be reduced, a more detailed analysis shows that individual strains are able to reduce these compounds, in e.g., oat and pea samples where limited acidification and, therefore, limited growth occurred. For instance, in peas, hardly any acidification occurred with yeasts or LAB (Fig. 1), but many of these organisms were able to reduce aldehydes and ketones (Fig. 2). This suggests that the potential for biopurification is strain-specific.

결과

바이오 정화는

탄소원이 없을 때 휘발성 분해 작용을 가능하게 합니다.

4가지 다른 식물군의 씨앗에서 발생하는 분자의 미생물 전환 작용의 역할을 연구하기 위해,

우리는 아몬드(돌과일), 귀리(그라스), 완두콩(콩과식물), 감자(덩이줄기) 단백질에 존재하는

휘발성 화합물을 특성화하고 기질(보충 정보 S1) 사이에 상당한 중복이 있음을 발견했습니다.

검출된 차이점은 원료의 원천에 의해 부분적으로 설명되거나 단백질 정제 과정 자체의 결과입니다(보충 정보 S2). 당 조성 분석(보충 정보 S3)에 따르면, 이 연구에 사용된 완두콩과 감자 단백질 분리물에서 당이 검출되지 않았습니다. 사용된 귀리 단백질 농축액에는 분말에 소량의 자당이 포함되어 있었으며(6mg/g), 아몬드 단백질 농축액에는 더 많은 양의 자당(94mg/g)과 소량의 스타키오스(4mg/g), 라피노스(10mg/g), 만노스(6mg/g)가 포함되어 있었습니다. 측정된 당류 외에도, 식물성 단백질 성분에 자연적으로 존재하는 다양한 배당체 형태의 탄소가 존재할 수 있습니다. 예를 들어, 페놀 화합물과 사포닌28,29 등이 있으며, 효소 과정을 통해 분리될 경우, 이러한 당류 그룹은 미생물의 성장을 촉진할 수 있습니다. 미생물 당분 분해는 세포에서 필요한 산화 환원 보조 인자(예: NAD(H))를 재생하기 때문에 휘발성 물질 감소에 결정적인 역할을 할 수 있습니다30. 성장 조건에서 세포 수가 증가하면 휘발성 물질 감소가 촉진될 수 있습니다. 그러나 높은 산도 또는 에탄올 생산은 결국 세포 활동을 중단시킬 수 있으며31, 효소 활동은 단백질 기능을 변화시킬 수 있습니다. 이 때문에 발효 가능한 탄소 부족으로 인해 성장이 제한되는 상황에서 휘발성 감소가 발생할 수 있는지에 대한 의문이 제기됩니다32,33.

이를 조사하기 위해, 당을 첨가하거나 첨가하지 않은 식물성 단백질 용액에 다양한 미생물(주로 식품에서 유래된 미생물)을 배양했습니다(보충 섹션 4). 24시간의 배양 후, 당의 활용(산성화) 및/또는 미생물 성장의 지표로 단백질 용액의 pH 값을 측정했습니다. pH 감소가 성장과 일치한다는 가정은 일부 효모 균주에 대해서는 항상 정확하지 않을 수 있다는 점을 유의해야 합니다.

설탕을 첨가하지 않은 경우, 완두콩과 감자 단백질 분리물에서 샘플 간에 제한된 pH 변화가 관찰되었습니다(그림 1A). 아몬드와 귀리에서는 효모 또는 유산균을 사용했는지 여부에 관계없이 pH가 6.4에서 각각 최소 4.3과 5.0으로 감소했습니다. pH의 감소는 측정된 당의 수준과 일치하지만, 모든 균주가 동일한 pH 감소로 이어진 것은 아니라는 것도 분명합니다.

데이터는 pH의 감소가 대부분의 케톤과 알데하이드의 낮은 수준과 일치한다는 것을 보여줍니다. 동시에 알코올이 증가했고(그림 1B), 당의 활용은 에틸 아세테이트 생산과 상관관계가 있었습니다(보충 정보 S4). 이 결과는 미생물 대사를 통해 식물 유래 휘발성 물질을 줄일 수 있는 가능성을 보여줍니다.

그러나 미생물에 의한 당분 활용이 감소시킬 수 있는 알데하이드와 케톤의 수를 증가시키는 반면, 보다 자세한 분석에 따르면, 개별 균주가 이러한 화합물을 감소시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다. 예를 들어, 제한된 산성화로 인해 제한된 성장만 일어나는 귀리 및 완두콩 샘플에서 이러한 현상이 나타났습니다.

예를 들어,

완두콩에서는 효모나 락토바실러스(LAB)에 의한 산성화가 거의 발생하지 않았지만(그림 1), 이들 미생물 중 다수가 알데히드와 케톤을 감소시킬 수 있었습니다(그림 2). 이것은 생물학적 정화 능력이 균주에 따라 다르다는 것을 시사합니다.

Fig. 1: Four plant protein solutions (no sugar added) were incubated with 70 LAB and 27 yeast strains for 24 h.

The final pH values are shown in panel (A). Each dot corresponds to a sample with an individual organism (differentiated by colors). Black diamond-shaped dots correspond to the median of the dataset. Correlations of measured volatiles and pH reduction (using non-fermented samples as reference) at the end of sample incubation are shown in panel (B). Correlation values were calculated as Spearman’s rho based on the values obtained from biopurification of hour substrates and visualized in varying circle sizes and a color gradient. Blank cells represent non-significant correlations (p-value < 0.05).

최종 pH 값은 패널 (A)에 표시됩니다. 각 점은 개별 유기체(색상으로 구분)가 있는 샘플에 해당합니다. 검은색 다이아몬드 모양의 점은 데이터 세트의 중앙값에 해당합니다. 표본 배양 종료 시 측정된 휘발성 물질과 pH 감소의 상관관계(발효되지 않은 표본을 기준으로 함)는 패널(B)에 나와 있습니다. 상관관계 값은 시간 기질의 생물학적 정화에서 얻은 값을 기반으로 스페어맨의 rho로 계산되었으며, 다양한 원형 크기와 색상 그라데이션으로 시각화되었습니다. 빈 셀은 유의하지 않은 상관관계(p-값이 0.05 미만)를 나타냅니다.

Fig. 2: Heatmap of volatiles in different plant protein ingredients following biopurification with LAB (upper panels) or yeast (lower panels) as measured by HS-SPME-GC-MS after 24 h of incubation.

Each row on the y-axis represents the biopurification profile from one strain. Volatiles (columns) were manually grouped per compound class as indicated in gray and white blocks at the bottom. Heatmap colors are log10-transformed fold changes compared to the corresponding non-inoculated control samples. The row color bar of the upper LAB panel represents fermentation profiles based on lactic vs mixed acid productions which are taken or deduced from literatures47,48. Extended data are available in Supplementary Information S6 and S12.

Heterofermentative LAB reduced aldehydes and many reduced ketones as well

A limited set of microorganisms have been reported before for their ability to neutralize off-flavors in multiple plant proteins21,23,24,34. There are indications that the extent of the neutralization of common off-flavors during the fermentation of plant protein ingredients is strain-dependent and that the spectrum of activities overlaps within specific phylogenetic clades of microorganisms24. However, there is no data available on the extent to which such conversions are possible when the carbon sources in the substrate are limited. Our dataset with 70 lactic acid bacteria and 27 yeasts combined with four substrates allowed us to address this question by comparing the relative abundance of volatiles at the end of the incubation (Fig. 2). The observed overall spectrum of volatile reduction can be categorized based on volatile classes, particularly aldehydes, and ketones. Despite differences in protein matrices, volatile reductions were strikingly consistent, particularly for yeasts and remarkably for obligate heterofermentative LAB. Both groups of microorganisms are known for their high constitutive expression‎ of alcohol dehydrogenases (ADH) and the production of ethanol as one of the end metabolites of pyruvate dissipation. Aldehydes and ketones were effectively reduced by obligate heterofermentative strains, while some strain- and species-dependent variations were found for other LAB35,36. In all cases, the reduction of aldehydes or ketones was accompanied by the concomitant formation of the corresponding alcohols. Notably, three LAB species (Lb. buchneri, Lb. parabuchneri, and Lb. brevis) effectively reduced unwanted plant-derived volatiles with minimum formation of microbial volatiles (Supplementary Information S5) and limited pH reduction. Such microorganisms fulfill the desired requirements of protein biopurification i.e., the production of a neutral-tasting plant-protein ingredient. The obligate heterofermenters seem to be the most promising group of microbes with a spectrum of reduction of both aldehydes and ketones (Fig. 2 and Supplementary Information S6). The LAB and yeast strains that show the highest potential for biopurification can be related to elevated ADH expression‎ levels.

이종발효성 유산균은

알데하이드와 많은 환원 케톤도 감소시켰습니다.

제한된 미생물 세트가

여러 식물성 단백질의 냄새를 중화시키는 능력에 대해 이전에 보고된 바 있습니다21,23,24,34.

식물성 단백질 성분의 발효 과정에서 일반적인 이취가 중화되는 정도는 균주에 따라 다르며,

미생물의 특정 계통 발생군 내에서 활동 스펙트럼이 겹친다는 징후가 있습니다24.

그러나

기질 내 탄소원이 제한된 경우

이러한 전환이 어느 정도까지 가능한지에 대한 데이터는 없습니다.

4가지 기질과 70가지 젖산균, 27가지 효모로 구성된 데이터 세트를 통해

배양 종료 시 휘발성 물질의 상대적 풍부도를 비교함으로써

이 질문에 답할 수 있었습니다(그림 2).

관찰된 휘발성 감소의 전체 스펙트럼은

휘발성 종류,

특히 알데하이드와 케톤을 기준으로 분류할 수 있습니다.

단백질 매트릭스의 차이에도 불구하고,

특히 효모와 의무적 이종발효성 유산균의 경우

휘발성 감소가 놀라울 정도로 일관적이었습니다.

이 두 미생물 그룹은

알코올 탈수소효소(ADH)의 높은 구성적 발현과 피루브산 분해의 최종 대사 산물 중 하나인

에탄올 생산으로 잘 알려져 있습니다.

알데히드와 케톤은

필수 이종발효성 균주에 의해 효과적으로 감소되었으며,

다른 LAB35,36에 대해서는 균주 및 종에 따라 약간의 차이가 발견되었습니다.

모든 경우에

알데히드 또는 케톤의 감소는

해당 알코올의 형성을 동반했습니다.

특히, 세 가지 LAB 종(Lb. buchneri, Lb. parabuchneri, Lb. brevis)은

미생물 휘발성 물질의 최소 형성과

제한된 pH 감소로 원치 않는 식물 유래 휘발성 물질을 효과적으로 감소시켰습니다(보충 정보 S5).

이러한 미생물은

단백질 생물 정화의 요구 조건,

즉 중성 맛의 식물성 단백질 성분을 생산하는 조건을 충족합니다.

의무성 이종발효균은 알데히드와 케톤을 모두 감소시키는 스펙트럼을 가진 가장 유망한 미생물 그룹인 것으로 보입니다(그림 2 및 부가 정보 S6). 생물 정화 잠재력이 가장 높은 것으로 보이는 LAB와 효모 균주는 높은 수준의 ADH 발현과 관련이 있을 수 있습니다.

Degradation of aldehydes is rapid and conferred by ADH

Our initial screening (Fig. 2) involved the incubation of protein solutions for 24 hours as an end-point measurement. To test how fast biopurification can be achieved, we studied the use of high inoculation densities (~1E8 cells/mL) with a well-performing, biopurifying strain (LAB11—Leuconostoc mesenteroides). In addition, we investigated whether ADH activity alone was sufficient for aldehyde reduction. We did this by either using a commercial mixture of ADHs isolated from Saccharomyces cerevisiae or alternatively by working with permeabilized cells of LAB11. All three conditions were used to test the degradation of aliphatic aldehydes in pea protein. As the conversion from aldehyde to alcohol by isolated ADH and possibly permeabilized cells relies on exogenous NADH, we added NADH 1 or 2 h after the incubation was started. Consistently the results show that the levels of aldehydes at the start of the incubation in permeabilized cells and ADH-treated samples were high, and their reduction was observed only after NADH addition (Fig. 3). This shows the NADH dependency of the conversion reaction with purified ADH, confirm‎ing that ADH is the conferring agent of the reaction. Low levels of aldehydes could be observed almost immediately after NADH addition. Additional incubation or supplementation with NADH did not lead to further aldehyde reduction (Supplementary Information S7), indicating rapid completion of the reaction. Interestingly, in samples where intact cells were used, the level of aldehydes already reached their lowest values at the first measurement point, and longer incubation or the addition of NADH did not lead to further aldehyde reduction. In this case the levels of aldehydes reached similarly low values as what we found with purified ADH or permeabilized cells after NADH addition. This indicates that intracellular NADH equivalents in strain LAB11 are sufficiently supplied in cells incubated in a pea-protein isolate without a carbon source. Under all conditions, the reduction of the aldehyde resulted in a high level of the corresponding alcohol derivatives which is in line with the described bioconversion by ADH. Altogether, the neutralization of aliphatic aldehydes can be very rapid when incubating the substrate with 1E8 cells/ml. In addition to the removal of aldehydes and ketones some strains lead to lower furan levels, especially in pea and almond. Some yeasts also lead to a decrease in sulfur compounds, which was particularly pronounced in almonds as a substrate (Fig. 2).

알데히드의 분해는 빠르며, ADH에 의해 촉진됩니다.

초기 스크리닝(그림 2)은 종말점 측정으로 24시간 동안 단백질 용액을 배양하는 것을 포함합니다. 생물 정화 속도를 테스트하기 위해, 우리는 성능이 우수한 생물 정화 균주(LAB11—Leuconostoc mesenteroides)를 사용하여 높은 접종 밀도(~1E8 세포/mL)를 사용하는 방법을 연구했습니다. 또한, 알데히드 감소에 ADH 활동만으로도 충분한지 조사했습니다. 우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 분리된 상업용 ADH 혼합물을 사용하거나, 또는 LAB11의 투과성 세포를 사용하여 이 작업을 수행했습니다. 세 가지 조건 모두를 사용하여 완두콩 단백질에서 지방족 알데히드의 분해를 테스트했습니다. 분리된 ADH와 투과성 세포에 의한 알데히드에서 알코올로의 전환은 외인성 NADH에 의존하기 때문에, 배양 시작 후 1~2시간 후에 NADH를 추가했습니다. 일관되게, 퍼미빌라이즈드 세포와 ADH 처리된 샘플에서 배양 시작 시 알데하이드 수준이 높았고, NADH 추가 후에만 감소가 관찰되었다(그림 3). 이것은 정제된 ADH를 이용한 전환 반응이 NADH에 의존적임을 보여 주며, ADH가 반응의 부여인자임을 확인시켜 줍니다. NADH를 추가한 직후 낮은 수준의 알데하이드가 관찰되었습니다. 추가적인 배양 또는 NADH의 보충은 알데하이드의 추가적인 감소로 이어지지 않았습니다(보충 정보 S7). 이는 반응이 빠르게 완료되었음을 나타냅니다. 흥미롭게도, 온전한 세포를 사용한 샘플에서 알데하이드의 수준은 첫 번째 측정 지점에서 이미 최저치에 도달했으며, 더 긴 배양 또는 NADH의 추가가 알데하이드의 추가적인 감소로 이어지지 않았습니다. 이 경우, 알데히드 수준은 NADH를 첨가한 후 정제된 ADH 또는 투과성 세포에서 발견된 것과 비슷한 낮은 값에 도달했습니다. 이는 LAB11 균주의 세포 내 NADH 등가물이 탄소 공급원 없이 완두콩 단백질 분리물로 배양된 세포에 충분히 공급된다는 것을 의미합니다. 모든 조건에서 알데히드의 환원은 해당 알코올 유도체의 높은 수준을 초래했으며, 이는 ADH에 의한 생물학적 전환과 일치합니다. 알파 지방 알데히드의 중화는 1E8 세포/ml의 배양액으로 배양할 때 매우 빠르게 진행될 수 있습니다. 알데히드와 케톤의 제거 외에도 일부 균주는 특히 완두콩과 아몬드에서 푸란 수치를 낮추는 효과가 있습니다. 일부 효모는 또한 황 화합물의 감소를 유도하는데, 이는 특히 아몬드 배양액에서 두드러졌습니다(그림 2).

Fig. 3: Rapid reduction of aldehydes (blue) to their corresponding alcohols (orange).

Isolated ADH, intact LAB cells, and permeabilized LAB cells (columns from left to right) were used as biopurifying agent. The cell concentration used was at ~1E + 08 cells/ml. Error bars represent the standard deviation of (biological) replicates (n = 3 for ADH and n = 2 for cells). NADH was added after 1 or 2 h of incubation, as indicated by black arrows in the upper row. Note: when using intact cells the aldehyde was reduced in the time between preparing and freezing the samples. See Supplementary Fig. 9 for an extended version.

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Optimization of biopurification through high dry matter content fermentations and preculture conditioning

For the development of sustainable biopurification processes, water addition should be minimized to decrease the energy needed to, e.g., produce a protein powder ingredient following biopurification. In dedicated experiments, we investigated combinatorial options where we varied inoculation densities and incubation times in a pea protein matrix with a high dry matter content. We used a dry matter content of 40%, which gave a dough-like texture in which we expected to have sufficient water available for microbial activity. The results showed that also at 40% dry matter content, the aldehyde reduction was almost complete in less than 30 min after inoculation (first measurement) with 1E8 cell/ml or more, while the process took up to 24 h when the inoculation density was decreased to 1E6 cells/ml (Supplementary Information S8). The absence of a detectable decrease in pH or microbial growth during the first hour points towards a microbial lag phase (Supplementary Fig. 12) during which biopurification occurs.

While heterofermentative strains were shown to be efficient for biopurification, these organisms are often not the first choice in industrial applications. For this reason, we explored a strategy to increase ADH levels in the typically homofermentative and easy-to-culture organism L. cremoris. L. cremoris is known to undergo a metabolic shift from homolactic to mixed acid fermentation when cultured at lower growth rates37,38. This comes with higher expression‎ levels of the ADH enzyme. We tested whether varying the preculture growth rate through incubation on different carbon sources influences aldehyde reduction when the cells are subsequently used for biopurification. The results show that supplying a sugar that leads to a slow growth rate allows a homofermentative lactococcus to significantly increase the removal of aliphatic aldehydes (Fig. 4, Supplementary Information S4). This opens opportunities for the optimization of homofermentative organisms to efficiently be applied for biopurification.

높은 건조 물질 함량 발효 및 예비 배양 조절을 통한 바이오 정화 최적화

지속 가능한 바이오 정화 공정을 개발하기 위해서는, 예를 들어 바이오 정화 후 단백질 분말 성분을 생산하는 데 필요한 에너지를 줄이기 위해 물 첨가를 최소화해야 합니다. 우리는 전문화된 실험을 통해 건조 물질 함량이 높은 완두콩 단백질 매트릭스에서 접종 밀도와 배양 시간을 변화시키는 조합 옵션을 조사했습니다. 우리는 건조 물질 함량이 40%인 반죽을 사용했는데, 이 반죽은 미생물 활동에 충분한 수분을 보유할 수 있는 반죽과 같은 질감을 가지고 있었습니다. 그 결과, 건조 물질 함량이 40%인 경우에도 1E8 세포/ml 이상의 세포를 접종(첫 번째 측정)한 후 30분 이내에 알데히드 감소가 거의 완료된 반면, 접종 밀도가 1E6 세포/ml로 감소하면 이 과정에 최대 24시간이 걸린다는 사실이 밝혀졌습니다(보충 정보 S8). 첫 시간 동안 pH나 미생물 성장의 감소를 감지할 수 없다는 것은 미생물 지연 단계(Supplementary Fig. 12)가 존재한다는 것을 의미하며, 이 단계 동안 생물학적 정화가 발생합니다.

이종발효성 균주가 생물학적 정화에 효율적인 것으로 밝혀졌지만, 이러한 미생물은 산업 응용 분야에서 종종 우선적으로 선택되지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 일반적으로 동종발효성이고 배양이 쉬운 미생물인 L. 크레모리스의 ADH 수준을 높이는 전략을 모색했습니다. L. 크레모리스는 낮은 성장률에서 배양될 때 호모락틱 발효에서 혼합산 발효로 대사 전환이 일어나는 것으로 알려져 있습니다37,38. 이것은 ADH 효소의 발현 수준이 더 높다는 것을 의미합니다. 우리는 다른 탄소원을 이용한 배양으로 전배양 성장률을 변화시키는 것이 세포가 이후에 생물 정화에 사용될 때 알데하이드 감소에 영향을 미치는지 테스트했습니다. 그 결과, 성장 속도가 느린 당을 공급하면 호모발효성 락토코커스가 지방족 알데하이드 제거율을 크게 높일 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다(그림 4, 부록 S4). 이로써 호모발효성 유기체를 최적화하여 생물학적 정화에 효율적으로 적용할 수 있는 기회가 열렸습니다.

Fig. 4: Fold-change (Log10) of volatiles pea samples biopurified with L. cremoris MG1363 in comparison to sterile unfermented samples.

Y-axis shows growth rate (/h) and 3-letter initial of sugar added during preculture: glucose (Glu), mannose (Man), fructose (Fru), sucrose (Suc), maltose (Mal), galactose (Gal), trehalose (Tre), and mannitol (Mnt). Blue and orange bars show volatile changes after incubation without and with sugar added to the pea protein suspension respectively. Error bars show the standard deviation of the mean (n = 3). See Supplementary Fig. 4 for more data.

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Sensory analysis confirm‎s biopurification-induced volatile changes

To assess the remaining odor-active compounds after biopurification of pea protein, they were identified using GC-olfactometry. While decreased in peak area (GC–MS), odor-active compounds were still perceived and included sulfury (sulfur dioxide, methanethiol, methional, dimethyltrisulfide), fresh, green, grassy (hexanal, hexanol), creamy buttery, cheesy (diacetyl, 2,3-pentanedione, 2-heptanone), cocoa, malty (3-methylbutanal), fatty, green, cucumber (octanal, nonanal, 2-heptenal, 2-octenal), mushroom (octen-3-ol, 1-octanol, 3,5-octadien-2-one), sweet vanilla (vanillin), sweet roast (furfural), pea, green (methoxypyrazines), fatty, and coconut (gamma-undecalactone) (Supplementary Table S5).

To investigate whether biopurification leads to perceivable sensory changes in relevant applications, a CATA (Check All That Applies) analysis was carried out in 2 beverages. As the food matrix influences flavor and release, the sensory analysis was performed in a water-based (beverage) matrix and in an emulsion-based (milk analog) matrix. An ANOVA analysis showed that biopurification significantly reduced the pea attribute (p = 0.04, df = 3) albeit differently in the two matrices (Supplementary Information S9). Other attributes, including sour, did not change significantly (Fig. 5). The changes in sensory perception can be related to biopurification-induced compound changes identified with GC–MS and GC–O, such as hexanal and 2-octenal (Supplementary Information S9). Further optimizations through choosing combinations of strains that can reduce the remaining aroma-active compounds as observed with GC–O could be a next step.

Fig. 5: Spider web representation of aroma and taste attributes of the pea protein beverage (water-based) and the milk analog (emulsion-based) before (red and blue) and after fermentation (orange and green).

Results are the average of scores obtained by ten panelists.

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Biopurification has limited effects on in vitro digestibility and techno-functionality

Industrial applications of proteins require specific functionality, and the process of biopurification may affect these properties. For example, microbial membrane-bound or secreted proteases may affect protein digestibility, alter techno-functionality, or produce bitter peptides27,39,40. To investigate whether the digestibility of plant proteins was affected by biopurification, we subjected pea protein that had been biopurified with three selected strains to an INFOGEST in vitro digestion paradigm, mimicking the conditions of gastrointestinal processing41. Peptide analysis showed that susceptibility to gastrointestinal processing was largely not affected upon biopurification. The release of amino acids in the same samples showed a clear strain dependency allowing for a targeted process design (Supplementary Information S10). For L. mesenteroides but more so for the yeast Pichia manshurica the effects on amino acid concentrations after biopurification and in vitro digestion were limited. Overall, the susceptibility of pea protein to gastrointestinal digestion is largely unaffected upon exposure to the strains chosen for biopurification.

Studies on plant protein fermentation reported that incubation times exceeding 10 h negatively affected functional properties associated with the degradation of proteins or peptides21,23. To test for changes in protein techno-functionality, foaming, emulsification, and protein solubility were compared for pea protein solutions before and after biopurification (Fig. 6 and Supplementary Information S11). Overall, foam overrun, total soluble nitrogen, and emulsion droplet size distribution were not significantly affected by biopurification. One exception was the pea protein isolate, where biopurification by LAB or yeast resulted in a 25% increase in foaming ability and stability. Aside from biopurification the results showed significant differences between the techno-functionality of various protein sources. Overall, foaming properties may be slightly improved and other properties remain unaltered by off-flavor biopurification.

Fig. 6: Techno-functionality of non-sterilized plant-protein ingredients following biopurification using the lactic acid bacterium L. buchneri (LAB98) (light orange) the yeast Pichia deserticola (Yeast33) (red) or the non-inoculated control (blue).

Freeze-dried, biopurified protein samples (n = 2) were resuspended and analyzed for foaming (top panel), solubility (middle panel), and emulsion droplet size (bottom panel). Error bars/shaded areas indicate standard deviations of the mean.

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Discussion

Our initial hypothesis, that carbon-limited/non-growing microbial cells can carry out desired conversions in plant-based fermentations, was based on the fact that non-growing LAB can have significant metabolic activity42. This concept also applies to the use of dairy adjunct cultures. While we could show the importance of ADH under non-growing conditions, it is relevant to mention that ADH can occur as a bifunctional enzyme, also leading to the conversion of aldehydes to carboxylic acids and eventually to esters35,36,43. In our case, we did not observe other aldehyde-derived products, but even if that were the case, such products should be less perceivable based on their lower volatility. The removal of off-flavors does not necessarily guarantee the absence of subsequent off-flavor formation during further processing and storage of a product since the precursors of unwanted molecules may still be retained. This indicates that the position of biopurification during processing will be of importance. For aliphatic aldehydes, precursor removal has been demonstrated using (phospho-)lipases19,43. Such enzymes are described in lactobacilli35,36,44,45, and their application remains to be studied for biopurification. GC-olfactometry and the CATA analysis indicated that after the removal of the “green” aldehydes, other aroma-active compounds can still contribute to sensory off-flavor attributes. For instance, the high detection threshold for pyrazines with GC–MS leads to us not reporting any here, but the sensory data suggests that pyrazines might be unmasked following biopurification. Pyrazine-converting microorganisms have been described46.

Their inclusion might allow further biopurification.

The option of conditioning facultative homofermentative lactic acid bacteria to increase desired enzyme activity opens opportunities for strains already in use in the industry. While the presence of ADH is a prerequisite for aldehyde reduction, we cannot exclude that physiological differences, such as intracellular NAD+/NADH ratios between homo- and heterofermentative organisms, are determining the conversion rates. Fast conversion rates allow to minimize the risk of outgrowth of pathogenic and spoilage organisms. These are often spore-forming organisms e.g., bacillus species present in raw materials25. For their inactivation, typically, high-temperature treatment is used, but this is detrimental to the native plant-protein conformation and its techno-functionality. A reduced need for hurdles to prevent the outgrowth of spoilage organisms will, therefore, benefit techno-functionality and in vitro digestion. The rate of off-flavor removal depends on the inoculation density. An estimate for the biopurification of one metric ton of protein concentrate treated in a process with 40% dry matter (weight/volume) (2500 l), using 107 bacterial cells/ml (see also Supplementary Information 8), indicates that 10 l of fermentation broth with a cell density of 2.5 × 109 cells/ml are required. For industrial implementation, optimizations to minimize the number of cells, inoculation time, and position in the overall process will still be needed. For the inactivation of the organisms after biopurification a pasteurization step is typically sufficient because the used organisms are heat sensitive.

While our results show that strains with specific desirable properties can be identified, screening processes will certainly benefit from a more rational approach. By using genome-based enzyme and pathway prediction analyses, the number of screened organisms for a particular biopurification purpose might be narrowed down. However, this approach is currently still restricted by the limited knowledge of pathways involved in the microbial degradation of undesired plant-derived molecules. Harnessing microbial biodiversity for the improvement of plant proteins in combination with the right processing conditions is likely to play an important role in making future plant-based foods more palatable and thereby increasing consumer acceptance. This does not only count for plant-based food but also for current developments in foods based on recombinant protein (precision fermentation) or cultured meat, where for economic reasons, the addition of plant proteins is becoming increasingly important.

토론

탄소 제한/비성장 미생물 세포가 식물 기반 발효에서 원하는 전환을 수행할 수 있다는 초기 가설은 비성장 LAB가 상당한 대사 활동을 할 수 있다는 사실에 기반을 두고 있습니다42. 이 개념은 유제품 부가 배양물의 사용에도 적용됩니다. 비성장 조건에서 ADH의 중요성을 보여줄 수 있지만, ADH가 알데히드를 카르복실산으로 전환하고 결국에는 에스테르로 전환하는 이중 기능성 효소로 작용할 수 있다는 점을 언급하는 것이 적절합니다35,36,43. 우리의 경우, 다른 알데히드 유도체 생성물을 관찰하지 못했지만, 그러한 생성물이 존재한다고 하더라도, 그 생성물은 낮은 휘발성으로 인해 인지하기 어려울 것입니다. 불쾌한 냄새를 제거한다고 해서, 제품이 추가 가공 및 보관되는 동안 불쾌한 냄새가 다시 생기지 않는다는 보장은 없습니다. 원치 않는 분자의 전구체가 여전히 남아 있을 수 있기 때문입니다. 이것은 가공 과정에서 생물학적 정화 과정의 위치가 중요하다는 것을 의미합니다. 지방족 알데히드의 경우, (포스포)리파제19,43를 사용하여 전구물질 제거가 입증되었습니다. 이러한 효소는 유산균35,36,44,45에 설명되어 있으며, 생물학적 정화를 위한 적용은 아직 연구가 필요합니다. GC-후각 측정법과 CATA 분석에 따르면, “녹색” 알데히드를 제거한 후에도 다른 향기 활성 화합물이 감각적 불쾌한 맛의 특성에 기여할 수 있는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, GC-MS를 이용한 피라진 검출의 높은 기준치 때문에 여기에서는 피라진에 대한 보고가 전혀 이루어지지 않았지만, 감각 데이터에 따르면 피라진은 생물학적 정화 과정을 거치면 가려진 부분이 드러날 수 있습니다. 피라진 전환 미생물은46에서 설명되어 있습니다.

그 미생물을 포함시키면 추가적인 생물학적 정화가 가능할 수 있습니다.

원하는 효소 활성을 증가시키기 위해 선택적 호모발효성 젖산균을 조절하는 옵션은 업계에서 이미 사용되고 있는 균주에 대한 기회를 열어줍니다. ADH의 존재가 알데히드 감소의 전제 조건이지만, 호모발효성 유기체와 이종발효성 유기체 사이의 세포 내 NAD+/NADH 비율과 같은 생리적 차이가 전환율을 결정한다는 것을 배제할 수 없습니다. 빠른 전환율은 병원성 및 부패성 유기체의 성장 위험을 최소화할 수 있습니다. 이들은 종종 원재료에 존재하는 포자 형성 미생물, 예를 들어 바실러스 종입니다25. 이들의 비활성화에는 일반적으로 고온 처리가 사용되지만, 이것은 천연 식물 단백질의 구조와 기술적 기능에 해롭습니다. 따라서 부패 미생물의 성장을 막기 위한 장애물을 줄이는 것이 기술적 기능과 체외 분해에 도움이 될 것입니다. 불쾌한 냄새 제거율은 접종 밀도에 따라 다릅니다. 40% 건조 물질(중량/부피) (2500l)을 처리하는 과정에서 107개의 박테리아 세포/ml를 사용하는 단백질 농축물 1톤의 생물학적 정화 추정치(보충 정보 8 참조)는 세포 밀도가 2.5×109 세포/ml인 발효액 10l가 필요함을 나타냅니다. 산업적 구현을 위해서는 세포 수, 접종 시간, 전체 공정에서의 위치를 최소화하기 위한 최적화가 여전히 필요합니다. 생물 정화 후 유기체의 비활성화에는 일반적으로 열에 민감한 유기체를 사용하기 때문에 저온 살균 단계가 충분합니다.

저희의 연구 결과에 따르면, 특정 바람직한 특성을 가진 균주를 식별할 수 있지만, 선별 과정은 보다 합리적인 접근 방식을 통해 확실히 개선될 수 있습니다. 게놈 기반 효소 및 경로 예측 분석을 사용하면 특정 생물 정화 목적을 위해 선별된 유기체의 수를 줄일 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식은 현재 원치 않는 식물 유래 분자의 미생물 분해에 관여하는 경로에 대한 제한된 지식으로 인해 여전히 제한적입니다. 미생물 생물 다양성을 활용하여 식물성 단백질을 개선하고 적절한 가공 조건을 결합하는 것은 미래의 식물성 식품의 맛을 개선하고 소비자의 수용도를 높이는 데 중요한 역할을 할 것으로 보입니다. 이것은 식물성 식품뿐만 아니라 재조합 단백질(정밀 발효) 또는 배양육을 기반으로 한 식품의 현재 개발에도 적용됩니다. 경제적 이유로 식물성 단백질의 첨가가 점점 더 중요해지고 있습니다.

Methods

Strain and cultivation conditions

A total of 70 lactic acid bacteria and 27 yeast strains from the NIZO culture collection were used. M17 or MRS media were used for routine cultivations of lactococci and lactobacilli, respectively. YPD medium was used for the cultivation of yeasts. Details of the strains and conditions are available in Supplementary Information S12. Unless specified otherwise, all media were supplemented with 0.5% glucose. LAB cultivations prior to biopurification experiments were performed either in 10 ml tubes or 96-well microplates without shaking, while yeast cultivations were performed with 5 ml medium in 50 ml tubes with shaking at 250 rpm. Lactobacilli, streptococci, and lactococci were incubated for 24 h, while leuconostoc and yeast were incubated for 48 h before use. Once fully grown, the cells were harvested and washed with 1 volume of PBS (phosphate-buffered saline) at pH 7.

Plant protein preparation

Plant protein ingredients used were pea protein isolate (Pisane C9, Cosucra), potato protein isolate (Solanic 100, Avebe), almond protein concentrate (Blue Diamond), and oat protein concentrate (PrOatein, Lantmännen). Protein powders were resuspended in RO water at 10% w/w for all proteins, except for potato protein, which was resuspended at 5% w/w. Autoclave sterilization of resuspended protein solutions was performed at 110 °C for 15 min to ensure inactivation of contaminants present in the raw material. For the experiment with high dry matter content a dough-like consistency with 40% dry matter of pea protein was generated. Pea protein was heat treated for 5 h at 140 °C (dry heat) prior to the preparation of the 40% dry matter substrate.

Biopurification with cells

For biopurification sterilized protein solutions were supplemented with washed cells. During screening in 96-well microplates, a 100-fold dilution of fully-grown inoculum was used. This equates to approximately 1E + 07 cells/ml for bacteria and 1E + 06 cells/ml for yeasts. Initial screening was done as single measurements. Sample preparation for sensory and techno-functionality assays was performed with cell densities standardized to approximately 1E + 08 cells/mL for LAB and 1E + 07 cells/ml for yeast. Biopurification was performed at 30 °C for 1 h, unless otherwise specified.

Biopurification with permeabilized cells and enzyme preparations

For biopurification with permeabilized cells, fully-grown L. mesenteroides (LAB 11) were incubated in 50% ethanol for 15 min, and subsequently washed with 1 volume of PBS. Plant protein was incubated with a final concentration of 1E + 08 cells/mL. For biopurification with ADH isolated from S. cerevisiae (300 U/mg, Sigma Aldrich), the enzyme was resuspended in PBS (pH 7) and added at a final concentration of 22.5 U/mL. NADH (Sigma Aldrich) was resuspended in demineralized water and added at the indicated time to a final concentration of 0.4 mM in plant proteins.

GC–MS analysis

Aliquots for GC–MS analysis were stored at −20 °C until analysis. Volatile analysis was performed using headspace solid phase microextraction (HS-SPME) carried out in combination with gas chromatography/mass spectrometry (Fisons, USA) as previously described31. Samples of starting points at time zero (T0) took practically 10–30 min between mixing the protein powders with strains and storing them in the freezer. This is relevant as during this sampling period many compounds were degraded when high cell densities were used.

Sensory analysis

Samples for sensory analysis were prepared as an aqueous drink and a milk analog (an oil-in-water emulsion). For details, see supplementary information.

Data analysis

For data analysis and visualization, Rstudio (2022.07.1 + 554 with R version 4.1.2) and the packages tidyverse v1.3.2, ggplot2 v3.3.6, ComplexHeatmap v2.10.0 and corrplot v0.92 were used.

Data availability

The work presented in this manuscript was carried out in a TKI-supported public-private partnership. The majority of the microbial strains used are owned by NIZO Food Research, a privately held contract research organization. Access to strains, code and data used can be obtained by contacting the corresponding author or info@nizo.com. For commercial use license agreements will need to be negotiated. For academic use NIZO will need to be acknowledged in all communication and free access to generated results needs to be granted. For microbial strains conditions/MTAs will apply.

Code availability

Access to the code used for data analysis can be obtained by contacting the corresponding author or info@nizo.com.

References

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