안전관리대행 - 화학물질의 피부부식 대체시험 기술지침

[김용철]

화학물질의 피부부식 대체시험 기술지침

1. 목적

이 지침은 산업안전보건법 제105조(유해인자의 유해성·위험성평가 및 관리), 제

108조(신규화학물질의 유해성ㆍ위험성 조사), 제110조(물질안전보건자료의 작성

및 제출) 및 국립환경과학원 고시 제2020-46호(화학물질의 시험방법에 관한 규

정) 등 화학물질 취급에 따른 피부노출에 의해 일어날 가능성이 있는 건강장해

에 관한 정보를 제공하기 위한 동물시험 대체시험법으로서 피부 부식성에 대

한 시험을 통해 부식성 있는 화학물질 또는 혼합물의 특성을 평가하기 위한

피부부식 대체시험법 지침을 제시하고자 함

2. 적용범위

이 지침은 법과 관련하여 화학물질의 피부노출에 의한 건강장해에 관한 자료

제공을 위한 피부부식 대체시험법에 적용한다.

3. 용어의 정의

(1) 이 지침에서 사용하는 용어의 뜻은 다음과 같다.

(가) “생체 내 피부 부식성(Skin corrosion in vivo)”이란 피부의 비가역적 손상

유발로서 표피에서 진피까지 육안으로 관찰 가능한 조직 괴사가 일어나며

시험물질을 4시간까지 처리했을 때는 궤양, 출혈, 혈액딱지가 형성되며 14

일 이후에는 피부 표백, 탈모 및 상흔이 유발 되는 것을 말한다.

(나) “세포 생존율(Cell viability)”이란 전체 세포 중 활성을 나타내는 세포의

비율을 말한다

(다) “구조유사체관계(Structural activity relationship)”란 화학물질의 구조가

유하면 유사한 독성을 나타냄을 말한다.

(2) 기타 이 지침에서 사용하는 용어의 정의는 이 지침에서 특별한 규정이 있는

경우를 제외하고는 국립환경과학원 고시 제2020-46호(화학물질의 시험방법에

관한 규정)에서 정하는 바에 따른다.

4. 대체 시험법 고려 사항

(1) 이 시험법으로 부식성 화학 물질 및 혼합물을 확인 할 수 있으나, 기존의 다

른 정보(산도, 화학물질 구조유사체관계, 인간 동물 자료)를 사용하면 비부식

성 물질 및 혼합물질 확인이 가능하다.

(2) 본 시험법은 일반적으로 피부자극(Skin irritation)에 대한 적절한 정보는 제

공하지 못한다.

(3) 1회 피부노출 후 국부적 피부 영향에 대한 전체 평가를 위해서는 급성피부

자극성/부식성 시험 및 세계조화시스템(GHS)에서 제시하는 시험을 추가로

순차적으로 수행하는 것이 좋다.

(4) 살아있는 동물 시험을 실행하기 전 피부 부식과 피부 자극에 대한 사전 시

험으로 적합하다.

5. 시험준비

5.1 인체피부모델

5.1.1 시험을 수행하기 위한 인체피부를 제작하거나 기존제품을 구매하여 사용할

수 있다.

5.1.2 인체피부모델의 상피(Epithelium)는 인체의 각질세포(Keratinocytes)로 구성

되어야 한다

5.1.3 기능적 각질층 아래에 여러 층의 생존 표피 세포가 존재해야 한다.

5.1.4 피부 모델은 기질성분층(Stromal component layer)을 포함되어야 한다.

5.1.5 각질층은 독성물질의 신속한 침투를 방지하기 위하여 기능적으로 단단한 장

벽을 제공할 수 있도록 필요한 지방 특성과 함께 여러 층으로 구성되어야

한다. 미생물, 마이코플라즈마, 또는 곰팡이로 인한 오염이 없어야 한다.

5.1.6 세포 생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide, Thiazolyl blue CAS number 298-93-1) 또는 대사 작용으로 변환

될 수 있는 염료를 이용하여 정량화한다.

5.1.7 음성 대조군 조직의 흡광도(Optical Density: OD)는 용매의 흡광도보다 20

배 이상 높아야 한다.

5.1.8 각질층은 특정 세포독성 지표물질(예, 1% Triton X-100)의 신속한 투과에

대하여 충분한 방어능력을 가지고 있어야 한다.

5.2 시험물질

투여량은 액체 시험물질의 경우 최소 25 ㎕/㎠로 한다. 매 시험마다 양성 및

음성대조군 시험을 함께 실시한다. 양성대조군은 빙초산(Glacial acetic acid)

또는 8 M 수산화칼륨(KOH)을 사용하며, 음성대조군은 0.9% NaCl 식염수 또

는 증류수를 사용한다.

5.3 시험군의 구성

신뢰성 있는 실험을 수행하기 위하여 노출시간에 따른 각 처리군, 음성대조

군 및 양성대조군은 각각 3개 이상 시료가 되게 하여야 한다.

6. 시험방법

6.1 원리

6.1.1 인체 피부모델 시험의 원리는 부식성 있는 물질이 확산 또는 부식에 의해

각질층을 통과하여 하층의 피부 조직에 세포독성을 나타내는 것이다.

6.1.2 3차원 인체피부모델에 시험물질을 적용하여, 특정 노출시간동안 세포 생존

율을 측정함으로써 부식성 화학물질을 확인할 수 있다.

6.2 시험 방법

6.2.1 시험물질 투여 전 주의사항

MTT 및 부식성 물질은 위험하므로 필요한 경우 보호 장갑을 착용하고 보안

경, 호흡용 보호구를 착용하는 등 사고가 발생하지 않도록 주의하여야 한다.

다음 시험 사용되는 배양액, 시험물질의 양은 피부면적이 0.38 ㎠을 기준으로

한다.

6.2.2 4 시간 노출군 시료 준비

(1) 플레이트 웰에 37℃로 예열된 배양액을 2.2 ㎖씩 넣는다.

(2) 인체피부모델을 각각의 플레이트 웰에 넣는다.

(3) 피펫을 사용하여 시험물질 50 ㎕을 각 플레이트 웰에 넣는다.

(4) 고체인 경우 분말가루로 만들어 20 ㎎을 표피 상부에 놓고, 100 ㎕ NaCl(9

g/ℓ식염수)를 넣어서 표피와 충분히 접촉되도록 한다.

(5) 음성대조군 플레이트 3개 웰에 각각 50 ㎕ NaCl (9 g/ℓ식염수)을 넣는다.

(6) 양성대조군 플레이트 3개 웰에 각각 50 ㎕ 빙초산(Glacial acetic acid)을 넣

는다.

(7) 플레이트의 뚜껑을 닫고 상온(18∼28℃), 환기 캐비넷에서 4시간(± 5분)동

안 배양한다.

6.2.3 1 시간 노출군 시료 준비

(1) 4시간 노출군에서 같은 방법으로 시험물질을 투여한다.

(2) 실온에서 통풍이 되는 캐비닛 (18∼28℃)에서 1시간 (± 5분)배양한다.

6.2.4 3분 노출군 시료 준비

(1) 1시간 노출군, 4시간 노출군에서와 같이 인체피부모델을 플레이트 웰에 넣

는다.

(2) 노출 시간을 정확히 맞추기 위하여, 20초 간격으로 시험물질을 투여한다.

6.3 시료 세척 및 MTT 처리

6.3.1 노출 시간이 완료되면 인체피부모델을 플레이트 웰에서 꺼낸다.

6.3.2 인체피부모델 상피에 있는 시험물질을 완전히 제거하기 위하여 PBS(Phosphate

Buffered Saline)용액으로 충분히 씻는다.

6.3.3 인체피부모델을 배양액에 넣는다.

6.3.4 MTT 용액(0.3 ㎎/㎖) 2.2 ㎖를 각 웰에 넣는다.

6.3.5 플레이트 뚜껑을 닫고 빛이 차단된 장소에서 3시간동안 배양한다.

6.4 Formazan 추출

6.4.1 MTT를 넣고 배양이 끝나는 시점에 formazan을 추출한다.

6.4.2 흡수성 종이에 시료를 놓는다.

6.4.3 MTT 용액을 각 웰에서 제거한다

6.4.4 생검 펀치를 사용하여 표피를 생검하고, 플레이트 가장자리에 올려놓는다.

6.4.5 핀셋을 이용하여 표피에서 콜라겐 매트릭스(Collagen matrix)를 분리하고,

산성 이소프로판올(Acidified isopropanol)에 분리된 표피와 콜라겐 매트릭스

를 넣는다.

6.4.6 각각의 튜브의 마개를 닫고, 볼텍스 믹서를 이용하여 충분히 석는다.

6.4.7 산성 이소프로판올이 시료에 잘 석였는지 확인한다.

6.4.8 빛을 차단한 상태에서 하룻밤(Over night) 상온에서 보관한다.

6.5 흡광도(Optical Density, OD) 측정

6.5.1 Formazan 추출 후 다음 날에 흡광도(OD)를 측정한다.

6.5.2 볼텍스 믹서를 사용하여 각각의 튜브를 섞는다.

6.5.3 모든 셀 조각이 광학밀도 측정에 방해가 되지 않도록 1∼2 분 동안 방치한다.

6.5.4 96 웰 플레이트에 각 튜브의 샘플을 200㎕씩 넣는다.

6.5.5 파장길이가 545∼595 ㎚ 범위에서 흡광도를 측정한다.

6.5.6 산성 이소프로판올 용액(Acidified isopropanol solution)을 블랭크로 사용한다.

6.5.6 측정된 광학밀도를 기록한다.

7. 시험결과 및 보고

7.1 세포 생존율 계산

7.1.1 세포생존율 

7.1.2 3개 음성대조군의 평균 OD값 계산

음성대조군의 평균 OD값은 0.115〜0.4이어야 한다. 이 범위를 벗어나면 재

시험을 한다.

7.1.3 3개 양성대조군의 평균 OD값 계산

양성대조군의 세포 생존율은 0∼20%이어야 한다. 이 범위를 벗어나면 재시험

을 한다.

7.1.4 시험물질을 3분, 1시간, 4시간 노출 후 각각의 시험물질의 세포 생존율(%)

을 계산한다.

7.2 결과의 처리

시험물질의 부식성 분류는 각 인체피부모델에 대한 확인연구(Validation study)

에서 확인된 분류기준에 따라 분류한다.

7.2 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함한다.

7.2.1 시험기관의 명칭 및 소재지

7.2.2 시험책임자 및 담당자 성명

7.2.3 시험 및 대조 물질 정보

(1) IUPAC 또는 CAS 번호와 같은 화학명

(2) 시험물질의 순도 또는 실험용 혼합물(무게 %로 나타냄)의 배합, 물리적 특

성 및 순도

(3) 시험의 수행과 관련된 시험물질의 물리적 상태(기체, 고체, 액체 등), pH,

안정성, 수용성 등의 물리화학적 특성

(4) 시험 이전에 시험/대조 물질의 처리(필요한 경우: 예, 가온 또는 분쇄 등)

(5) 사용된 피부 모델 및 시험법에 대한 근거

7.2.4 시험 조건

(1) 사용한 세포 시스템

(2) 세포 생존율을 확인하기 위해 사용한 장비(예, Spectrophotometer)에 대한

보정정보

(3) 사용한 피부 모델에 대한 유효성을 포함한 모든 정보

(4) 사용한 시험결과에 대한 세부사항

(5) 사용된 시험용량

(6) 변형된 시험 절차의 세부사항(있는 경우)

(7) 시험모델에 대한 기존 데이터 참고자료

(8) 평가범주에 대한 세부사항

7.2.5 시험의 결과

(1) 개별 시험 샘플에 대한 데이터 표

(2) 관찰된 효과에 대한 세부사항

7.2.6 결과에 대한 고찰 및 결론

[출처:산업안전보건공단]