생균수 측정

[김희중]

과목명	식품위생실험	학점(시간)	1(2)	개설학기	1학년 2학기
실험실습명	식품 중의 생균수 측정			실습 No.	5

식품 중의 생균수 측정

• 식품의 부패정도, 신선도 및 오염도를 측정하는 한 방법
• 검체와 표준한천배지를 페트리접시 중에서 혼합 응고시켜 배양 후 발생한 세균의 집락수로부터 검체 중의 생균수를 산출하는 방법
• 표준평판균수는 검체 중에 존재하는 세균 중 표준한천배지내에서 발육할 수 있는 중온균의 수이다.
• 수질검사시에는 이 균수를 일반세균수라 한다.
• 생균수의 측정에는 membrane filter법 및 희석법 등도 있다.

  1. 사용기구 및 재료

• 기기 및 기구
  • 항온수조, incubator, autoclave, homogenizer 또는 stomacher, colony counter, 천평
  • 비이커, 삼각플라스크, 시험관, 페트리접시(지름 9∼10cm, 높이 1.5cm), 메스실린더, 가위, 핀셋, 시약스푼
• 표준한천배지：Standard Methods Agar(Plate Count Agar)
  • Tryptone 5.0g, Yeast Extract 2.5g, Dextrose 1.0g, Agar 15.0g, 증류수 1,000㎖
• 시약 및 기타 재료
  • NaCl, 70% alcohol, 탈지면

  2. 배지 조제

1. 표준한천배지(standard methods agar) 23.5g을 칭량하고 증류수 1,000㎖를 가하여 잘 흔든다.
2. 중탕으로 가열 용해한다.
3. pH 7.0±0.2으로 조정한 후 autoclave에서 121℃, 15분간 멸균한다.

   

  2. 검체 채취방법

1. 검체가 균질한 상태일 때에는 어느 일부분을 채취하여도 무방하나 불균질한 상태일 때에는 일반적으로 많은 양의 검체를 채취하여야 한다.
2. 가능한 한 검체를 잘 섞어 균질에 가깝도록 하여 검체를 채취하여야 한다.
3. 검체의 채취는 반드시 무균적으로 행하여야 하며 멸균한 용기(유리제용기, 페트리접시 등)에 넣어 원칙적으로 저온(5±3℃)으로 유지시키면서 빨리(검체 채취 후 4시간이내) 검사기관에 운반하여야 하며, 될 수 있는대로 빨리 시험에 착수하여야 한다.
4. 부득이 저온으로 검체를 유지할 수 없거나 즉시 운반이 곤란할 경우에는 반드시 채취일시 및 채취 당시의 검체상태를 상세히 기록하여야 한다. 특히 신선한 어패류와 같이 세균의 증식이 적당한 검체는 채취와 운반에 특히 주의하여야 한다.
5. 검체 채취기구는 미리 핀셋, 스푼, 스파테르 등을 몇개씩 건열 및 화염멸균을 한 다음 검체 1건 마다 바꾸어 가면서 사용하여야 한다.
6. 곡분이나 분유와 같이 건조되어 잘 변질 또는 부패되지 않는 검체는 냉장상태에서 운반할 필요는 없으나 2차오염을 방지하기 위하여 밀봉 또는 밀폐하여야 한다.
7. 냉장운반을 위하여 얼음을 사용할 때에는 2차오염을 방지하기 위하여 얼음이나 그 녹은 물이 검체에 직접 접촉되지 않도록 하여야 한다.
8. 시험에 사용되는 검체의 균질화를 위하여 액상검체인 경우에는 강하게 진탕하여 균질화하고 고형 및 반고형인 검체는 균질기(homogenizer 또는 stomacher)를 이용하여 적당량의 희석액과 혼합하여 균질화한 것을 검액으로 용한다.
9. 칼·도마 및 식기류에서 검체를 채취할 때에는 멸균한 탈지면에 멸균생리식염수를 적셔, 검사하고자 하는 기구의 표면을 완전히 닦아낸 탈지면을 무균용기에 넣어 시험용액으로 사용한다.

  3. 시험용액 조제방법

1. 액상검체：채취된 검체를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.
2. 반유동상검체：채취된 검체를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10∼25㎖)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.
3. 고체검체：채취된 검체의 일정량(10∼25g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른 후 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다. 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100∼250㎖)으로 한 것을 시험용액으로 한다.
4. 고체표면검체：검체표면의 일정면적(보통 100cm²)을 일정량(1∼5㎖)의 멸균생리식염수로 습한 멸균가제와 면봉 등으로 닦아내어 일정량(10∼100㎖)의 멸균생리식염수를 넣고 세게 진탕하여 부착균의 현탁액을 조제하여 시험용액으로 한다.
5. 분말상검체：검체를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.
6. 버터와 아이스크림류：버터와 아이스크림류는 40℃ 이하의 온탕에서 15분내에 용해시켜 10㎖를 취한 후 멸균생리식염수를 가하여 100㎖로 한 것을 시험용액으로 한다.
7. 캅셀제품류：캅셀을 포함하여 검체의 일정량(10∼25g)을 취한 후 9배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.
8. 이와같이 조제된 시험용액에 대해서는 멸균생리식염수를 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1,000배… 희석액을 만들어 사용한다.
9. 시험용액의 조제시 검체를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5∼10cm의 부근까지 70% 알콜 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다.
10. 지방분이 많은 시료는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.
11. 냉동식품은 냉동상태의 검체를 포장된 상태 그대로 40℃ 이하에서 될 수 있는대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올솜으로 잘 닦은 후 상기의 방법으로 시험용액을 조제한다.

    

  4. 접종 및 배양조작

1. 시험용액 1㎖와 각 단계 희석액 1㎖씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하여 약 43∼45℃로 유지한 표준한천배지 약 15㎖를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 검체와 배지를 잘 섞고 냉각응고시킨다.
2. 확산집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3∼5㎖를 가하여 중첩시킨다. 이 경우 검체를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분이상 경과하여서는 안된다.
3. 냉각 응고시킨 페트리접시는 거꾸로 하여 35±1℃에서 24∼48시간(검체에 따라서는 35℃에서 72±3시간) 배양한다.
4. 대조시험으로 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 1㎖를 배지에 가한 것을 대조로 하여 페트리 접시, 희석용액, 배지 및 조작이 무균적이였는지의 여부를 확인한다.

  5. 세균수 기재법

1. 배양후 즉시 집락 계수기를 사용하여 생성된 집락수를 계산하며, 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다.
2. 확산집락이 없고(전면의 1/2 이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판당 30∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다.
3. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9cm의 페트리접시인 경우에는 1cm²내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다.
4. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 낮은 것을 측정하고 반드시 몇개 이하라고 보고한다.
5. 1 평판에 있어서의 집락수를 상당 희석배수로 곱하고 그 수치가 표준평판법에 있어서 1㎖ 중(1g 중)의 세균수 몇개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다.
6. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.