Re: 크랜베리 강화 메밀 발효 결과? 2021

[문형철]

Fermented Cranberry Fortified Buckwheat Product—Phenolic Composition, Antioxidant and Microbiological Properties

by 

Anna Mikulajová

 1,*,

 1

1

Department of Nutrition and Food Quality Assessment, Institute of Food Sciences and Nutrition, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, SK-812 37 Bratislava, Slovakia

2

Department of Food Technology, Institute of Food Sciences and Nutrition, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, SK-812 37 Bratislava, Slovakia

*

Author to whom correspondence should be addressed.

Appl. Sci. 2021, 11(19), 9241; https://doi.org/10.3390/app11199241

Submission received: 19 August 2021 / Revised: 26 September 2021 / Accepted: 29 September 2021 / Published: 4 October 2021

Abstract

This study determined the effect of fermentation by Fresco DVS 1010 starter culture with added probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG and potentially probiotic isolate Lactobacillus plantarum HM1, at fermentation times (0, 8 h) and cold storage period (24 h, 4th day, 7th day, 14th day), on microbial parameters, pH changes, total phenolic content, phenolic compounds profile, and antioxidant activity of buckwheat water- and milk-based mashes, flavored with cranberries and unflavored. The tested starter Fresco culture effectively fermented the buckwheat products and the viable cell counts of potentially probiotic bacteria were sufficient to demonstrate the health-promoting properties of final products. Lactic acid bacteria had a positive impact on total phenolic compound content, total flavonoid content, and antioxidant activity of buckwheat mashes, whereby final values (14 days) were higher by about 16.9–130.8%, 13.4–37.7%, and 14.5–145.9%, respectively, in comparison to initial values (0 h). Seven phenolic acids (gallic, protocatechuic, vanillic, syringic, caffeic, p-coumaric, and ferulic) and two flavonoids (rutin and quercetin) in buckwheat mashes were measured during the experimental period. The content of quercetin, gallic, and protocatechuic acids increased and, conversely, p-coumaric acid decreased, in all products. Prepared buckwheat fermented products have the potential to meet the criteria for potentially functional foods.

이 연구는

프로바이오틱 균주 Lactobacillus rhamnosus GG와

잠재적 프로바이오틱 분리주 Lactobacillus plantarum HM1을 추가한

Fresco DVS 1010 스타터 배양액으로 발효 시 (0, 8시간) 및 저온 보관 기간 (24시간, 4일째, 7일째, 14일째)에

미생물학적 파라미터, pH 변화, 총 페놀 함량, 페놀 화합물 프로파일, 항산화 활성에 미치는 영향을 조사했습니다.

테스트된 Fresco 스타터 배양액은

메밀 제품을 효과적으로 발효시켰으며,

잠재적 프로바이오틱 박테리아의 생존 세포 수는

최종 제품의 건강 증진 특성을 입증하기에 충분했습니다.

젖산균은

메밀 발효액의 총 페놀성 화합물 함량, 총 플라보노이드 함량, 항산화 활성에 긍정적인 영향을 미쳤으며,

최종 값(14일)은 초기 값(0시간)에 비해

각각 약 16.9–130.8%, 13.4–37.7%, 14.5–145.9% 높았습니다.

실험 기간 동안 메밀 발효액에서

7종의 페놀산(갈산, 프로토카테추산, 바닐산, 시링산, 카페인산, p-쿠마르산, 페룰산)과

2종의 플라보노이드(루틴과 케르세틴)가 측정되었습니다.

케르세틴, 갈산, 프로토카테추산의 함량은 증가했으며,

반대로 p-쿠마르산의 함량은 모든 제품에서 감소했습니다.

준비된 메밀 발효 제품은

잠재적으로 기능성 식품의 기준을 충족할 잠재력을 가지고 있습니다.

Keywords: 

fermentation; lactic acid bacteria; probiotic properties; buckwheat; cranberry; phenolic compounds; antioxidant activity; Lactobacillus plantarum; Lactobacillus rhamnosus

1. Introduction

Fermentation is a traditional food processing method employed to improve nutritional and sensory qualities, shelf-life, and safety of final products, in addition to the removal of undesirable components of primary substrate [1,2]. Diverse microorganisms are used to provide specific fermented food products. The largest group of bacteria involved in fermentation processes is lactic acid bacteria (Lactobacillus, Lactococcus, and Pediococcus spp.), yeasts (Candida, Debaryomyces, Hansenula, Pichia, and Saccharomyces spp.), and filamentous fungi (Amylomyces, Aspergillus, Mucor, and Rhizopus spp.) [3,4]. LAB are widely used within the food industry, not only as health promoting cultures, but, due to their growth and metabolism, they also contribute to the safety and stability of final food products [4]. Some strains of LAB have proven beneficial effects on host health via improving intestinal microbial balance. These are called probiotics, which are defined as “live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host” [5]. The most common bacteria used in probiotic preparations are Lactobacillus species such as L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, or Bifidobacterium species such as B. lactis, B. longum, or B. breve [6].

1. 서론

발효는 원료의 불필요한 성분을 제거하는 것 외에도 최종 제품의 영양 및 감각적 특성, 유통 기한, 안전성을 개선하기 위해 사용되는 전통적인 식품 가공 방법입니다 [1,2]. 다양한 미생물이 특정 발효 식품을 생산하기 위해 사용됩니다.

발효 과정에 관여하는 가장 큰 세균 그룹은

젖산균(Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus 속),

효모(Candida, Debaryomyces, Hansenula, Pichia, Saccharomyces 속), 및

필라멘트 곰팡이(Amylomyces, Aspergillus, Mucor, Rhizopus 속)입니다[3,4].

젖산균 -- 젖산

초산균(아세토박터) -- 아세트산(초산)

프로피오니박테리움 -- 포로피온산

클로스트리디움 뷰티리큠 - 뷰티르산(낙산)

칸디다(Candida), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 

1. 에탄올(Ethanol): 사카로마이세스 속 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 당을 발효해 에탄올과 이산화탄소를 생성. 이 과정은 주로 알코올 음료나 빵 발효에 활용.

2. 글리세롤(Glycerol): 일부 효모는 발효 과정에서 글리세롤을 생성. 글리세롤은 발효 식품에 부드러운 질감을 부여, 수분 유지.

3. 유기산(Organic Acids): 피키아나 칸디다 같은 효모는 다양한 유기산(예: 아세트산, 시트르산)을 생성. 

4. 글루칸(Glucan): 데바리오마이세스나 한세눌라 같은 효모는 세포벽에 글루칸을 함유, 이들이 발효 중에 방출되면 식품의 점성.

필라멘트 곰팡이(Amylomyces, Aspergillus, Mucor, Rhizopus 속)

1. 효소(Enzymes):
아밀로마이세스와 아스퍼질러스는 아밀라아제와 같은 전분 분해 효소를 생산. 이를 통해 전분을 당으로 분해해 발효에 필요한 기질을 제공.
뮤코르와 리조푸스 역시 단백질 분해 효소(프로테아제)나 지방 분해 효소(리파아제) 등을 생산하여 발효 식품의 맛과 향, 영양 성분을 개선

2. 유기산(Organic Acids):
아스퍼질러스는 발효 과정에서 구연산(시트르산)을 생산, 이로 인해 식품의 산미와 보존성.

3. 글루칸(Glucan):
일부 곰팡이 균은 글루칸과 같은 다당류를 생산하여 발효 식품의 질감을 개선하고 건강에 이로운 효과

LAB는

식품 산업에서 건강 증진 균주로 사용될 뿐만 아니라,

성장 및 대사 특성으로 인해 최종 식품의 안전성과 안정성에 기여합니다 [4].

일부 LAB 균주는 장내 미생물 균형을 개선함으로써

호스트 건강에 유익한 효과를 나타내며,

이는 “적절한 양으로 투여될 때 호스트에게 건강상의 이점을 제공하는

살아있는 미생물”로 정의되는 프로바이오틱스로 분류됩니다 [5].

프로바이오틱스 제제에 가장 널리 사용되는 세균은

Lactobacillus 속의 L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei 또는 Bifidobacterium 속의 B. lactis, B. longum, B. breve 등입니다 [6].

Cereals and pseudocereals are highly important food sources in the human diet, and represent substantial substrates for the production of fermented foods. Generally, cereals and pseudocereals contribute to the intake of carbohydrates and, as a result, energy and dietary fiber, proteins, minerals, and vitamins, with numerous proven health effects [4]. A variety of technologies are used for cereal processing, but fermentation remains the best choice for improving the quality of proteins by increasing a number of factors, including: the available lysine, methionine, and tryptophan content; protein digestibility by reduction in protease inhibitors; starch digestibility; bioavailability of minerals (iron, zinc, calcium, magnesium) by degradation of phytate; content of B group vitamins; and content of phenolic compounds [4,7,8].

Many of the positive effects on human health of cereals and pseudocereals have been attributed to the presence of phenolic compounds. A valuable source of phenolics is buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench), belonging to pseudocereals. Within the phenolics group, buckwheat grain contains phenolic acids (caffeic, p-coumaric, ferulic, sinapic, gallic, protocatechuic, vanillic, syringic, neochlorogenic, and chlorogenic) and flavonoids (rutin, quercetin, procyanidin B2, catechin, epicatechin gallate, vitexine, isovitexin, orientin, isorientin, and kaempferol) [9,10,11,12,13]).

Polyphenols of buckwheat occur in free, soluble conjugate, and insoluble bound forms, of which the free form is predominant [14,15]. Many additional nutraceuticals, such as phytosterols (β-sitosterol, campesterol, stigmasterol, and isofucosterol), fagopyrins, and lignans also are present in buckwheat [13,16]. The protein content in buckwheat is higher and the amino acid profile is balanced compared to those of commonly used cereals. Lysine and arginine are present in high quantities, resulting in an amino acid score of 100. Buckwheat protein contains little or no gluten, which determines its usefulness for gluten-free diet, i.e., for people suffering from coeliac disease or an allergy to gluten [11,17]. A considerable number of studies have investigated the application of buckwheat in the production of gluten-free products and as a potential substrate for potentially functional foods. Moore et al. [18] investigated buckwheat as a composite flour in the development of gluten-free breads. Feng et al. [19] prepared an antidiabetic functional food from Tartary buckwheat fermented by Lactobacillus plantarum TK9 and L. paracasei TK1501. Zieliński et al. [20] eval‎uated gluten-free muffins based on unfermented and L. plantarum-fermented buckwheat flour. Coman et al. [21] tested the prebiotic potential of buckwheat flour (2%, 4%, and 6% w/v) and oat bran (2% and 4% w/v) in a symbiotic fermented milk formulation. Tested strains of L. paracasei and L. rhamnosus preserved viability for 24 days (the counts of lactobacilli remained above 109 CFU/mL). Additionally, several studies have indicated that buckwheat represents a good substrate for probiotic bacteria and thus for preparation of potentially functional products [22,23,24].

곡물과 가짜 곡물은 인간 식단의 중요한 식품 원천이며,

발효 식품 생산의 주요 원료로 활용됩니다.

일반적으로 곡물과 가짜 곡물은 탄수화물 섭취에 기여하며,

결과적으로 에너지, 식이 섬유, 단백질, 미네랄, 비타민을 공급하며,

다양한 건강 효과가 입증되었습니다 [4].

곡물 가공에는 다양한 기술이 사용되지만,

발효는 단백질 품질을 개선하기 위해 다음과 같은 요소를 증가시켜

가장 우수한 선택으로 남아 있습니다:

가용성 라이신, 메티오닌, 트립토판 함량;

프로테아제 억제제 감소로 인한 단백질 소화율;

전분 소화율;

피틱산 분해로 인한 미네랄(철, 아연, 칼슘, 마그네슘)의 생체 이용률;

B군 비타민 함량;

페놀 화합물 함량 [4,7,8].

the available lysine, methionine, and tryptophan content;

protein digestibility by reduction in protease inhibitors;

starch digestibility;

bioavailability of minerals (iron, zinc, calcium, magnesium) by degradation of phytate;

content of B group vitamins; and

content of phenolic compounds 

곡물과 가짜 곡물의 인간 건강에 대한 많은 긍정적인 효과는

페놀 화합물의 존재에 기인합니다.

페놀 화합물의 귀중한 원천은

가짜 곡물에 속하는 메밀(Fagopyrum esculentum Moench)입니다.

페놀 화합물 그룹 내에서 메밀 곡물은

페놀산(카페인산, p-쿠마르산, 페룰산, 시나픽산, 갈산, 프로토카테추산, 바닐릭, 시링릭, 네오클로로겐산, 클로로겐산)과

플라보노이드(루틴, 케르세틴, 프로시아니딘 B2, 카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 비텍신, 이소비텍신, 오리엔틴, 이소오리엔틴, 카엠페롤)가 포함되어 있습니다 [9,10,11,12,13]).

Within the phenolics group, buckwheat grain contains

phenolic acids (caffeic, p-coumaric, ferulic, sinapic, gallic, protocatechuic, vanillic, syringic, neochlorogenic, and chlorogenic) and

flavonoids (rutin, quercetin, procyanidin B2, catechin, epicatechin gallate, vitexine, isovitexin, orientin, isorientin, and kaempferol)

메밀의 폴리페놀은 자유형, 용해성 결합형, 불용성 결합형으로 존재하며, 이 중 자유형이 주를 이룹니다 [14,15].

메밀에는

피토스테롤(β-시토스테롤, 캠페스테롤, 스티그마스테롤, 이소푸코스테롤), 파고피린, 리간 등

추가적인 영양성분이 풍부하게 함유되어 있습니다 [13,16].

메밀의 단백질 함량은

일반적으로 사용되는 곡물에 비해 높고

아미노산 프로필이 균형 잡혀 있습니다.

라이신과 아르기닌이 다량 함유되어 있어

아미노산 점수가 100점입니다.

메밀 단백질은

글루텐이 거의 또는 전혀 포함되어 있지 않아 글루텐이 함유되지 않은 식단,

즉 셀리악 병이나 글루텐 알레르기가 있는 사람들에게 유용합니다 [11,17].

트랜스글루타미나제 2 (TG2) 효소는 글루텐 펩티드의 탈아미드화를 촉매하여 셀리악병의 발병에 중요한 역할을 합니다. 셀리악병에 걸리기 쉬운 사람에서는 탈아미드화된 펩티드가 면역 반응을 일으켜 셀리악병으로 진행됩니다. 여러 연구에서 셀리악병 환자의 부작용을 방지하기 위해 젖산 발효와 효소 첨가를 통해 글루텐을 분해하는 방법이 연구되었습니다. 완전한 글루텐 분해를 위한 가공 과정은 일반적으로 강렬하며, 글루텐을 함유한 제품과 유사한 특성을 가진 제품을 생산하기 어렵습니다. 우리는 글루텐의 불완전한 분해가 TG2 결합 부위의 가용성을 증가시켜 부정적 영향을 미칠 수 있다는 점을 우려합니다. 따라서 우리는 α2-글리아딘 내 TG2 결합 모티프 QLP의 가용성을 측정하는 동시에 TG2 매개 트랜스아미다이션을 추정함으로써, 밀 가루에서 젖산 발효가 TG2의 글루텐 단백질 결합 잠재력에 미치는 영향을 조사했습니다. 밀가루를 슬러리 형태로 또는 사워도우 빵의 일부로 유산 발효시킨 결과, 일차 아민 존재 하에서 TG2 매개 트랜스아미다이션이 효율적인 수준(발효 전 밀가루의 73%–102%)로 감소하지 않았음을 보여주었습니다. 또한, 유산 발효는 사워도우 빵에서 α2-글리아딘의 사용 가능한 TG2 결합 모티프 QLP를 셀리악병 환자에게 안전한 식품에 사용할 수 있는 수준으로 충분히 감소시키지 않았습니다 (발효되지 않은 대조군의 73%~122%). 우리는 밀가루의 젖산 발효가 발효되지 않은 밀가루에 비해 TG2와 글루텐의 상호 작용을 충분히 방지하지 못하고, α2-글리아딘에 존재하는 TG2 결합 부위를 충분히 감소시키지 못한다고 결론지었습니다. L. plantarum을 사용하여 발효 시간을 연장한 경우(24시간)에는 α2-글리아딘에 존재하는 TG2 결합 부위가 오히려 증가하여, 젖산 발효는 셀리악병 환자에게 안전한 제품을 만드는 데 적합한 방법이 아닐 수도 있음을 나타냅니다.

많은 연구에서 메밀을 글루텐 프리 제품 생산 및 잠재적 기능성 식품의 원료로 활용하는 것을 조사했습니다.

Moore 등 [18]은 글루텐 프리 빵 개발을 위해 메밀을 복합 분말로 사용했습니다.

Feng 등 [19]은

Lactobacillus plantarum TK9와 L. paracasei TK1501로

발효된 타르타리 보리를 사용하여 항당뇨 기능성 식품을 제조했습니다.

Zieliński 등 [20]은

발효되지 않은 메밀 가루와

L. plantarum로 발효된 메밀 가루를 기반으로 한 글루텐 프리 머핀을 평가했습니다.

Coman 등 [21]은 공생 발효 우유 제형에서 메밀 가루 (2%, 4%, 6% w/v)와 오트 브랜 (2%, 4% w/v)의 프리바이오틱 잠재력을 테스트했습니다. L. paracasei 및 L. rhamnosus 균주는 24일 동안 생존력을 유지했으며(락토바실러스 수치가 109 CFU/mL 이상 유지됨).

Because of its favorable nutritional and nutraceutical characteristics, buckwheat flour was selected as a substrate for fermentation and for fortification with cranberries to increase the level of phenolic compounds. Cranberries are rich in flavonoids, such as anthocyanins (glucosides, galactosides, and arabinosides of delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin, and malvidin), flavanols (procyanidins A, catechin, and epicatechin), favonols (glycosides of quercetin, kaempferol, and myricetin), and phenolic acids (gallic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, sinapic, and ellagic acids) [25,26,27,28].

The influence of fermentation on food phenolics has been eval‎uated in various studies [7,29,30,31,32], with differences in microorganisms used, food matrixes, and fermentation conditions such as temperature and duration. In our study, fermentation behavior, considering microbial parameters and pH changes, total phenolic content, phenolic profile, and antioxidant activity, was assessed during the fermentation process following a cold storage period of 14 days. The extensive potential indicated in previous research and the development of new functional gluten-free products led us to prepare fermented buckwheat products with probiotic potential that are suitable not only for celiac patients and people suffering from allergies to gluten, but also as functional products with health and preventive characteristics.

또한 여러 연구에서

메밀이 프로바이오틱 박테리아의 좋은 배지이며

따라서 잠재적으로 기능성 제품 제조에 적합하다는 것이 밝혀졌습니다 [22,23,24].

영양학적 및 기능성 특성이 우수하기 때문에

메밀 가루는 발효 기질로 선택되었으며,

크랜베리로 강화하여 페놀 화합물 함량을 증가시키기 위해 사용되었습니다.

크랜베리는

플라보노이드, 안토시아닌(글루코사이드, 갈락토사이드, 아라비노사이드 형태의 델피니딘, 시아니딘, 페투니딘, 페오니딘, 말비딘),

플라바놀(프로시아니딘 A, 카테킨, 에피카테킨),

파보놀(퀘르세틴, 카엠페롤, 미리세틴의 글루코사이드),

페놀산(갈산, 클로로겐산, 카페인산, p-쿠마르산, 페룰산, 시나픽산, 엘라직산) 등이

풍부합니다 [25,26,27,28].

Cranberries are rich in flavonoids, such as anthocyanins (glucosides, galactosides, and arabinosides of delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin, and malvidin),

flavanols (procyanidins A, catechin, and epicatechin),

favonols (glycosides of quercetin, kaempferol, and myricetin), and

phenolic acids (gallic, chlorogenic, caffeic, p-coumaric, ferulic, sinapic, and ellagic acids) 

발효가

식품 페놀 성분에 미치는 영향은 다양한 연구에서 평가되었습니다 [7,29,30,31,32],

사용된 미생물,

식품 매트릭스,

발효 조건(온도 및 기간) 등에 따라 차이가 있었습니다.

본 연구에서는

미생물학적 파라미터와 pH 변화, 총 페놀 함량, 페놀 프로파일, 항산화 활성을 고려한 발효 행동을

14일간의 냉장 보관 후 발효 과정 동안 평가했습니다.

이전 연구에서 밝혀진 광범위한 잠재력과 새로운 기능성 글루텐 프리 제품의 개발로 인해,

셀리악병 환자 및 글루텐 알레르기가 있는 사람뿐만 아니라

건강 및 예방 효과가 있는 기능성 제품으로 적합한

프로바이오틱스 잠재력이 있는 발효 메밀 제품을 개발하게 되었습니다.

2. Materials and Methods

2.1. Microorganism

A Fresco DVS 1010 starter culture consisting of Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, and Streptococcus thermophilus (commercial culture from Christian and Hansen, Hørsholm, Denmark) was kindly provided by Rajo, a.s. (Bratislava, Slovakia). The Fresco culture was kept in a deep-freezer. The starter culture of Fresco DVS 1010 was stored aerobically overnight at 30 ± 0.5 °C in M17 broth (Biokar Diagnostics, Beauvais, France).

The probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (isolation source—fecal samples of a healthy adult) was provided by Drs. Salminen and Ouwehand (University of Turku, Turku, Finland), through the mediation of Dr. Lauková (State Veterinary and Food Institute, Košice, Slovakia). A potentially probiotic isolate Lactobacillus plantarum HM1 was isolated from breast milk and identified by Liptáková et al. [33]. L. rhamnosus GG and L. plantarum HM1 were maintained in de Man Rogosa Sharpe (MRS) broth (Biokar Diagnostics, Beauvais, France). Starter cultures of L. rhamnosus GG and L. plantarum HM1 were obtained by overnight incubation at 37 ± 0.5 °C (5% CO2) in MRS broth. Pure cultures of studied lactic acid bacteria were centrifuged (6000 rpm for 5 min, Centrifuge EBA 20, Hettichlab, Tuttlingen, Germany); pellets of the cells were washed in 10 mL of sterile distilled water and centrifuged again under the same conditions. After centrifugation, the supernatant was removed and pellets were re-suspended in distilled water to its original volume, in compliance with the procedure of Matejčeková et al. [34].

2.2. Enumeration of Bacteria

Each 2 h during the fermentation and each day during the cold storage, serial ten-fold dilutions of samples of buckwheat mashes were prepared by rinsing with sterile saline solution (Biolife, Milan, Italy). The presumptive numbers of the cocci of Fresco culture were enumerated on M17 agar plates (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) according to EN ISO 15214 [35]. Inoculated Petri dishes were cultivated for 24 h (30 ± 0.5 °C), aerobically. Presumptive numbers of L. plantarum HM1 and L. rhamnosus GG were estimated using Vegiton MRS agar (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland). Inoculated Petri dishes were cultivated at anaerobic conditions at 37 ± 0.5 °C (5% CO2) [34].

2.3. Eval‎uation of Growth and Metabolic Parameters

Growth and metabolic parameters (specific growth rate, rate constant for decrease in counts, rate constant for decrease in pH, lag time duration) of the studied lactic acid bacteria in buckwheat mashes were fitted and calculated using the mechanistic model DMFit by Baranyi and Roberts [36]. Growth and metabolic parameters were calculated from each growth curve. Specific growth rates μ (1/h) were recalculated from the log10-based growth rates (GR) according to the equation μ = ln 10 × GR.

The pH values of the samples were monitored during fermentation and storage period using a pH meter with a penetration electrode (Knick Portamess, Berlin, Germany) calibrated with buffers at pH 4.0, 7.0, and 10.0 (Fisher Scientific, Loughborough, UK).

2.4. Preparation of Buckwheat Substrate

The buckwheat mash used as a substrate was prepared from buckwheat flour (ash (1.52% (w/w)), fat (2.12% (w/w)), proteins (8.31% (w/w)), reducing sugars (2.31% (w/w)); Kroner, Ltd., Bratislava, Slovakia), distilled water, or UHT milk (fat content 1.5%) (Rajo, a.s., Bratislava, Slovakia). To achieve optimal consistency of final products for consumption by spoon, the content of flour was 9.6% (w/v) in milk- and 9% (w/v) in water- based mash with the addition of sucrose in a concentration of 2% (w/v), in both. Weighed components as mentioned above were heated with stirring at 100 °C for 20 min, and then sterilized at 121 °C for 20 min. After sterilization the mashes were cooled and sterilized lyophilized cranberry powder (2.5 g/100 g) was added to flavor the samples. The sterility of prepared samples was regularly confirmed by the plating method prior to the inoculation.

2.5. Samples Fermentation

One hundred grams of sterile mashes was inoculated using Fresco DVS 1010 culture (5% (v/v)) to achieve inoculation levels of approximately 6 log CFU/mL. Static fermentation was performed at 37 ± 0.5 °C for 8 h (5% CO2). After this period, L. plantarum HM1 and L. rhamnosus GG (10% (v/v)) were singly inoculated (cell counts of approximately 8–9 log CFU/mL) into fermented samples and stored at 6 ± 0.5 °C for another 14 days with periodical determination of pH values and viability of studied bacteria. The experiments were carried out in duplicate.

Unfermented samples and samples after 8 h, 24 h, 4 days, 7 days, and 14 days underwent extraction procedures, and analyses of phenolic composition and antioxidant activity.

2.6. Extraction Procedure

Firstly, samples were freeze-dried and subsequently extracted with 65% ethanol (80 °C, 1 h, three times) [37]. Phenolic compounds were separated using ethyl acetate (Centralchem, Bratislava, Slovak Republic) from combined extracts. After solvent evaporation, the residues were reconstituted in 96% ethanol, and stored at −24 °C until further analysis.

2.7. Analysis of Total Phenolic Compounds

The total content of phenolic compounds was analyzed using Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) according to Yu et al. [38], with minor modifications, as described previously by Mikulajová et al. [39]. The standard calibration curve prepared for gallic acid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) was used for calculation of total phenol content. Results are expressed as mg of gallic acid equivalent per gram of sample (mg GAE/g).

2.8. Analysis of Total Flavonoids

The total flavonoid content was analyzed using the AlCl3 method described by Kreft et al. [40]. The formed colored products were measured at 420 nm after 30 min. Quercetin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) was used as a standard. Results were expressed in mg of quercetin equivalent per gram of sample (mg QE/g).

2.9. Analysis of Individual Phenolic Compounds

Individual phenolic compounds were identified and quantified by high-performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC/DAD, Agilent 1200 Series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) analysis. Chromatographic separations were performed on a Zorbax Eclipse XDB-C18 column (4.6 × 150 mm, 5 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) using a gradient system of elution with solvent flow rate of 1 mL/min. The solvent system selected for elution was water/acetic acid adjusted to pH 2.8 (solvent A) and acetonitrile (solvent B). The solvent A/solvent B ratio was changed from 95/5 to 70/30. Detection was carried out at 272 and 350 nm, respectively. Standard curves of individual phenolic compounds were prepared and used for identification and quantification of phenolic compounds in our samples using ChemStation software 12.2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Results were expressed as µg per gram of sample (µg/g).

2.10. Analysis of Antioxidant Activity

The antioxidant activity was assessed by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) assay measured according to Yen and Chen [41] with modifications, as explained previously by Mikulajová et al. [39]. Sample extracts were allowed to react with DPPH solution for 10 min. Discoloration was measured at 517 nm. DPPH solution in 96% ethanol (c = 0.12 mg/mL) was used to prepare the calibration curve. Results were expressed as the amount of scavenged DPPH radicals per gram of sample (mg DPPH/g).

2.11. Statistical Analysis

Fermentation experiments and extractions were carried out in duplicate and remaining analyses were performed in triplicate. The results were reported as means ± standard deviation. Statistical analyses were carried out using Microsoft Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA). Data were analyzed by Student’s t-test (microbial parameters, total phenolic compounds, total flavonoids, and antioxidant activity), one-way analysis of variance, and Fisher’s LSD procedure (individual phenolic compounds) at the p = 0.05 significance level. A Pearson correlation analysis was used for eval‎uating the strength of the correlations between the analyzed parameters. The results were also submitted to principal component analysis (PCA). This multivariate statistical method was used to display patterns of studied parameters in the reduced dimensions of 3 newly obtained coordinates (PC—principal components)—PC1, PC2 and PC3. The number of components was chosen on the basis of Kaiser’s criterion, also called the eigenvalue-one criterion. According to this criterion, any component with an eigenvalue greater than 1.00 is retained and interpreted [42]. Statistical analyses were conducted using Statgraphic Plus, Version 3.1 (Statsoft; Tulsa, OK, USA) software.

2. 재료 및 방법

2.1. 미생물

Fresco DVS 1010 스타터 배양액(Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Streptococcus thermophilus로 구성, 덴마크 Hørsholm의 Christian and Hansen에서 공급받은 상업용 배양액)은 슬로바키아 Bratislava의 Rajo, a.s.에서 제공받았습니다. Fresco 배양액은 심층 냉동고에 보관되었습니다. Fresco DVS 1010 스타터 배양액은 프랑스 Beauvais의 Biokar Diagnostics에서 공급받은 M17 배지(Biokar Diagnostics, Beauvais, France)에서 30 ± 0.5 °C에서 공기 중 배양으로 밤새 보관되었습니다.

프로바이오틱 균주 Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (분리 원천—건강한 성인의 분변 샘플)는 핀란드 투르쿠 대학교의 Salminen 및 Ouwehand 박사로부터 슬로바키아 코시체에 위치한 국가 수의 및 식품 연구소의 Lauková 박사의 중재를 통해 제공되었습니다. 잠재적 프로바이오틱 균주 Lactobacillus plantarum HM1은 모유에서 분리되어 Liptáková 등 [33]에 의해 식별되었습니다. L. rhamnosus GG와 L. plantarum HM1은 de Man Rogosa Sharpe (MRS) 배지 (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)에서 유지되었습니다. L. rhamnosus GG 및 L. plantarum HM1의 스타터 배양액은 MRS 배지에서 37 ± 0.5 °C (5% CO2)에서 밤새 배양하여 얻었습니다. 연구 대상 유산균의 순수 배양주는 6000 rpm에서 5분간 원심분리(Centrifuge EBA 20, Hettichlab, Tuttlingen, 독일) 후, 세포 침전물을 무균 증류수 10 mL로 세척하고 동일한 조건에서 다시 원심분리했습니다. 원심 분리 후 상층액을 제거하고 침전물을 증류수에 원래 부피로 재현탁시켰으며, 이는 Matejčeková 등 [34]의 절차에 따라 수행되었습니다.

2.2. 세균 수 측정

발효 중 2시간마다 및 냉장 보관 중 매일, 메밀 반죽 시료의 연속 10배 희석액을 무균 생리식염수(Biolife, Milan, Italy)로 씻어 준비했습니다. Fresco 배양액의 구균 추정 수는 EN ISO 15214 [35]에 따라 M17 agar plate (Biokar Diagnostics, Beauvais, France)에 배양하여 계수했습니다. 접종된 페트리 접시는 30 ± 0.5 °C에서 24시간 동안 공기 중 배양되었습니다. L. plantarum HM1 및 L. rhamnosus GG의 추정 수는 Vegiton MRS agar (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland)를 사용하여 추정되었습니다. 접종된 페트리 접시는 37 ± 0.5 °C (5% CO2)의 무산소 조건에서 배양되었습니다 [34].

2.3. 성장 및 대사 매개변수 평가

연구 대상 유산균의 메밀 퓌레에서의 성장 및 대사 파라미터(특정 성장 속도, 세포 수 감소 속도 상수, pH 감소 속도 상수, 지연 시간)는 Baranyi와 Roberts [36]의 기계적 모델 DMFit을 사용하여 적합시키고 계산되었습니다. 성장 및 대사 파라미터는 각 성장 곡선으로부터 계산되었습니다. 특정 성장 속도 μ (1/h)는 로그10 기반 성장 속도 (GR)로부터 다음 방정식 μ = ln 10 × GR에 따라 재계산되었습니다.

시료의 pH 값은 발효 및 보관 기간 동안 침투 전극(Knick Portamess, Berlin, Germany)을 사용한 pH 측정기로 모니터링되었으며, pH 4.0, 7.0, 10.0의 완충액(Fisher Scientific, Loughborough, UK)으로 교정되었습니다.

2.4. 메밀 기질의 준비

기질로 사용된 메밀 반죽은

메밀 가루(재분(1.52% (w/w)), 지방(2.12% (w/w)), 단백질(8.31% (w/w)), 환원당(2.31% (w/w))); Kroner, Ltd., Bratislava, Slovakia), 증류수 또는 UHT 우유(지방 함량 1.5%)(Rajo, a.s., Bratislava, Slovakia)를 혼합하여 제조되었습니다.

최종 제품의 스푼으로 섭취하기에 최적의 점도를 달성하기 위해,

우유 기반 반죽에는 밀가루 함량을 9.6% (w/v),

물 기반 반죽에는 9% (w/v)로 조정하고,

두 경우 모두 2% (w/v) 농도의 설탕을 추가했습니다.

위에서 언급된 성분을 계량하여

100°C에서 20분간 저어 가며 가열한 후,

121°C에서 20분간 살균했습니다.

살균 후 반죽을 냉각시키고,

맛을 내기 위해 살균된 동결건조 크랜베리 분말(2.5g/100g)을 추가했습니다.

준비된 시료의 무균 상태는 접종 전 배양판 배양법으로 정기적으로 확인했습니다.

2.5. 시료 발효

멸균된 퓌레 100g에 Fresco DVS 1010 배양액 (5% (v/v))을 접종하여 약 6 log CFU/mL의 접종 농도를 달성했습니다. 37 ± 0.5 °C에서 5% CO2 조건 하에 8시간 동안 정적 발효를 진행했습니다. 이 기간 후, L. plantarum HM1과 L. rhamnosus GG (10% (v/v))를 각각 접종(세포 수 약 8–9 log CFU/mL)한 발효 시료를 6 ± 0.5 °C에서 추가로 14일 동안 보관하며, 주기적으로 pH 값과 연구 대상 세균의 생존율을 측정했습니다. 실험은 이중으로 수행되었습니다.

발효되지 않은 시료와 8시간, 24시간, 4일, 7일, 14일 후의 시료는 추출 절차를 거쳤으며, 페놀 성분 분석 및 항산화 활성 분석이 수행되었습니다.

2.6. 추출 절차

먼저 시료를 동결 건조한 후 65% 에탄올 (80 °C, 1시간, 3회)로 추출했습니다 [37]. 페놀성 화합물은 중앙켐(Centralchem, 브라티슬라바, 슬로바키아 공화국)의 에틸 아세테이트를 사용하여 결합된 추출물로부터 분리되었습니다. 용매 증발 후 잔여물은 96% 에탄올에 재용해되어 추가 분석까지 −24°C에서 보관되었습니다.

2.7. 총 페놀성 화합물 분석

페놀 화합물의 총 함량은 Yu et al. [38]의 방법을 약간 수정하여 Mikulajová et al. [39]이 이전에 설명한 대로 Folin-Ciocalteu 시약 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)을 사용하여 분석했습니다. 갈산 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)을 위한 표준 교정 곡선을 사용하여 총 페놀 함량을 계산했습니다. 결과는 시료 1g당 갈산 등가량(mg GAE/g)으로 표시되었습니다.

2.8. 총 플라보노이드 분석

총 플라보노이드 함량은 Kreft 등[40]이 설명한 AlCl3 방법을 사용하여 분석되었습니다. 형성된 유색 제품은 30분 후 420nm에서 측정되었습니다. 표준으로 케르세틴(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)이 사용되었습니다. 결과는 시료 1g당 케르세틴 등가량(mg QE/g)으로 표시되었습니다.

2.9. 개별 페놀 화합물 분석

개별 페놀 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 다이오드 어레이 검출기(DAD)를 사용한 분석(Agilent 1200 시리즈, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 통해 식별 및 정량화되었습니다. 크로마토그래픽 분리는 Zorbax Eclipse XDB-C18 컬럼(4.6 × 150 mm, 5 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 용매 유속 1 mL/min의 그라디언트 용출 시스템으로 수행되었습니다. 용출에 사용된 용매 시스템은 pH 2.8로 조정된 물/초산(용매 A)과 아세토니트릴(용매 B)이었습니다. 용매 A/용매 B 비율은 95/5에서 70/30으로 변경되었습니다. 검출은 각각 272 nm와 350 nm에서 수행되었습니다. 개별 페놀 화합물의 표준 곡선이 작성되어 ChemStation 소프트웨어 12.2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 시료 내 페놀 화합물의 식별 및 정량화에 사용되었습니다. 결과는 시료 1g당 마이크로그램(µg/g)으로 표시되었습니다.

2.10. 항산화 활성 분석

항산화 활성은 Yen과 Chen [41]의 방법을 수정하여 Mikulajová 등 [39]이 설명한 대로 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 자유 라디칼 (DPPH) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) 검정을 통해 평가되었습니다. 시료 추출물은 DPPH 용액과 10분 동안 반응시켰습니다. 변색은 517 nm에서 측정되었습니다. DPPH 용액(96% 에탄올, c = 0.12 mg/mL)을 사용하여 교정 곡선을 준비했습니다. 결과는 시료 1g당 제거된 DPPH 라디칼의 양(mg DPPH/g)으로 표시되었습니다.

2.11. 통계 분석

발효 실험과 추출은 이중으로 수행되었으며, 나머지 분석은 삼중으로 수행되었습니다. 결과는 평균 ± 표준 편차로 보고되었습니다. 통계 분석은 Microsoft Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 Student's t-검정 (미생물학적 파라미터, 총 페놀 화합물, 총 플라보노이드, 항산화 활성), 일원 분산 분석, 및 Fisher's LSD 절차 (개별 페놀 화합물)를 사용하여 p = 0.05 유의수준에서 분석되었습니다. 분석된 매개변수 간의 상관관계의 강도를 평가하기 위해 피어슨 상관분석을 사용했습니다. 또한, 그 결과를 주성분 분석(PCA)에 제출했습니다. 이 다변량 통계 방법은 새로 얻은 3개의 축소 차원(PC—주성분)인 PC1, PC2 및 PC3에서 연구된 매개변수의 패턴을 표시하기 위해 사용되었습니다. 구성 요소의 수는 카이저의 기준, 즉 고유값 1 기준에 따라 선택되었습니다. 이 기준에 따르면, 고유값이 1.00을 초과하는 모든 성분은 유지되고 해석됩니다 [42]. 통계 분석은 Statgraphic Plus, Version 3.1 (Statsoft; Tulsa, OK, USA) 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

3. Results

3.1. Fermentation Process

In our study, eight plant-based mashes with probiotic potential were prepared using mixed Fresco DVS 1010 starter culture 5% (v/v). A short fermentation time (8 h) was preferable to minimize the risk of contamination. Fresco culture immediately entered the exponential phase of growth with specific growth rates of 0.66 and 0.87 1/h in water- and milk-based mash, respectively. The higher specific growth rate in milk-based mash can be explained by the higher content of nutrients in milk, which can serve as a substrate for the growth and metabolism for the cocci of the Fresco culture. In flavored mashes with added cranberries, specific growth rates were about 20% lower compared to unflavored samples. Nonetheless, the levels of the cocci of the Fresco in mashes with dried cranberries reached densities of 8–9 log CFU/mL after 8 h, representing 2–3 log unit increases compared to the initial state. This indicates an optimal fermentation condition for the growth of cocci and buckwheat media provided all of the desired nutrients. The metabolic activity of Fresco culture during the fermentation process resulted in a decrease in pH levels to 4.42 and 5.06 in water- and milk-based products, respectively (decrease of about 2.0 and 1.6 units). The calculated rate constants for the decrease in pH were −0.45 and −0.20 1/h in water and milk products, respectively. In cranberry-flavored mashes, acid production during fermentation was lower, representing a decrease of 1.03 and 1.25 units compared to the initial state, with the rates of −0.12 and −0.17 1/h in milk- and water-based products, respectively. Addition of cranberry powder to the flavored samples resulted in lower initial pH values of flavored samples (5.5 and 5.4 in water- and milk-based cranberry products). The different fermentation rates of pH decrease can be attributed to the differences in prepared buckwheat media; thus, their usefulness is best limited to relative comparisons within a specific substrate. Within the cold storage period, pH values reached after fermentation remained almost constant within the storage period, and after 14 days of cold storage, pH values in milk buckwheat mashes ranged from 4.31 to 4.99, and in water-based mashes from 4.01 to 4.33. To achieve health benefits, probiotic products are expected to support the growth and survival of probiotic strains with the minimum level of 6 log CFU/mL at the expiration date of the products [4]. Therefore, the cell counts of potentially probiotic isolate L. plantarum HM1 and probiotic strain L. rhamnosus GG were eval‎uated (Table 1). In general, bacterial counts in samples were well maintained above the limit of 6 log CFU/mL, with the exception of L. plantarum HM1 in water product with cranberries. This fact can be explained by the lower pH reached at the end of the cold storage period (pH 4.01). The antimicrobial effect of added cranberries may also be taken into account [43]. Despite the decline in levels of L. plantarum HM1 of about 3.2 log units within 14 days, the counts remained above the level of 5 log CFU/mL, the minimum level of probiotics suggested by some authors [44].

3.1. 발효 과정

본 연구에서는 프로바이오틱스 잠재성을 가진 8종의 식물 기반 맥주를 Fresco DVS 1010 혼합 스타터 배양액 5% (v/v)를 사용하여 제조했습니다. 오염 위험을 최소화하기 위해 짧은 발효 시간(8시간)이 선호되었습니다. Fresco 배양액은 물 기반 맥주와 우유 기반 맥주에서 각각 0.66과 0.87 1/h의 특정 성장 속도로 즉시 지수 성장 단계에 진입했습니다. 우유 기반 맥아에서 더 높은 특정 성장 속도는 우유의 높은 영양소 함량 때문으로, 이는 Fresco 배양액의 구균 성장 및 대사 과정의 기질로 작용할 수 있습니다. 크랜베리를 추가한 향미 맥아에서는 무향 샘플에 비해 특정 성장 속도가 약 20% 낮았습니다. 그러나 건조 크랜베리가 첨가된 맥아에서 Fresco의 구균 밀도는 8시간 후 8–9 log CFU/mL에 달했으며, 이는 초기 상태 대비 2–3 log 단위 증가를 나타냈습니다. 이는 모든 필요한 영양소가 공급되었을 때 Fresco의 구균 성장과 메밀 배지 간의 최적 발효 조건을 의미합니다. Fresco 배양액의 발효 과정 중 대사 활동은 물 기반 제품과 우유 기반 제품에서 pH 수준이 각각 4.42와 5.06으로 감소했습니다(약 2.0과 1.6 단위 감소). pH 감소의 계산된 속도 상수는 물과 우유 제품에서 각각 −0.45와 −0.20 1/h였습니다. 크랜베리 향이 첨가된 발효액에서는 발효 중 산 생성량이 감소했으며, 초기 상태 대비 각각 1.03과 1.25 단위 감소했으며, 우유 기반 및 물 기반 제품에서 각각 −0.12와 −0.17 1/h의 속도를 나타냈습니다. 크랜베리 가루를 향미 시료에 추가하면 향미 시료의 초기 pH 값이 낮아졌으며(물 기반 및 우유 기반 크랜베리 제품에서 각각 5.5와 5.4). pH 감소 속도의 차이는 준비된 메밀 배지의 차이에서 기인하며, 따라서 그 유용성은 특정 기질 내 상대적 비교에 한정됩니다. 냉장 보관 기간 동안 발효 후 pH 값은 보관 기간 내내 거의 일정하게 유지되었으며, 14일 후 냉장 보관 시 우유 메밀 반죽의 pH 값은 4.31에서 4.99 사이, 물 기반 반죽의 pH 값은 4.01에서 4.33 사이였습니다. 건강 혜택을 달성하기 위해 프로바이오틱스 제품은 제품의 유통기한 시점에 프로바이오틱스 균주의 성장과 생존을 지원하기 위해 최소 6 log CFU/mL의 수준을 유지해야 합니다 [4]. 따라서 잠재적 프로바이오틱스 분리주 L. plantarum HM1과 프로바이오틱스 균주 L. rhamnosus GG의 세포 수를 평가했습니다 (표 1). 일반적으로 시료의 세균 수는 6 log CFU/mL 한계를 초과하여 잘 유지되었으며, 크랜베리가 함유된 물 제품의 L. plantarum HM1을 제외했습니다. 이 사실은 냉장 보관 기간 종료 시 달성된 낮은 pH(pH 4.01)로 설명될 수 있습니다. 추가된 크랜베리의 항균 효과도 고려될 수 있습니다[43]. L. plantarum HM1의 수치가 14일 동안 약 3.2 log 단위 감소했음에도 불구하고, 수치는 일부 저자들이 제안한 프로바이오틱스의 최소 수준인 5 log CFU/mL 이상으로 유지되었습니다 [44].

Table 1. Parameters eval‎uating behavior of L. plantarum HM1 and L. rhamnosus GG at 6 ± 0.5 °C for 14 days added after fermentation (8 h).

3.2. Total Phenolic Content

The contents of total phenolic compounds in eval‎uated mashes are presented in Table 2. During the whole fermentation process, the total quantity of phenolic compounds was higher in all tested samples in comparison to unfermented samples. Some differences in the course of changes in phenolic compounds were found in individual stages of fermentation. After fermentation with Fresco culture (8 h), increases were observed in phenolics of about 9.4% and 48.9% in mashes with cranberries, and of about 20.5% and 52.6% in unflavored mashes were observed. In subsequent stages, only moderate changes were achieved, which are probably due to storage at a lower temperature after 8 h (at 6 °C instead of 37 °C). The increasing trend of phenolic content was maintained until the end of storage in mashes to which L. plantarum HM1 was added. An exception was noted in the water-based cranberry product, where the decrease in phenols after 24 h and 4 days of storage period was seen, followed by a repeated increase in the next period. However, the final phenolic levels (0.737 mg GAE/g) did not exceed the level of fermentation at 8 h (0.887 mg GAE/g). A similar trend was also observed in the same matrices with L. rhamnosus GG. In remaining samples with L. rhamnosus GG, the effect of the fermentation process on phenolic content varied. The decrease and subsequent increase in total phenolics were noted after 24 h and 7 days in unflavored milk- and water-based mash, respectively. The quantity of phenols in milk-based cranberry mash increased during the whole experimental period. The initial values (in unfermented samples) of total phenolics ranged from 0.154 to 0.596 mg GAE/g and final products reached values in the range from 0.254 to 0.737 mg GAE/g, representing an increase of 1.2–2.3-fold. Water products contained higher amounts of phenols than milk products (about 31.6%, on average), as did products enriched with cranberries compared to unflavored products (about 70.7%, on average). Mashes with L. plantarum HM1 reached a significantly higher (p < 0.05) total phenolic content (after 14 days) than mashes with L. rhamnosus GG.

3.2. 총 페놀 함량

평가된 발효액의 총 페놀 화합물 함량은 표 2에 제시되어 있습니다. 발효 과정 전체 동안 모든 시험 시료의 총 페놀 화합물 함량은 발효되지 않은 시료에 비해 높았습니다. 발효 과정의 개별 단계에서 페놀성 화합물의 변화 경향에 일부 차이가 관찰되었습니다. Fresco 배양액으로 발효 후(8시간), 크랜베리 함유 맥아에서는 페놀성 화합물이 약 9.4%와 48.9% 증가했으며, 무향 맥아에서는 약 20.5%와 52.6% 증가했습니다. 후속 단계에서는 온도 저하(37°C 대신 6°C)로 인한 저장 조건 변화로 인해 변화가 미미했습니다. L. plantarum HM1을 추가한 맥아에서는 저장 종료 시까지 페놀성 화합물 함량의 증가 추세가 유지되었습니다. 수분 기반 크랜베리 제품에서는 예외적으로 저장 기간 24시간 및 4일 후 페놀 함량이 감소한 후 다음 기간에 다시 증가하는 현상이 관찰되었습니다. 그러나 최종 페놀 함량(0.737 mg GAE/g)은 발효 8시간 시점(0.887 mg GAE/g)의 수준을 초과하지 않았습니다. L. rhamnosus GG를 사용한 동일한 매트릭스에서도 유사한 경향이 관찰되었습니다. L. rhamnosus GG를 사용한 나머지 시료에서는 발효 과정이 페놀 함량에 미치는 영향이 다양했습니다. 무향 우유 기반 및 물 기반 퓨레에서 각각 24시간 후와 7일 후 총 페놀 함량의 감소와 이후 증가가 관찰되었습니다. 우유 기반 크랜베리 퓨레의 페놀 함량은 실험 기간 내내 증가했습니다. 발효 전 시료의 총 페놀 함량 초기 값은 0.154~0.596 mg GAE/g이었으며, 최종 제품에서는 0.254~0.737 mg GAE/g 범위에 이르러 1.2~2.3배 증가했습니다. 물 제품에는 우유 제품보다 페놀 함량이 높았으며(평균 약 31.6%), 크랜베리 강화 제품도 무향 제품보다 높았습니다(평균 약 70.7%). L. plantarum HM1을 함유한 퓌레는 L. rhamnosus GG를 함유한 퓌레보다 14일 후 총 페놀 함량이 유의미하게 높았습니다(p < 0.05).

Table 2. Total phenolic content of buckwheat mashes (mg GAE/g).

3.3. Total Flavonoid Content

Similar to total phenolic content results, in fermented samples, total flavonoid content was higher compared to unfermented samples (Table 3).

Table 3. Total flavonoid content of fermented buckwheat mashes (mg QE/g).

The most remarkable increment in total flavonoids was observed after 8 h of fermentation (about 7.8–40.4% compared to initial values). Water-based cranberry mashes reached the flavonoid maximum after 8 h, whereas other mashes reached the maximum at the end of fermentation (14 days). At the end of the storage period, final values were higher by about 13.4–19.1% and 24.2–37.7% for products with cranberry and unflavored products, respectively. Incorporation of lyophilized cranberry powder into natural buckwheat samples promoted increases of 129.2% and 145.2% in total flavonoids determined in water and milk products (calculated at the 14th day), respectively. Water products contained about 30.1% higher flavonoid levels than milk products.

총 플라보노이드 함량은 발효 8시간 후 가장 크게 증가했으며(초기 값 대비 약 7.8–40.4%). 물 기반 크랜베리 발효액은 발효 8시간 후 플라보노이드 최대치를 달성했으며, 다른 발효액은 발효 종료 시점(14일)에 최대치를 달성했습니다.

저장 기간 종료 시 최종 값은

크랜베리 함유 제품과 무향 제품에서

각각 약 13.4–19.1% 및 24.2–37.7% 높았습니다.

동결건조 크랜베리 분말을 천연 메밀 샘플에 첨가하면

물과 우유 제품에서 측정된 총 플라보노이드 함량이

각각 129.2%와 145.2% 증가했습니다(14일차 기준).

물 제품은 우유 제품보다 약 30.1% 높은 플라보노이드 함량을 나타냈습니다.

3.4. Phenolic Compounds Profile

The results from the identification and quantification of phenolic compounds are presented in Table 4 and Figure 1. Seven phenolic acids (gallic, protocatechuic, vanillic, syringic, caffeic, p-coumaric, and ferulic) and two flavonoids (rutin and quercetin) were detected from the unfermented and fermented samples. The content and proportions of each compound were dependent on the experimental period. Rutin and p-coumaric acids were the dominant phenolics in unfermented samples, accounting for 21.1% and 19.7%, on average, respectively, and their proportion to total phenolic content (quantified by HPLC analysis) decreased after 14 days of fermentation. In contrast, the contents of gallic and protocatechuic acids, and quercetin, were, in all samples, higher at the end of fermentation by 34.3–134.9%, 8.0–105.0%, and 46.2–160.2%, respectively. Significant increases (p < 0.05) were also observed with vanillic and caffeic acids (28.1% and 32.5%, on average) in all mashes, with the exception of unflavored water mash with L. rhamnosus GG. This mash also achieved the opposite final results in ferulic, p-coumaric, and syringic acid contents compared with remaining mashes.

3.4. 페놀성 화합물 프로파일

페놀성 화합물의 식별 및 정량화 결과는 표 4와 그림 1에 제시되어 있습니다.

발효되지 않은 및 발효된 시료에서

7종의 페놀산(갈산, 프로토카테추산, 바닐산, 시링산, 카페인산, p-쿠마르산, 페룰산)과

2종의 플라보노이드(루틴과 케르세틴)가 검출되었습니다.

각 화합물의 함량과 비율은 실험 기간에 따라 달라졌습니다.

루틴과 p-쿠마르산은

발효되지 않은 시료에서 주요 페놀성 화합물로,

평균 각각 21.1%와 19.7%를 차지했으며,

HPLC 분석으로 정량화된 총 페놀성 화합물 함량에 대한 비율은 발효 14일 후 감소했습니다.

반면,

갈릭산, 프로토카테추산, 및 케르세틴의 함량은

모든 시료에서 발효 종료 시 각각 34.3–134.9%, 8.0–105.0%, 및 46.2–160.2% 증가했습니다.

바닐릭산과 카페인산(평균 28.1%와 32.5%)의 함량도

모든 맥아에서 유의미하게 증가했으며(p < 0.05), L. rhamnosus GG를 첨가한 무향수 맥아를 제외했습니다.

이 맥아는 페룰산, p-쿠마르산, 시링산 함량에서 나머지 맥아와 반대 결과를 보였습니다.

Figure 1. Rutin and quercetin content of buckwheat mashes obtained by HPLC analysis (µg/g). B/W/LP: buckwheat/water/L. plantarum HM1; B/W/LRH: buckwheat/water/L. rhamnosus GG; B/M/LP: buckwheat/milk/L. plantarum HM1; B/M/LRH: buckwheat/milk/L. rhamnosus GG; B/W/CR/LP: buckwheat/water/cranberries/L. plantarum HM1; B/W/CR/LRH: buckwheat/water/cranberries/L. rhamnosus GG; B/M/CR/LP: buckwheat/milk/cranberries/L. plantarum HM1; B/M/CR/LRH: buckwheat/milk/cranberries/L. rhamnosus GG.

Table 4. Phenolic acids profile in buckwheat mashes obtained by HPLC analysis (µg/g).

3.5. Antioxidant Activity

As shown in Table 5, the fermentation process resulted in a positive effect on antioxidant activity. After fermentation with Fresco culture (8 h), the antioxidant activity was higher by about 7.9% and 11.8% in unflavored samples, and by about 13.2% and 20.2% in samples with cranberries (p < 0.05).

3.5. 항산화 활성

표 5에 표시된 바와 같이,

발효 과정은 항산화 활성에 긍정적인 영향을 미쳤습니다.

Fresco 배양액으로 8시간 발효 후,

무향 시료에서는 약 7.9%와 11.8%,

크랜베리 함유 시료에서는 약 13.2%와 20.2%의 항산화 활성이 증가했습니다 (p < 0.05).

Table 5. Antioxidant activity of buckwheat mashes (mg DPPH/g) determined by DPPH test.

In unflavored milk mashes, the most significant changes occurred after 24 h; antioxidant activity values reached 0.667 and 0.484 mg DPPH/g in samples with L. plantarum HM1 and L. rhamnosus GG from the initial 0.315 mg DPPH/g, representing increases of 89.2% and 37.4%, respectively. In mashes fermented with L. plantarum, antioxidant activity increased throughout the experimental period, except for 4th day of experiment, when the antioxidant activity in mashes with cranberries decreased, or did not show a significant difference (p > 0.05) in unflavored mashes. Mashes with L. rhamnosus GG did not show a significant decline (p > 0.05) in milk-based cranberry mash, and a decrease after 4 days and subsequent increase were observed in unflavored mashes. In the water-based cranberry sample, antioxidant activity was already reduced after 24 h. At the end of the 14 day experimental period, antioxidant activities were 1.1–2.5 times higher compared to the initial values (0 h). Several studies have also reported an increase in antioxidant activity during buckwheat fermentation [45,46,47]. Similar to phenolic content results, water products showed better antioxidant activities than milk products (about 16.1%, on average), and cranberry flavored products than unflavored products (about 84.3%, on average). Mashes with L. plantarum HM1 scavenged a significantly higher (p < 0.05) quantity of DPPH free radicals (after 14 days) than mashes with L. rhamnosus GG.

무향 우유 반죽에서 가장 큰 변화는 24시간 후에 발생했으며, L. plantarum HM1과 L. rhamnosus GG를 함유한 시료의 항산화 활성 값은 초기 0.315 mg DPPH/g에서 각각 0.667 mg DPPH/g와 0.484 mg DPPH/g로 증가하여 89.2%와 37.4%의 증가율을 보였습니다. L. plantarum로 발효된 혼합물에서는 실험 기간 동안 항산화 활성이 지속적으로 증가했으며, 실험 4일차에 크랜베리 함유 혼합물의 항산화 활성이 감소하거나 무향 혼합물에서는 유의미한 차이를 보이지 않았습니다 (p > 0.05). L. rhamnosus GG를 함유한 맥아는 우유 기반 크랜베리 맥아에서 유의미한 감소(p > 0.05)를 보이지 않았으며, 무향 맥아에서는 4일 후 감소 후 증가가 관찰되었습니다. 물 기반 크랜베리 샘플에서는 24시간 후 항산화 활성이 이미 감소했습니다. 14일 실험 기간 종료 시 항산화 활성은 초기 값(0시간)에 비해 1.1~2.5배 높았습니다. 여러 연구에서도 메밀 발효 과정에서 항산화 활성이 증가했다는 보고가 있습니다[45,46,47]. 페놀 함량 결과와 유사하게, 물 기반 제품이 우유 기반 제품보다 항산화 활성이 우수했으며(평균 약 16.1%), 크랜베리 향이 첨가된 제품이 무향 제품보다 우수했습니다(평균 약 84.3%). L. plantarum HM1을 함유한 발효액은 L. rhamnosus GG를 함유한 발효액보다 14일 후 DPPH 자유 라디칼을 유의미하게 더 많이 제거했습니다(p < 0.05).

4. Discussion

To date, numerous scientific studies have focused on the development and preparation of new types of fermented products with probiotic and functional properties [48,49]. Fermentation is a complex system consisting of many partial processes, the continuity, relationship, and interaction of which are diverse. During fermentation, degradation of individual components, structural changes, and formation of new compounds take place. The character and degree of changes are affected by various factors, including microbial strains, substrate composition, and fermentation conditions. The various profiles of enzymes secreted by microbes during fermentation may affect the content and composition of phenolic compounds. Microbial enzymes have the ability to release phenolics from bound forms and to enhance free phenolic content. For example, protease, cellulase, and amylase can hydrolyze the structural components, and facilitate the action of esterase and xylanase, causing the release of insoluble-bound phenolics from their covalent bonds in the cell wall [29,45,50]. Glucosidases are able to release phenolic compounds from their soluble conjugated forms, and are often conjugated to sugars as glycosides [51]. Additionally, lactic acid produced by the present microbiota can help release bound phenols to their free forms. Moreover, stability of phenolic compounds is pH dependent, where the structure of phenolics is a determining factor. Anthocyanins and catechins are stable at low pH, but the amount of ferulic acid decreases, and proanthocyanidins may be degraded into flavanols [50,52,53]. It should be noted that pH influences the degradation of microbial enzymes. Considering the health benefits of buckwheat, in this study, fermented buckwheat mashes with probiotic potential were prepared. The application of mixed or combined cultures in fermentation technologies causes accelerated and efficient organic acid production within a short fermentation period. Food industries also prefer short fermentation periods in order to reduce microbial contamination and increase plant output. Thus, in our study, cocci of the Fresco DVS 1010 mixed culture were used for lactic acid fermentation within 8 h. Salmerón et al. [54] also preferred a shorter fermentation time (10 h, 37 °C) in non-dairy cereal beverages fermented with L. plantarum. Pelikánová et al. [55] similarly proved the adequacy of an 8 h fermentation time during lactic acid fermentation of buckwheat products. Within 8 h of fermentation, Fresco culture showed good growth in all our experiments, resulting in a decrease in pH from 4.2 to 4.4, with the exception of the milk-based mash (5.06). In our previous study, the pH values reached after the fermentation with Fresco culture in buckwheat mashes were below 4.5, with the exceptions of milk and milk chocolate mash [56]. A pH range of approximately 3.5 to 4.5 in the final product may help buffer the pH increase in the gastrointestinal tract, thus enhancing the stability and beneficial features of consumed probiotic strains [57]. The viability of probiotic bacteria is an important criterion for the use of probiotics in functional foods, because they should survive with minimal densities of 6 log CFU/mL at the end of the shelf life. In our study, the functionality of buckwheat mashes was proven with high viable bacterial lactobacilli counts (6.0–7.7 log CFU/mL) at the end of the storage period. An exception was observed in water-based mash, where the density of L. plantarum HM1 at the end of 14 days was 5.8 log CFU/mL. Gueimonde et al. [44] eval‎uated densities of lactobacilli in 10 commercial fermented drinks. During 30 days of cold storage, a slow decrease in counts was noted (0.8–1.9 log orders); nonetheless, the population of microorganisms remained above 5 log CFU/mL, the minimum level suggested by some authors.

Our study confirmed a positive effect of lactic acid bacteria fermentation on both phenolic compound contents and antioxidant activity. It can be supposed that the mentioned mechanisms were applied to the fermentation process. The phenolics in buckwheat and cranberry are mainly in the form of soluble free compounds and soluble conjugates [14,15,28]. Lactic acid bacteria, through the acidification and hydrolysis of glycosylated forms, enhanced the total phenol and flavonoid content. The observed higher levels of measured parameters of water-based products in comparison to milk-based products are probably related to the complex formation between phenolics and milk components (proteins, lipids, and peptides), which makes them less able to be assayed. Milk protein–phenolic interactions increase with an increasing number of hydroxyl groups in phenolic compounds [58]. On day 4 of fermentation, the decrease in phenolic content and antioxidant activity in several mashes was noticed, and may be attributed to changes in enzyme activities during fermentation. Saharan et al. [59] measured amylase, xylanase, and β-glucosidase activities during cereal fermentation with Aspergillus oryzae, and the maximum enzyme activities recorded on the 5th day of incubation. Similarly, the authors observed a linear correlation between enzyme activities and total phenolics and flavonoids.

Further metabolic pathways recognized in lactic acid bacteria involve decarboxylation and/or reduction. Lactobacilli can produce phenolic acid reductase, feruoylesterase, and phenolic acid decarboxylase [50,60]. Caffeic, ferulic, and p-coumaric acids are decarboxylated into corresponding vinyl derivatives, which can be subsequently reduced to corresponding ethyl derivatives. Phenolic acid reductase reduces phenolic acids to hydroxyphenylpropionic acids (e.g., dihydrocaffeic and dihydroferulic acid) [51,60,61,62]. Our results confirmed the loss of ferulic and p-coumaric acids during fermentation. No significant changes (p > 0.05) or degradation of caffeic acid were only recorded in unflavored samples with L. rhamnosus GG. The increase in the caffeic acid level in the remaining samples can be attributed to the hydrolysis of chlorogenic acid into their two constituents—caffeic and quinic acids [60]. These conclusions indicate that phenolic metabolism is specific to the substrate, substrate concentration, and microbial strain [60]. Buckwheat is an important source of rutin and catechin. We observed declining rutin content (about 1.7–27.2%) during fermentation in contrast to an increasing amount of quercetin (about 46.2–160.2%). Our findings are in agreement with the study of Lukšič et al. [63], where the authors noted the conversion of rutin into quercetin. Rutin (quercetin-3-O-rhamnoglucoside) can be hydrolyzed by α-rhamnosidase to quercetin-3-glucoside, and further converted by β-glucosidase to free quercetin, and eventually directly into quercetin by hesperidinase. Moreover, production of further compounds such as kaempferol-3-rutinoside, kaempferol-3-glucoside, and free kaempferol, in addition to protocatechuic and 4-hydroxybenzoic acids, was reported [51]. Percentage increments of quercetin in our samples suggest its additional formation pathway, e.g., degradation of quercetin glycosides such as quercitrin (quercetin-3-rhamnoside), isoquercitrin (quercetin-3-β-D-glucoside), and hyperoside (quercetin-3-D-galactoside) contained in buckwheat [12,64], or hyperoside (predominant), avicularin (quercetin-3-arabinoside), quercitrin, isoquercitrin, quercetin 3-xyloside, quercetin-3-O-(6″-p-coumaroyl)-β-galactoside, and quercetin-3-O-(6″-benzoyl)-β-galactoside identified in cranberries [26,65].

Similar to buckwheat, cranberries are an abundant source of flavanols, which occur as monomers, oligomers, and polymers. The fermentation process induces depolymerization, and production of free catechins, catechin esters, and gallic acid [51]. The increase in gallic acid (about 34.3–134.9%) observed in our experiment is in accordance with the above-mentioned results.

Anthocyanin glucoside metabolism comprises deglycosylation into corresponding aglycones followed by feasible ring fission. Thus, the predominant anthocyanidins in cranberry—cyanidin, malvidin, delphinidin, and peonidin—can be converted into protocatechuic, syringic, gallic, and vanillic acid, respectively [28,51]. This can be considered to be one of the mechanisms leading to the increase in protocatechuic, gallic, and vanillic acids in our fermented products. The published literature also reported condensation reactions between flavanols and anthocyanins to form an anthocyanin–flavanol complex [15]. Transformation of vanillic acid into protocatechuic acid and vanillyl alcohol, and of syringic acid into syringaldehyde and syringol, was described [51].

Correlation analysis was undertaken for the eval‎uation of the linear association between the analyzed parameters. As concluded from Table S1 (see Supplementary Materials), positive strong correlations were observed between total phenolic content, total flavonoid content, rutin content, and antioxidant activity of the studied mashes (r = 0.819–0.957). Moreover, positive strong correlations were also found between total phenolic and flavonoid content, gallic acid, rutin, and quercetin content (r = 0.810–0.969), caffeic acid and quercetin content (r = 0.929), gallic acid and caffeic acid (r = 0.896), gallic acid and quercetin (r = 0.948), and quercetin, rutin, and total flavonoid content (r = 0.841, r = 0.915). The results of the PCA showed that the three principal components (PC), which accounted together for 90.8% of the total variation (Figure 2), were extracted.

4. 논의

현재까지 프로바이오틱스와 기능성 특성을 갖춘 새로운 유형의 발효 제품의 개발 및 제조에 대한 수많은 과학적 연구가 진행되어 왔습니다[48,49]. 발효는 많은 부분 과정으로 구성된 복잡한 시스템으로, 이 과정들의 연속성, 관계, 상호작용은 다양합니다.

발효 과정에서

개별 성분의 분해, 구조적 변화, 새로운 화합물의 형성이 발생합니다.

이러한 변화의 특성 및 정도는 미생물 균주, 기질 구성, 발효 조건 등

다양한 요인에 의해 영향을 받습니다.

미생물이 발효 과정에서 분비하는 다양한 효소의 프로파일은

페놀성 화합물의 함량 및 구성에 영향을 미칠 수 있습니다.

미생물 효소는

결합된 형태의 페놀을 방출하고 자유 페놀 함량을 증가시키는 능력을 갖추고 있습니다.

예를 들어,

프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제는

구조적 성분을 가수분해하여 에스테라제와 엑스라나제의 작용을 촉진하여

세포벽의 공액 결합에서 불용성 결합 페놀성 화합물을 방출합니다 [29,45,50].

글루코시다제는

용해성 공액 형태의 페놀성 화합물을 방출할 수 있으며,

종종 당과 결합된 글리코사이드 형태로 존재합니다 [51].

또한 현재 미생물군집이 생성하는 젖산은

결합된 페놀을 자유 형태로 방출하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

또한 페놀 화합물의 안정성은 pH에 의존하며,

페놀의 구조가 결정적 요인입니다.

안토시아닌과 카테킨은

저 pH에서 안정적이지만,

페룰산 양은 감소하며, 프로안토시아니딘은 플라바놀로 분해될 수 있습니다 [50,52,53].

pH가

미생물 효소의 분해에 영향을 미친다는 점을 유의해야 합니다.

메밀의 건강 혜택을 고려하여 본 연구에서는

프로바이오틱스 잠재성을 가진 발효 메밀 퓌레를 제조했습니다.

발효 기술에서 혼합 또는 복합 배양을 적용하면

짧은 발효 기간 내에 유기산 생산이 가속화되고 효율적으로 이루어집니다.

식품 산업은 미생물 오염을 줄이고

식물 생산량을 증가시키기 위해

짧은 발효 기간을 선호합니다.

따라서

본 연구에서는 Fresco DVS 1010 혼합 배양의 구균을 사용하여

8시간 내에 젖산 발효를 수행했습니다.

Salmerón 등 [54]도 L. plantarum로 발효된 유제품이 아닌 곡물 음료에서

더 짧은 발효 시간(10시간, 37°C)을 선호했습니다.

Pelikánová 등[55]도 메밀 제품의 젖산 발효 시 8시간 발효 시간이 적절함을 유사하게 입증했습니다. 발효 8시간 이내에 Fresco 배양주는 모든 실험에서 좋은 성장세를 보였으며, pH는 4.2에서 4.4로 감소했습니다(우유 기반 반죽 제외, 5.06). 이전 연구에서 Fresco 배양주로 발효된 메밀 반죽의 pH 값은 우유와 우유 초콜릿 반죽을 제외하고 4.5 미만으로 감소했습니다 [56]. 최종 제품의 pH 범위가 약 3.5~4.5일 경우 위장관 내 pH 상승을 완화하여 섭취된 프로바이오틱 균주의 안정성과 유익한 특성을 향상시킬 수 있습니다 [57]. 프로바이오틱 박테리아의 생존율은 기능성 식품에 프로바이오틱스를 사용하기 위한 중요한 기준이며, 유통기한 종료 시 최소 6 log CFU/mL의 밀도로 생존해야 합니다.

본 연구에서 메밀 퓨레의 기능성은 보관 기간 종료 시 높은 생존율의 유산균(6.0–7.7 log CFU/mL)로 입증되었습니다. 단, 물 기반 퓨레에서는 14일 후 L. plantarum HM1의 밀도가 5.8 log CFU/mL로 관찰되었습니다. Gueimonde 등 [44]은 10종의 상업용 발효 음료에서 락토바실러스 밀도를 평가했습니다. 30일간의 냉장 보관 기간 동안 세균 수는 서서히 감소(0.8–1.9 log 순서)했지만, 미생물 군집은 일부 저자들이 제안한 최소 수준인 5 log CFU/mL 이상을 유지했습니다.

본 연구는 젖산균 발효가 페놀 화합물 함량과 항산화 활성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 확인했습니다. 언급된 메커니즘이 발효 과정에 적용되었을 것으로 추정됩니다. 메밀과 크랜베리의 페놀 화합물은 주로 수용성 자유 화합물과 수용성 결합체 형태로 존재합니다 [14,15,28]. 젖산균은 당화 형태의 산성화 및 가수분해를 통해 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증가시켰습니다. 물 기반 제품에서 측정된 파라미터의 수준이 우유 기반 제품보다 높은 것은 페놀과 우유 성분(단백질, 지질, 펩타이드) 간의 복합체 형성에 기인할 가능성이 있습니다. 이는 페놀 성분이 분석에 덜 민감해지기 때문입니다. 유단백질-페놀 상호작용은 페놀 화합물의 하이드록시 그룹 수가 증가함에 따라 증가합니다 [58]. 발효 4일차에 여러 발효액에서 페놀 함량과 항산화 활성이 감소했으며, 이는 발효 과정에서 효소 활성의 변화에 기인할 수 있습니다. Saharan 등 [59]은 Aspergillus oryzae를 사용한 곡물 발효 과정에서 아밀라아제, 엑스라나아제, β-글루코시다아제 활성을 측정했으며, 최대 효소 활성은 배양 5일차에 기록되었습니다. 마찬가지로 저자들은 효소 활성과 총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 사이의 선형 상관관계를 관찰했습니다.

젖산균에서 인식된 추가 대사 경로는 탈카복실화 및/또는 환원입니다. 락토바실러스는 페놀산 환원효소, 페룰에스테라제, 페놀산 탈카복실화효소를 생산할 수 있습니다 [50,60]. 카페인산, 페룰산, 및 p-쿠마르산은 대응하는 비닐 유도체로 탈카복실화되며, 이는 이후 대응하는 에틸 유도체로 환원될 수 있습니다. 페놀산 환원효소는 페놀산을 하이드록시페닐프로피온산(예: 디히드로카페인산 및 디히드로페룰산)으로 환원합니다 [51,60,61,62]. 본 연구 결과는 발효 과정에서 페룰산과 p-쿠마르산의 손실을 확인했습니다. L. rhamnosus GG가 포함된 무향료 시료에서는 카페산에 대한 유의미한 변화(p > 0.05)나 분해가 관찰되지 않았습니다. 나머지 시료에서 카페산 농도의 증가는 클로로겐산이 두 구성 성분인 카페산과 퀴닉산으로 가수분해되기 때문으로 추정됩니다 [60]. 이러한 결론은 페놀 대사 과정이 기질, 기질 농도, 미생물 균주에 특이적임을 나타냅니다 [60]. 메밀은 루틴과 카테킨의 중요한 원천입니다. 발효 과정에서 루틴 함량은 약 1.7–27.2%로 감소한 반면, 케르세틴 함량은 약 46.2–160.2%로 증가했습니다. 이 결과는 Lukšič 등[63]의 연구와 일치하며, 해당 연구에서는 루틴이 케르세틴으로 전환된다는 점을 지적했습니다. 루틴(케르세틴-3-O-람노글루코사이드)은 α-람노시다아제에 의해 케르세틴-3-글루코사이드로 가수분해되며, 이후 β-글루코시다아제에 의해 자유 케르세틴으로 전환되며, 최종적으로 헤스페리디나아제에 의해 직접 케르세틴으로 전환됩니다. 또한, 카엠페롤-3-루티노시드, 카엠페롤-3-글루코시드, 자유 카엠페롤, 프로토카테추산 및 4-하이드록시벤조산과 같은 추가 화합물의 생성도 보고되었습니다 [51]. 우리 시료에서의 케르세틴 함량 증가율은 추가 생성 경로를 시사합니다.예를 들어, 메밀에 함유된 케르세틴 글루코사이드(예: 케르시트린(케르세틴-3-람노사이드), 이소케르시트린(케르세틴-3-β-D-글루코사이드), 하이퍼오사이드(케르세틴-3-D-갈락토사이드))의 분해[12,64], 또는 하이퍼오사이드(주요 성분) 아비쿨라린(케르세틴-3-아라비노사이드), 케르시트린, 이소케르시트린, 케르세틴 3-xyloside, 케르세틴-3-O-(6″-p-쿠마로일)-β-갈락토사이드, 및 케르세틴-3-O-(6″-벤조일)-β-갈락토사이드가 검출되었습니다[26,65].

메밀과 마찬가지로 크랜베리는 플라바놀의 풍부한 원천으로, 단량체, 올리고머, 폴리머 형태로 존재합니다. 발효 과정은 분해 반응을 유발하여 자유 카테킨, 카테킨 에스터, 갈산 생성을 촉진합니다 [51]. 본 실험에서 관찰된 갈산 함량 증가(약 34.3–134.9%)는 위에서 언급된 결과와 일치합니다.

안토시아닌 글루코사이드 대사 과정은 대응하는 아글리콘으로의 탈글루코실화 followed by 가능한 고리 분열을 포함합니다. 따라서 크랜베리에서 주요 안토시아니딘인 시아니딘, 말비딘, 델피니딘, 페오니딘은 각각 프로토카테추산, 시링산, 갈산, 바닐산으로 전환될 수 있습니다 [28,51]. 이는 발효 제품에서 프로토카테추산, 갈산, 바닐산의 증가를 초래하는 메커니즘 중 하나라고 볼 수 있습니다. 문헌에서는 플라바놀과 안토시아닌 사이의 축합 반응으로 안토시아닌-플라바놀 복합체가 형성된다는 보고가 있습니다 [15]. 바닐릭 산이 프로토카테추산과 바닐릴 알코올로, 시링산이 시링알데히드와 시링올로 전환되는 과정이 설명되었습니다 [51].

분석된 매개변수 간의 선형 관계를 평가하기 위해 상관 분석이 수행되었습니다. 표 S1(보충 자료 참조)에서 결론지어진 바와 같이, 연구된 맥주 찌꺼기의 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 루틴 함량 및 항산화 활성 사이에 강한 양의 상관 관계가 관찰되었습니다(r = 0.819–0.957). 또한, 총 페놀 함량과 플라보노이드 함량, 갈산, 루틴, 케르세틴 함량 사이(r = 0.810–0.969), 카페인산과 케르세틴 함량 사이(r = 0.929), 갈산과 카페인산 사이(r = 0.896), 갈산과 케르세틴 사이(r = 0.948), 케르세틴, 루틴, 및 총 플라보노이드 함량 사이에도 양의 강한 상관관계가 관찰되었습니다 (r = 0.841, r = 0.915). 주성분 분석(PCA) 결과, 총 변동의 90.8%를 설명하는 세 개의 주성분(PC)이 추출되었습니다 (그림 2).

Figure 2. Scree plot visualization: The dependence between the number of principal components and % of explained variance.

PC1 explained 60.9% of the total variation of the studied data and was related to variables flavonoid content, phenolic content, phenolic and flavonoid compounds, and antioxidant activity. PC2 and PC3 explained 20.9% and 9.1% of the total variation, respectively, and mainly reflected the contribution of the variables p-coumaric and syringic acids (PC2) and protocatechuic (Figure 3).

Figure 3. Loadings of variables studied in coordinates PC1 and PC2. TPC: total phenolic content; FL: total flavonoid content; AOA: antioxidant activity; dHB: protocatechuic acid.

The visualization score plot of samples in the coordinates of PC1 and PC2 with the distribution of samples on the plane of principal components is presented in Figure 4.

Figure 4. Principal component analysis graph of the studied samples at different fermentation terms and storage: AP0-AP14d: buckwheat/water/cranberries/L. plantarum HM1; AR0-AR14d: buckwheat/water/cranberries/L. rhamnosus GG; BP0-BP14d: buckwheat/milk/cranberries/L. plantarum HM1; BR0-BR14d: buckwheat/milk/cranberries/L. rhamnosus GG; CP0-CP14d: buckwheat/water/L. plantarum HM1; CR0-CR14d: buckwheat/water/L. rhamnosus GG; DP0-DP14d: buckwheat/milk/L. plantarum HM1; DR0-DR14d: buckwheat/milk/L. rhamnosus GG during experimental period 0–14 days.

PCA divided the samples into three groups according to the applied raw materials for recipe formulation: unflavored water- or milk-based mashes (samples CP0-CP14d, CR0-CR14d, DP0-DP14d, and DR0-DR14d) characterized by the lowest content of total phenolics and total flavonoids and antioxidant activity; milk-based cranberry mashes (BP0-BP14d and BR0-BR14d) characterized by the lowest content of p-coumaric acid; and water-based cranberry mashes (AP0-AP14d and AR0-AR14d) characterized by the highest content of total phenolics and total flavonoids. In addition, PCA also differentiated groups of mashes with or without the addition of cranberries (Figure 4). By comparison, PCA did not separate the mashes based on the added lactic acid bacteria.

5. Conclusions

The popularity of functional products fermented with probiotics continues to increase because consumers desire flavorful food products with beneficial effects to their health. Thus, in our study, the potential of buckwheat flour for production of lactic acid-fermented mashes was tested. It was shown that the fermentation process (8 h) significantly increased cocci of the Fresco culture in the products. In milk-based mash, the calculated specific growth rates were about 24% higher compared to water-based mashes, due to the nutrients present in milk. Within the cold storage period (6 °C, 14 days), we tested the survival of the officially recognized strain L. rhamnosus GG and novel isolate L. plantarum HM1. At the end of the cold storage period, statistically significant changes in counts of lactobacilli were noted (p < 0.05). Nonetheless, the population of lactobacilli added after the 8 h fermentation process did not drop below the limit of 6 log CFU/mL, with the exception of L. plantarum HM1 in water-based mash to which cranberries were added. The applied microbial strains showed the ability to metabolize present nutritive and other bioactive compounds. Supplementation of buckwheat mashes with cranberries led to increases in total phenols (of about 70.7%, on average), total flavonoids (of about 136.2%, on average), and antioxidant activities (of about 84.3%, on average) in comparison with buckwheat mashes without cranberries. Water-based mashes contained higher quantities of phenols (by about 31.6%, on average) and flavonoids (by about 30.1%, on average), and showed better antioxidant activities (by about 16.1%, on average) than milk-based mashes. Prepared buckwheat-fermented products had enhanced bioactive phenolic compound contents with better antioxidant properties. Furthermore, changes in the examined compounds induced by fermentation may improve their digestibility and bioavailability, which can have beneficial effects in promoting health.

5. 결론

프로바이오틱스로 발효된 기능성 제품의 인기는

소비자들이 건강에 유익한 효과를 가진 맛있는 식품을 원하기 때문에

계속 증가하고 있습니다.

따라서

본 연구에서는 메밀 가루를 이용한

젖산 발효 퓌레 생산의 잠재성을 평가했습니다.

발효 과정(8시간)은 제품 내 Fresco 균주의 구형 세균 수를 유의미하게 증가시켰습니다.

우유 기반 맥아에서는 우유에 함유된 영양소로 인해 물 기반 맥아에 비해 계산된 특정 성장률이 약 24% 높았습니다.

냉장 보관 기간(6°C, 14일) 동안 공식적으로 인정된 균주 L. rhamnosus GG와 신규 분리주 L. plantarum HM1의 생존율을 테스트했습니다. 냉장 보관 기간 종료 시 유산균의 개체 수에 통계적으로 유의미한 변화가 관찰되었습니다(p < 0.05). 그러나 8시간 발효 과정 후 추가된 유산균의 개체 수는 6 log CFU/mL 이하로 감소하지 않았으며, 단수분 기반 퓌레에 크랜베리가 추가된 경우 L. plantarum HM1을 제외하고는 모두 기준치를 충족했습니다. 적용된 미생물 균주는 존재하는 영양소 및 기타 생물활성 화합물을 대사하는 능력을 보여주었습니다. 크랜베리를 보충한 메밀 반죽은 크랜베리가 없는 메밀 반죽에 비해 총 페놀(평균 약 70.7%), 총 플라보노이드(평균 약 136.2%), 항산화 활성(평균 약 84.3%)이 증가했습니다. 물 기반 반죽은 우유 기반 반죽에 비해 페놀(평균 약 31.6%), 플라보노이드(평균 약 30.1%) 함량이 높았고, 항산화 활성도(평균 약 16.1%)가 우수했습니다.

준비된 메밀 발효 제품은

생물활성 페놀 화합물 함량이 증가했으며,

항산화 특성이 향상되었습니다.

또한 발효로 인한 조사된 화합물의 변화는

소화율과 생체 이용률을 개선할 수 있으며,

이는 건강 증진에 유익한 효과를 가질 수 있습니다.

Supplementary Materials

The following are available online at https://www.mdpi.com/article/10.3390/app11199241/s1, Table S1: Pearson correlation coefficients for parameters studied.

Author Contributions

Conceptualization, writing—original draft preparation and review; A.M., Z.M., Z.K., S.M. and Ľ.V.; experiments: A.M., Z.M. and E.H.; data analysis: A.M., Z.M., Z.K. and Ľ.V. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

Funding

This publication was supported by the Scientific Grant Agency of the Ministry of Education, Science, Research and Sport of the Slovak Republic and Slovak Academy of Sciences, grant number VEGA 1/0363/19 and by the Operational Program Integrated Infrastructure within the project: Drive4SIFood 313011V336, cofinanced by the European Regional Development Fund.

Institutional Review Board Statement

Not applicable.

Informed Consent Statement

Not applicable.

Data Availability Statement

Supporting data are available in the Supplementary Materials.

Conflicts of Interest

The authors declare no conflict of interest.

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