서양종에 동양종 낭충병 바이러스 감염의 증거 - 논문

[꿀벌나라 (울산)]

낭충병 자료 하나를 더 올리고 난 뒤에 다른 바이러스 자료를 올리겠다고 했는데,

그것이 이 자료이 입니다.

덧글에 반박 자료로 올리는 바람에 주객이 전도 되었습니다. 

원래 목적대로 이 자료를 올리고 다음편에는 다른 바이러스를 올리겠습니다.

적용 및 환경 미생물학

Evidence of Apis cerana Sacbrood virus Infection in Apis mellife

서양종 꿀벌에 동양종 꿀벌 낭충병 바이러스 감염의 증거

2016 Apr 4;82(8):2256-62. doi: 10.1128/AEM.03292-15. Print 2016 Apr.

2016년 4월 4일

H. Goodrich-Blair, Editor

편집자 : H. 굳리치, 위스콘신 대학교

ABSTRACT

요약

Sacbrood virus (SBV) is one of the most destructive viruses in the Asian honeybee Apis cerana but is

much less destructive in Apis mellifera.  In previous studies, SBV isolates infecting A. cerana (AcSBV)

and SBV isolates infecting A. mellifera (AmSBV)were identified as different serotypes, suggesting a

species barrier in SBV infection.

낭충병 바이러스 (SBV)는 아시아 꿀벌종에서 가장 파괴적인 바이러스 중 하나이지만, 서양종 꿀벌에서는

훨씬 덜 파괴적이다.  이전 연구에서, 동양종 꿀벌을 감염시키는 SBV 분리종(AcSBV) 및 서양종 꿀벌을

감염시키는SBV 분리종(AmSBV)은 서로 다른 혈청형(血淸型)으로 확인되어, SBV 감염에서 종(種) 장벽을

시사한다.

In order to investigate this species isolation, we examined the presence of SBV infection in 318 A.

mellifera colonies and 64 A. cerana colonies, and we identified the genotypes of SBV isolates.

We also performed artificial infection experiments under both laboratory and field conditions.

이 종 분리를 조사하기 위해, 우리는 318개 서양종 꿀벌 봉군과 64개 동양종 꿀벌 봉군에서 SBV 

감염의 존재를 조사했고, SBV 분리종의 유전자형을 확인했다. 우리는 또한 실험실 및 현장 상황에서

인공감염 실험을 수행했다.

The results showed that 38 A. mellifera colonies and 37 A. cerana colonies were positive for SBV

infection.  Phylogenetic analysis based on RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) gene sequences

indicated that A. cerana isolates and most A. mellifera isolates formed two distinct clades but two

strains isolated from A. mellifera were clustered with the A. cerana isolates.

결과는 38개의 서양종 꿀벌 봉군과 37개의 동양종 꿀벌 봉군이 SBV 감염에 대해 양성인 것으로 나타

났다.  RNA- 의존성 RNA 중합 효소 (RdRp) 유전자 염기서열을 기반으로한 계통발생 분석은 동양종 꿀벌

분리종과 대부분의 서양종 꿀벌 분리종은 두 종류 별개의 분기군(分岐群)을 형성했지만, 서양종 꿀벌에서

분리된 두 변종은 동양종 꿀벌 분리종과는 한무리로 이루어졌음을 나타낸다.

주) 분기군(分岐群) :  공통의 조상으로부터 진화된 생물 분류군

In the artificial-infection experiments, AcSBV negative-strand RNA could be detected in both adult

bees and larvae of A. mellifera, although there were no obvious signs of the disease, demonstrating

the replication of AcSBV in A. mellifera.

인공 감염 실험에서, AcSBV의 음성가닥 RNA는 서양종 꿀벌의 성봉과 유충 모두에서 검출될 수 있지만,

서양종 꿀벌에서 AcSBV의 복제를 나타내는, 질병의 명백한 징후는 없다. 

Our results suggest that AcSBV is able to infect A. mellifera colonies with low preval‎‎ence

(0.63% in this study) and pathogenicity. This work will help explain the different susceptibilities of

A. cerana and A. mellifera to sacbrood disease and is potentially useful for guiding beekeeping practices.

우리의 결과는 AcSBV이 낮은 유병률 (이 연구에서 0.63 %)과 병원성을 가진 서양종 봉군을 감염시킬 수

있음을 나타낸다.  이 연구는 동양종 꿀벌과 서양종 꿀벌의 낭충병에 대한 다양한 설명하는데 도움이되며,

양봉 관행을 지도하는데 잠재적으로 유용하다.

INTRODUCTION

서론

Honeybees play vital roles in agriculture by providing pollination services to food crops and producing

honey and other hive products (1). European honeybees (Apis mellifera) and Asian honeybees

(Apis cerana) are two truly domesticated bee species in global apiculture (2, 3), but they are commonly

threatened by a myriad of parasites and pathogens (4).

꿀벌은 식량 작물에 수분업무를 제공하고 꿀 및 다른 봉산물을 생산함으로써 농업에서 중요한 역할을 한다 (1).

유럽 ​​꿀벌 (서양종)과 아시아 꿀벌 (동양종)은 세계 양봉에 있어 진정으로 길들여진 두 종류의 벌 종(種)이다

(2, 3).  그러나 벌들은 일반적으로 다양한 기생충과 병원균에 의해 위협을 받는다 (4).

Sacbrood virus (SBV), the first virus identified in honeybees (5), is a single-stranded, positive-sense RNA

virus belonging to the genus Iflavirus in the family Iflaviridae (6). The virus primarily affects the brood

stage of honeybees, causing failure of pupation and larval death (7), but also affects adult bees without

obvious signs of the disease (8–10).

꿀벌에서 확인된 첫번째 바이러스인 낭충병 바이러스 (SBV)는,  Iflaviridae과의 Iflavirus 속에 속하는 단일

가닥의 양성 감지 RNA 바이러스이다.  바이러스는 주로 꿀벌의 유충 단계에 영향을 끼쳐, 번데기화의 실패

및 유충 사망을 일으키지만, 또한 질병의 명백한 징후없이 성봉에도 영향을 미친다.

Sacbrood is characterized by the diseased-infected larva being encased in a tough, fluid-filled sac formed

from the larval cuticle. The transmission of SBV can occur horizontally, vertically, or both (11).

The preval‎‎ence of this virus has been investigated in various countries (4, 12–20).  SBV infection appears to

be less detrimental to A. mellifera colonies than to A. cerana colonies (21).

낭충병은 병에 걸려 감염된 유충이 유충의 표피에 형성된 질기고, 액체로 가득 찬 주머니 속에 싸여 있는 것이

특징이다.  낭충병의 전염은 수평적, 수직적 또는 양쪽 다 발생할 수 있다.  이 바이러스의 발병률은 여러 나라

에서 조사되었다.  낭충병 감염은 동양종 꿀벌 봉군보다 서양종 꿀벌 봉군에서는 덜 해롭다

In addition, it is unusual for SBV infection in A. mellifera colonies to cause colony death (22). However,

SBV is deadly to Asian honeybees, and serious mortality rates for A. cerana due to SBV infection have

been reported in Vietnam, Thailand, India, China, and South Korea (7, 23–26). Large-scale A. cerana colony

losses caused by SBV infection were first reported in Guangdong Province, China, in 1972 (27).

또한, 서양종 꿀벌 봉군의 SBV 감염이 봉군 사망의 원인이 되는 것은 드물다.  하지만, 낭충병은 아시아

꿀벌에게 치명적이며,  SBV 감염으로 인한 동양종 꿀벌의 심각한 사망률은 베트남, 태국, 인도, 중국 및

한국에서 보고되었다.   SBV 감염으로 인한, 대규모 동양종 꿀벌 봉군의 손실은 1972년 중국 광동성에서

처음으로 보고되었다.

Infection also resulted in serious A. cerana colony losses in South Korea (26, 28).

Previous studies reported that SBV isolates infecting A. cerana (AcSBV) and SBV isolates infecting

A. mellifera (AmSBV) represent two different serotypes (29) and are chemically distinct (30), suggesting

that AcSBV and AmSBV confer unique pathogenicities to their respective hosts.

감염은 또한 한국에서 심각한 동양종 꿀벌 손실을 초래했다. 이전의 연구에서는, 동양종 꿀벌을 감염시키는

SBV 분리종(AcSBV)과 서양종을 감염시키는 SBV 분리종(AmSBV)은 서로 다른 혈청형(血淸型)을 나타내고,

화학적으로 별개의 종으로 보고했으며, 이는 AcSBV 와 AmSBV이 각각의 숙주에 고유한 병원성을 부여한다는

것을 시사한다.

To understand the susceptibilities of A. cerana and A. mellifera bees to SBV isolated from different

honeybee species, studies of cross-species infections with AcSBV and AmSBV were performed.

In previous cross-infection studies conducted using AcSBV and AmSBV to challenge A. mellifera larvae

and A. cerana larvae, AmSBV and AcSBV were pathogenic only in A. mellifera larvae and A. cerana larvae,

respectively (31–33).

서로 다른 꿀벌종(種)에서 분리된 SBV에 대한 동양종과 서양종 꿀벌의 감수성을 이해하기 위해, AcSBV 와 

AmSBV 에 대한 종간 감염의 연구가 수행되었다.  서양종 유충과 동양종 유충에 도전(면역성 검사)하기

위해  AcSBV와 AmSBV를 사용하여 수행된 이전의 종간 감염 연구는, AmSBV와 AcSBV는 각각 서양종과

동양종 유충에서만 병원성이었다.

An A. mellifera isolate, AmSBV-Kor19 (GenBank accession number JQ390592), which is similar to A. cerana

isolates across most of its genome, was reported recently (26). Roberts and Anderson (29) pointed out

that cross-species SBV infection of A. cerana and A. mellifera may occur, because phylogenetic analysis

of SBV revealed that AmSBV-Kor19 is grouped with other A. cerana isolates.

서양종 분리종인, AmSBV-Kor19 (GenBank 수탁 번호 JQ390592) 바이러스는 대부분의 게놈(유전자 총체)

에 걸쳐 동양종 분리종과 유사한 것으로 최근에 보고되었다.

로버트 와 앤더슨은 SBV의 계통발생 분석 결과 AmSBV-Kor19는 다른 동양종 분리종과 무리지어(그룹화)

있다고 밝혔기 때문에, 동양종 및 서양종의 종간 SBV 감염이 발생할 수 있다고 밝혔다.

Therefore, there have been nonidentical views on cross-species infection. The objectives of this study were(i)

to survey for SBV infections in apparently healthy or weak A. mellifera and A. cerana colonies, (ii) to identify

genotypes of SBV isolates from A. mellifera and A. cerana colonies, and (iii) to eval‎‎uate the infectivity of

AcSBV in A. mellifera, both larvae and adults, under laboratory and field conditions.

따라서, 종간 감염에 대해 동일하지 않은 견해도 있었다.  본 연구의 목적은 (i) 명백하게 건강하거나 약한 서양종

및 동양종 봉군에서 SBV 감염에 대한 조사를 위한 것이고(ii), 동양종 및 서양종 봉군에서 분리한 SBV 의

유전자 유형을 식별하고 (iii), 실험실 및 현장 상황하에서, 유충과 성봉 모두, 서양종 꿀벌에서 AcSBV의 전염성을

평가하기 위한 것이다. 

MATERIALS AND METHODS

재료 및 방법

Sample collection for SBV detection.To survey SBV infections in field colonies, we sampled 279 A. mellifera

colonies from 20 apiaries and 38 A. cerana colonies from 7 apiaries in Zhejiang Province.  These colonies

were apparently healthy and strong, and 100 adult worker bees were randomly sampled from each of them.

SBV 검출을 위한 샘플 수집.  현장 봉군에서 낭충병 감염을 조사하기 위해, 우리는 저장성(중국)에 있는 

20곳의 양봉장에서 가져온 279개의 서양종 봉군과 7곳의 양봉장에서 가져온 38개의 동양종 봉군을 견본으로

시험하였다.  이 봉군은 분명히 건강하고 강군이었며, 100 마리의 성봉 일벌이 각각에서 무작위로 견본으로

시험하였다.

To increase the chances of positive detection of SBV, 39 weak A. mellifera colonies and 26 A. cerana

colonies showing symptoms of honeybee diseases were sampled. The symptoms of honeybee diseases

were defined as dead broods being observed in cells and/or significant numbers of dead adult worker

bees being observed in the hives or near the entrances

 SBV의 양성 검출 가능성을 높이기 위해, 39 개의 약군 서양종 봉군과 꿀벌질병 증상을 보이는 26개의

동양종 봉군을 견본으로 시험하였다.  꿀벌 질병의 증상은 벌방에서 죽은 유충이 관찰되고 / 또는 벌통이나

입구 근처에서 상당수의 죽은 성봉이 관찰되는 것으로 분명히 나타내었다.

From each of these colonies, 10 larvae were collected. Samples were stored at −80°C until used.

RNA extraction, RT-PCR, and sequencing.

이들 각각의 봉군에서, 10 마리의 유충이 수집되었다. 샘플은 사용될 때까지 -80 ° C에서 보관되었다.

RNA 추출, RT-PCR 및 염기서열.

RNA extraction and cDNA synthesis (except the cDNA synthesis for the detection of negative-strand RNA)

were performed using TRIzol reagent (Adilab, Beijing, China) and ReverTra Ace qPCR RT

(quantitative PCR-reverse transcription) [Note that I restored qPCR RT since that is likely how the

ReverTra Ace product is worded.] master mix (catalog number FSQ201; Toyobo, Shanghai, China),

respectively, by following the manufacturers' instructions.

RNA 추출 및 cDNA 합성 (음성 가닥 RNA 검출을위한 cDNA 합성 제외)은 TRIzol 시약

(Adilab, 베이징, 중국) 및 ReverTra Ace qPCR RT (정량적 PCR- 역전사)를 사용하여 수행되었다.

[Rever Tra Ace 제품이 사용되는 방식일 가능성이 높기 때문에 qPCR RT를 복원했다는 점에 유의하라.]

각각, 제조업체의 사용설명서에 따라 마스터 믹스 (카탈로그 번호 FSQ201; Toyobo, 중국 상하이).

The PCR volume of 50 μl was prepared using 2× Taq PCR StarMix (GenStar, Beijing, China), according to

the manufacturer's protocol, and the PCR amplification was conducted with an initial denaturation at 94°C

for 2 min, 35 cycles of 94°C for 30 s, 57°C for 30 s, and 72°C for 30 s, and finally 5 min at 72°C, with

the primers SB14f and SB15r (SB14f, 5′-AATGGTGCGGTGGACTATGG-3′; SB15r, 5′-TGATACAGAGCGGCTCGACA-3′)

(14), amplifying 579 bp of the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region.

제조업체의 프로토콜에 따라 2x Taq PCR StarMix (GenStar, Beijing, China)를 사용하여 50μl의 PCR 부피를

준비하고, PCR 증폭은 94 ° C에서 2 분 동안, 94 번의 사이클로 초기 변성으로 수행되었고, 30 초 동안 94° C,

30 초 동안 57 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 마지막으로 72 ° C에서 5 분, 프라이머 SB14f 및 SB15r 사용 (SB14f, 5'-AATGGTGCGGTGGACTATGG-3 '; SB15r, 5 '-TGATACAGAGCGGCTCGACA-3') (14), 579 bp의 RNA 의존성

RNA 중합 효소 (RdRp) 영역을 증폭한다.

Each PCR amplification included a negative control, in which the same volume of H2O was used instead

of template cDNA. The PCR products were analyzed by 2.5% agarose gel electrophoresis, and the positive

products were directly sequenced using an ABI 3730XL automatic sequencing system (Ruidi, Shanghai, China).

Sequence specificity analysis was performed using BLAST (NCBI).

각 PCR 증폭에는 모형 cDNA 대신 동일한 부피의 H2O가 사용된 음성 대조군이 포함되었다.  PCR 산물은 2.5 %

아가로스 겔 전기이동으로 분석되었고, 양성 산물은 ABI 3730XL 자동 시퀀싱 시스템 (Ruidi, Shanghai, China)

을 사용하여 직접 배열하였다(루이디, 상하이, 중국).  BLAST (NCBI)를 사용하여 서열 특이성 분석을 수행했다.

Phylogenetic analysis.MEGA5 was used to perform the phylogenetic analysis (34). The phylogenetic analysis

was conducted with the RdRp gene sequences of SBV-positive isolates obtained in this study and other

representative SBV homologous sequences, which were retrieved from the GenBank database.

계통 발생 분석 : MEGA5를 사용하여 계통 발생 분석을 수행했다. 계통 발생 분석은 본 연구에서 얻은 SBV

양성 분리종의 RdRp 유전자 서열과 GenBank 데이터베이스에서 검색된 다른 대표적인 SBV 상동 염기서열로

수행되었다.

Phylogenetic trees were constructed with the maximum likelihood (ML) method. The bootstrap values were

the results of 1,000 replicates, and the values below 50% were omitted.

계통수는 최대 가능성 (ML) 방법으로 구성되었다. 부트스트랩 값은 1,000회 복제 결과였고, 50 % 미만의 값은

생략되었다.

Inoculation experiments.

접종 실험.

(i) AcSBV preparation and quantitation. Larvae with overt symptoms of SBV infection

were sampled from an A. cerana colony; the colony had been confirmed to be infected with SBV but not

with the other six common honeybee viruses, namely, Acute bee paralysis virus (ABPV), Black queen cell virus

(BQCV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), Deformed wing virus (DWV), Israeli acute paralysis virus (IAPV),

and Kashmir bee virus (KBV), using RT-PCR with the method described previously (35).

(i) AcSBV 준비 및 정량.  SBV 감염의 명백한 증상이있는 유충은 동양종 꿀벌 봉군에서 샘플로 시험되었다 :

봉군이 SBV에 감염된 것으로 확인되었지만, 다른 6가지 일반적인 꿀벌 바이러스, 즉, 급성 꿀벌 마비 바이러스

(ABPV), 검은왕대 바이러스 (BQCV), 만성 꿀벌 마비 바이러스 (CBPV), 기형 날개 바이러스( DWV), 이스라엘

급성 마비 바이러스 (IAPV) 및 캐시미르 꿀벌 바이러스 (KBV), 이전에 설명한 방법으로 RT-PCR을 사용했다.

The SBV isolate was identified as typical SBV infecting A. cerana, namely, AcSBV, based on the alignment

of 579-bp RdRp gene sequences. The procedure to obtain concentrated AcSBV was conducted as

described by Bailey (9) but with dilution with phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.4 ± 0.2).

SBV 분리종은 579-bp RdRp 유전자 서열의 정렬을 기반으로, 동양종 꿀벌, 즉 AcSBV를 감염시키는

전형적인  SBV로 확인되었다.  농축된 AcSBV를 얻는 절차는 다음과 같이 수행되었다. Bailey에 의해

설명되었지만 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석 (pH 7.4 ± 0.2).

The supernatant was collected and used for inoculation; 180 μl of the solution was used for RNA

extraction, and RT-PCR was performed again, to confirm‎‎ the presence of SBV and the absence of

the other common viruses described above.

상청액(上淸液)을 수집하여 접종에 사용 하였다; 180μl의 용액을 RNA 추출에 사용하고 RT-PCR을 다시

수행하여 SBV의 존재와 위에서 설명한 다른 일반적인 바이러스의 부재를 확인했다.

주) 상청액 ; 배양액 윗물

Sequencing of the PCR products was conducted to confirm‎‎ the identity of the virus. The SBV concentration

was determined by an absolute quantification assay according to the method described previously (36),

with the following modifications. The primers were used for qPCR assays as reported previously (37), and

the primers were used to construct recombinant plasmids as reported previously (38).

바이러스의 동일성을 확인하기 위해 PCR 산물의 염기서열을 수행했다.  SBV 농도는 이전에 설명한 방법에

따라 다음과 같이 수정하여 절대 정량 분석에 의해 결정되었다.  프리머(기본지침서)는 이전에 보고 된대로

qPCR 분석을 위하여 사용 되었으며, 이전에 보고 된대로 재조합 플래즈미드를 구축하는데 프리머를 사용했다. 

 주) 플래즈미드 (plasmid) : 박테리아와 이스트에서 나타나듯이 자기 복제로 증식할 수 있는 유전 인자

The qRT-PCRs were performed in triplicate in an Eppendorf Mastercycler ep realplex system using SYBR

green (Thunderbird SYBR qPCR mix; Toyobo, Shanghai, China). The AcSBV concentration for the subsequent

experiments was approximately 4.0 ×105 copies/μl.  

qRT-PCR은 SYBR green (Thunderbird SYBR qPCR mix; Toyobo, Shanghai, China)을 사용하여 Eppendorf

Mastercycler ep realplex 시스템에서 세 번 수행되었다.  후속 실험을 위한 AcSBV 농도는 약 4.0 x105 카피/μl

였다.

(ii) Screening for viruses to identify healthy colonies.

    건강한 봉군을 식별하기 위한 바이러스 검사.

One hundred adult worker bees collected from A. mellifera or A. cerana colonies were checked, as a pooled

sample, for the presence of SBV and the other six common honeybee viruses mentioned above. The colonies

with no detectable viruses were used as the source of honeybee workers and larvae for inoculation.

서양종 또는 동양종 봉군에서 채취한 100 마리의 성봉을 모은 샘플로 SBV 및 위에서 언급한 다른 6가지

일반적인 꿀벌 바이러스의 존재 여부를 확인했다.  바이러스가 검출되지 않은 봉군은 접종을 위하여 꿀벌 일벌과

유충의 공급원으로 사용되었다.

(iii) Laboratory inoculation of larvae.

     실험실 유충의 접종

To determine the effects of AcSBV on the mortality and infection rates of third-instar larvae, which represent

the most sensitive stage for SBV infection (39), second-instar larvae of A. cerana and A. mellifera were carefully

transferred to 48-well culture plates containing 150 μl artificial diet (40) and then were placed in an incubator

set at 34 ± 0.5°C, with 70% ± 5% relative humidity (Stik, Shanghai, China).

AcSBV가 SBV 감염에 가장 민감한 단계 (39)를 나타내는 3일령 유충의 사망률 및 감염률에 미치는 영향을

확인하기 위해, 동양종 및 서양종 꿀벌의 2일령 유충을 150μl의 인공 사료 (40)가 들어 있는 48 웰 배양 접시로

조심스럽게 옮겼다,  그리고 나서 70 % ± 5 % 상대 습도 (Stik, Shanghai, China)로 34 ± 0.5 ° C로 설정된

인큐베이터에 배치했다.

The second-instar larvae were obtained as described previously (33). After 24 h, the third-instar larvae of

A. cerana and A. mellifera were transferred individually to other 48-well culture plates containing 130 μl artificial

diet, as described above. Fifteen microliters of AcSBV solution was added to each well for the experimental

groups, and 15 μl PBS was added for the control groups.

2일령 유충은 이전에 설명한대로 획득했다.  24 시간 후,  동양종 및 서양종의 3일령 유충은 위에서 설명한대로,

130μl 인공 사료가 들어 있는 다른 48 웰 배양 접시로 개별적으로 옮겼다.  실험군의 경우 각 웰에 15μl의 AcSBV

용액을 첨가하고, 대조군에는 15μl의 PBS를 첨가 하였다.

After another 24 h, the bee larvae were washed 3 times with ultrapure water and kept at −80°C for later use.

Every treatment was tested with 3 replicates, and each replicate contained 20 larvae. The deaths of larvae were

confirmed by identifying the color of their bodies changing from white to yellow or even dark gray and then

noting no response when the larvae were touched with a soft tip.

24 시간 후에 꿀벌 유충을 초순수 물로 3회 세척하고 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관했다. 모든 처리는

3번의 반복으로 테스트하였고 각 반복은 20 마리의 유충이 포함되었다. 유충의 죽음은 몸의색이 흰색에서

노란색 또는 짙은 회색으로 변하는 것을 확인한 다음, 유충이 부드러운 끝으로 닿았을 때 반응이 없음을 주의 깊게

관찰함으로써 확인하였다.

RT-PCR was performed to confirm‎‎ whether the larvae were infected with AcSBV (15). In total, 15 positive

samples of A. mellifera were randomly chosen to verify the identity of strains by sequencing. RNA from

another 5 positive samples from each replicate was pooled and used to detect the negative-strand AcSBV

RNA.

 RT-PCR을 수행하여 유충이 AcSBV에 감염되었는지 확인했다. 총 15개의 서양종 꿀벌 양성 샘플을 무작위로

선택하여 염기서열을 통해 계통의 동일성을 확인했다. 각 복제물에서 또 다른 5 개의 양성 샘플로 부터 얻은

RNA는 모아졌고, 음성 가닥 AcSBV RNA를 검출하는데 사용되었다.

(iv) Laboratory inoculation of adult bees.

성봉의 실험실 접종.

Newly emerged bees (A. mellifera and A. cerana) were individually inoculated with 3 μl AcSBV preparation

(experimental groups) or PBS containing 10% honey (control groups), using a Hamilton syringe to feed

the bees. Fifty honeybees per cage were kept at 34 ± 0.5°C and 70% ± 5% relative humidity in an incubator

(Stik, Shanghai, China) and were fed pollen that had been treated with UV light for 24 h and 50% (vol/vol)

sucrose solution.

 새로 출현 한 꿀벌 (서양종 및 동양종 꿀벌)에 3μl AcSBV 표본 (실험군) 또는 10 % 꿀이 포함된 PBS (대조군)

를 개별적으로 접종하여 해밀턴 주사기를 사용하여 벌에게 먹이를 준다.  인큐베이터 (스틱, 상하이, 중국)에서

케이지 당 50 마리의 꿀벌을 34 ± 0.5 ° C 및 70 % ± 5 % 상대 습도로 유지하고, 24 시간 동안 자외선으로

처리된 화분과 50 % (vol / vol) 자당 용액을 먹였다. 4 회 처리, 각각 3 회 반복. 입증되었다.

Four treatments, each with 3 replicates. were established. Dead bees were recorded and removed daily

until day 10 after inoculation. Four bees were collected from each cage at days 0, 2, 6, and 10 and were

used to quantify the AcSBV. RNA from another 6 positive adult workers from days 2, 6, and 10 was pooled

and used to detect the negative-strand AcSBV RNA.

 4 회 처리, 각각 3 회 반복. 입증되었다.  접종 후 10 일까지 죽은 벌을 기록하고 매일 제거 하였다. 0, 2, 6 및

10 일에 각 케이지에서 4 마리의 꿀벌을 수집하여 AcSBV를 정량화하는데 사용 되었다. 2 일, 6 일, 10 일에

다른 6 마리의 양성 성봉 일벌의 RNA를 모아 음성 가닥 AcSBV RNA를 검출하는 데 사용했다.

(v) Quantification of AcSBV in adult bees by real-time qPCR.

    실시간 qPCR에 의한 성봉의 AcSBV 정량화.

The titers of AcSBV in adult bees (A. mellifera and A. cerana) were quantified by a two-step SYBR green

real-time qPCR assay. RNA extraction, cDNA synthesis, and a qPCR assay with a final total volume of 20 μl

were carried out as described above. The cDNA was generated from 1 μg of total RNA and diluted 1:5.

The primer pairs for AcSBV (22) and the reference gene (β-actin) (41) were reported previously.

성봉 (서양종 및 동양종)에서 AcSBV의 역가는 2단계 SYBR 녹색 실시간 qPCR 분석에 의해 정량화되었다.

RNA 추출, cDNA 합성, 그리고 최종 총 부피가 20 μl 인 qPCR 분석은 위에서 설명한대로 수행되었다.

cDNA는 1μg의 총 RNA로부터 생성되었고 1 : 5로 희석되었다.  AcSBV (22) 및 참조 유전자 (β-actin)에 대한

프라이머 1 쌍은 이전에 보고되었다.

The PCR program was as follows: 1 min at 95°C and 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min, followed

by a melt curve analysis. PCR amplification for each sample was performed in triplicate, to address the

variability of the analysis process. The relative titers of AcSBV were calculated according to the 2−ΔΔCT

method (42).

PCR 프로그램은 다음과 같았다 : 95 ° C에서 1분, 15초 동안 95 ° C 40 사이클, 1분 동안 60 ° C, 뒤를 이어

용융 곡선 분석.  분석 과정의 다양성을 처리하기 위해 각 샘플에 대한 PCR 증폭을 3회 수행했다.  AcSBV의

상대 역가는 2-ΔΔCT 방법에 따라 계산되었다.

(vi) Colony inoculation.

     봉군 접종

In order to investigate the ability of AcSBV to infect A. mellifera in the field, three A. mellifera colonies that

were free of SBV infection, as confirmed by RT-PCR, were selected for the inoculation experiment. One liter

of sugar syrup mixed with 2 ml AcSBV solution was fed to each colony.

현장에서 서양종 꿀벌을 감염시키는 AcSBV의 능력을 조사하기 위해, RT-PCR로 확인된 것처럼, SBV 감염이

없는 3개의 서양종 봉군을 접종 실험용으로 선택했다.  AcSBV 용액 2ml와 혼합된 당액 1리터를 각 봉군에

공급했다.

At day 5 after feeding, the clinical symptoms of SBV were observed in the colonies, and 20 larvae that were

ready to pupate and 20 adult worker bees were randomly collected from each experimental colony. Each

larva or bee was checked by RT-PCR for the presence of AcSBV, according to the procedure introduced

above.

급이 후 5일째에, 낭충병의 임상 증상이 봉군에서 관찰되었으며, 번데기 준비가 된 20 마리의 유충과 20 마리의

성봉 일벌이 각 실험 봉군에서 무작위로 수집되었다.  각 유충 또는 벌은 위에서 소개 한 절차에 따라, RT-PCR로

AcSBV의 존재를 확인했다.

PCR products of 5 positive samples were randomly selected to confirm‎‎ the identity of SBV by sequencing. RNA

of 10 positive adult workers and 10 positive larvae from each colony was pooled and used to detect the

negative-strand AcSBV RNA. Tagged RT-PCR for detection of negative-strand AcSBV RNA.  Negative-strand

(replicative intermediate) RNA has been regarded as an indicator of ongoing replication of positive-strand

RNA viruses (43).

5개의 양성 샘플의 PCR 산물을 무작위로 선택하여 염기서열을 통해 SBV 의 동일성을 확인했다.  각 봉군에서

10마리의 양성 성봉 일벌과 10 마리의 양성 유충의 RNA를 모아 음성 가닥 AcSBV RNA를 검출하는데 사용했다.

음성 가닥 AcSBV RNA 검출을 위한 태그가 붙은 RT-PCR.  음성 가닥(복제 중간체) RNA는 양성 가닥 RNA

바이러스의 지속적인 복제 지표로 간주되어 왔다.

Therefore, detection of negative-strand RNA is indicative of viral replication. Tagged RT-PCR has been

developed to improve the specific detection of negative-strand RNA (44) and has already been used to

confirm‎‎ the replication of honeybee viruses (45–47).

따라서 음성 가닥 RNA의 검출은 바이러스 복제를 나타낸다.  태그가 붙은 RT-PCR은 음성 가닥 RNA (44)의

특정 검출을 개선하기 위해 개발되었으며, 이미 꿀벌 바이러스 (45-47)의 복제를 확인하기 위해 사용되어 왔다.

The reverse transcription (RT) reaction was performed using the ReverTra Ace RT-qPCR kit (catalog number

FSQ101; Toyobo, Shanghai, China), by following the standard protocol with modifications. The reaction was

performed at 55°C for 30 min in the presence of the primer Tag -SB7f

(5′agcctgcgcaccgtggGGAGATGTTAGAAATACCAACCGATTCC-3′ [lowercase letters indicate the Tag primer]);

the reaction volume was 20 μl, with 4 μg RNA.

역전사 (RT) 반응은 수정된 표준 프로토콜에 따라 ReverTra Ace RT-qPCR 키트 (카탈로그 번호 FSQ101;

Toyobo, 상하이, 중국)를 사용하여 수행되었다.  반응은 프리머 Tag-SB7f (5'-agcctgcgcaccgtggGGAGATGTTAGAAATACCAACCGATTCC-3 '[소문자는 Tag 프라이머를 나타냄])의 존재하에

55 ° C에서 30분 동안 수행되었다; 반응 부피는 4μg RNA와 함께 20μl였다.

The RT product was purified with the MinElute reaction cleanup kit (Qiagen, Germany), according to the

manufacturer's instructions, which can avoid false-positive results (48), and then was used to conduct PCR

assays using the primer pair Tag (forward primer, 5′-AGCCTGCGCACCGTGG-3′) (45) and SB8r (reverse primer,

5′-CCATTAAACAAATCGGTATAAGAGTCCACT-3′).

RT 제품은 제조업자의 사용설명서에 따라, MinElute 반응 클린업 키트 (Qiagen, Germany)로 정제하여,

허위양성(虛僞陽性) 결과를 피할 수 있다, 그런 다음 프리머 쌍 태그 (forward primer)를 사용하여 PCR

분석을 수행하는데 사용되었다 , 5'-AGCCTGCGCACCGTGG-3 ') (45) 및 SB8r (역방향 프라이머, 5'-CCATTAAACAAATCGGTATAAGAGTCCACT-3').

The reaction mixtures were first denatured at 94°C for 30 s and then subjected to 35 cycles of 94°C for 30 s,

57°C for 30 s, and 72°C for 30 s, with a final extension step at 72°C for 5 min. The RT reaction without the

primer Tag-SB7f served as the negative control. At the end of the PCR, 5 μl product per reaction was used

for analysis on a 2.5% agarose gel.

반응 혼합물을 먼저 94 ° C에서 30초 동안 변성시킨 다음, 30 초 동안 94 °C, 30 초 동안 57 °C, 30 초 동안

72 °C의 35 사이클을 적용하고 최종 연장 단계는 72 ° 이다. C에서 5 분. 프라이머 Tag-SB7f가 없는 RT 반응은

음성 대조군으로 사용되었다.

Data analysis.

자료 분석

The normality of data sets was tested using the Shapiro-Wilk test. Data sets with normal distribution were

compared with the parametric Student's t test. Data sets with nonnormal distribution were analyzed using

the lower-power nonparametric Mann-Whitney U test.

데이터 세트의 정규성은 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 테스트 되었다. 정규 분포를 사용하는 데이터 세트는

모수 스튜던트 t 검정과 비교 되었다. 비정규 분포가 있는 데이터 세트는 저전력 비모수 Mann-Whitney U 검정을

사용하여 분석 되었다.

A chi-square test was performed to compare SBV infection rates in A. mellifera and A. cerana colonies.

Kaplan-Meier survival curves were used to plot and to interpret the survival data. Survival curves were

compared using log rank tests. Data are shown as averages ± standard deviations (SDs). P values of

<0.05 were considered statistically significant.

동양종 및 서양종 봉군에서 낭충병 바이러스 감염률을 비교하기 위해 카이자승 검증을 수행했다.

Kaplan-Meier 생존 곡선은 생존 데이터를 구상하고 해석하는데 사용되었다.  로그 순위 테스트를 사용하여

생존 곡선을 비교했다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시된다. <0.05>의 P 값은 통계학상으로 중대한

것으로 간주되었다.

Nucleotide sequence accession numbers.

핵산 염기서열 수탁 번호.

The genomic sequence of SBV reported in this paper has been submitted to the GenBank database under

accession numbers KT205289 to KT205304 and KT734782 to KT734791.

본 논문에 보고된 SBV의 유전체 염기 서열은 GenBank 데이터베이스에 등록 번호 KT205289 ~ KT205304 및

KT734782 ~ KT734791로 제출되었다.

RESULTS

결과

Rates of SBV infection in A. mellifera and A. cerana colonies.

서양종 및 동양종 봉군에서 낭충병 바이러스 감염률.

Of the 279 A. mellifera colonies and 38 A. cerana colonies examined with adult bees, SBV was identified in

29 (10.39%) and 11 (28.95%), respectively, showing a significant difference between species

(χ2 = 8.83; P = 0.003).  In the A. mellifera colonies showing disease symptoms (see “Sample collection for

SBV detection”above for the definition), the SBV infection rate was 23.08%; in the diseased A. cerana

colonies, the infection rate was found to be 100% (χ2 = 37.14; P < 0.001).

성봉으로 조사한 279개의 서양종 봉군과 38개의 동양종 봉군 중에서, SBV는 각각, 29개 (10.39 %)

및 11개 (28.95 %)에서 확인되었고, 종 간의 상당한 차이를 보여 준다 (χ2 = 8.83; P = 0.003).

질병 증상을 보이는 서양종 봉군 (정의는 위의 "낭충병 바이러스 검출을 위한 샘플 수집"참조)에서 SBV 감염률은

23.08 %였습니다 ; 동양종 봉군에서 감염률은 100 %인 것으로 알아냈다 (χ2 = 37.14; P <0.001).

Phylogenetic analysis.

계통 발생 분석. 

The evolutionary tree of SBV isolates is presented in Fig. 1, with representative homologous sequences

retrieved from the NCBI database and obtained in the survey.

낭충병 바이러스 분리종의 진화 계통은 그림 1에 제시되어 있으며, NCBI 데이터베이스에서 검색하고

조사에서 얻은 대표적인 상동 염기서열이 함께 제시되어 있다.

As reported by Roberts and Anderson (29) and Grabensteiner et al. (14), the phylogenetic tree of SBV based

on RdRp gene sequences had four clades, corresponding to four genotypes of SBV, namely, Asian genotype,

New Guinean genotype, European genotype, and South African genotype.

로버트와 앤더슨 (29) 및 그래벤스타인 외. (14), RdRp 유전자 염기서열을 기반으로 한 낭충병 바이러스의

계통발생 관계는 낭충병 바이러스의 4 가지 유전자형, 즉 아시아 유전자형, 뉴기니 유전자형, 유럽 유전자형

및 남아프리카 유전자형에 해당하는, 4 개의 분기군을 가졌다.

주) 분기군(分岐群): 공통의 조상에서 진화된 생물군.

A. mellifera SBV isolates were clustered with the two previously reported SBV isolates isolated from

A. mellifera in China (49), forming a separate clade.  A. cerana SBV strains isolated in this study were

clustered with other SBV strains isolated from A. cerana in Asian countries.

서양종 꿀벌 SBV 분리종은 중국의 서양종 꿀벌 SBV에서 분리된 이전에 보고된 SBV 분리종 2개와 무리지어,

별도의  분기군(分岐群)을 형성했다. 이 연구에서 분리된 동양종 SBV 변종은 아시아 국가의 동양종에서 분리된

다른 SBV 변종과 함께 무리지었다.

However, it must be noted that two A. mellifera SBV isolates were clustered with A. cerana SBV isolates

and two previously reported A. mellifera isolates (GenBank accession numbers JQ390592 and AF284690),

but in this case the occurrence rate was only 0.63%.

그러나, 서양종 SBV 분리종 2종이 동양종 SBV 분리종 및 이전에 보고된 서양종 분리종 2종 (GenBank

수탁 번호 JQ390592 및 AF284690)과 함께 무리 짓는다는 것을 주목해야 하지만, 이 경우 발생률은 0.63 %에

불과했습니다.

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FIG 1

그림 1

Maximum likelihood consensus tree of SBV isolates.

SBV 분리종의 최대 가능성 합의 계통도. 

A 386-bp region of the RNA-dependent RNA

polymerase gene was used. The tree was constructed with a Tamura 3-parameter distance model.

The statistical significance of a particular tree topology is eval‎‎uated by bootstrap resampling of the

sequences 1,000 times, and bootstrap values of <50% are omitted.

RNA 의존성 RNA 중합 효소 유전자의 386-bp 영역이 사용되었다. 계통도는 Tamura 3- 한계 거리 모델로

구성되었다.  특정 계통도(관계) 지형학 통계상 중요성은 염기서열을 1,000 회 부트스트랩 리샘플링하여

평가되었고 <50 %의 부트스트랩 값은 생략되었다.

Numbers on the nodes indicate clade credibility values. New isolates of A. mellifera (circles) and A. cerana

(triangles) described in this study are indicated. Strains are annotated with respect to country of isolation,

virus host, and GenBank accession number. Am, A. mellifera; Ac, A. cerana.

마디(결절)의 숫자는 분기군(分岐群) 신뢰도 값을 나타낸다.  이 연구에서 설명된 서양종 (원형) 및 동양종(삼각형)

의 새로운 분리종이 표시된다.  변종은 분리 국가, 바이러 숙주 및 GenBank 수탁 번호와 관련하여 주석이 달려

있다.  Am, 서양종 꿀벌; Ac, 동양종 꿀벌

Mortality and infection rates of larvae after laboratory AcSBV challenge.

실험실 AcSBV 면역성 검사 후 유충의 사망률 및 감염률. 

Infection was identified in 100% of A. mellifera and A. cerana larvae challenged with AcSBV. No clinical

symptoms were observed in A. mellifera larvae infected with AcSBV. No significant difference in mortality

rates for A. mellifera larvae was found between the AcSBV-inoculated larvae (8.3%) and the control group

(5.0%) (U = 2.500; P = 0.346) (Fig. 2A).

AcSBV로 면역성 검사를 한 서양종 및 동양종의 유충의 100 %에서 감염이 확인되었다.  AcSBV에 감염된

서양종 유충에서는 임상 증상이 관찰되지 않았다. 서양종 유충의 사망률에서 AcSBV 접종 유충 (8.3 %)과

대조군 (5.0 %) (U = 2.500; P = 0.346) 사이에 상당한 차이가 발견되지 않았다 (그림 2A).

However, the mortality rate of A. cerana larvae (51.7%) challenged with AcSBV was significantly higher

than that of A. cerana larvae (13.3%) without the AcSBV challenge (U = 0; P = 0.043) (Fig. 2A).

그러나, AcSBV로 면역성 검사를 한 동양종 유충 (51.7 %)의 사망률은 AcSBV 면역성 검사를 하지 않은

동양종 유충 (13.3 %)보다 상당히 높았다 (U = 0; P = 0.043) (그림 2A).

<img class="highwire-fragment fragment-image" alt="FIG 2" src="https://aem.asm.org/content/aem/82/8/2256/F2.medium.gif" width="440" height="240"/>

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FIG 2

그림 2

Larval mortality rates at 24 h after inoculation (A) and survival rates of adult workers (B) of A. cerana (Ac)

and A. mellifera (Am) inoculated with AcSBV under laboratory conditions. In panel A, the boxes represent

first quartiles and third quartiles, the horizontal lines indicate the median, and the whiskers represent the

minimum and maximum for all observed values.

실험실 상황에서 AcSBV로 접종된 동양종과 서양종의 접종 후 24시간 후 유충 사망률 (A) 및  성봉 일벌의

생존률 (B).

패널 A에서, 상자는 1 사분위수와 3 사분위수를 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내고, 위스커는 모든

관측 값에 대한 최소값과 최대 값을 나타낸다.

Mortality rates of larvae and survival rates of adult workers were calculated from 20 larvae and 50 adult

workers per treatment group, respectively. Am/PBS, A. mellifera larvae fed PBS; Am/AcSBV, A. mellifera l

arvae infected with AcSBV; Ac/PBS, A. cerana larvae fed PBS; Ac/AcSBV, A. cerana larvae infected with

AcSBV. The data are averages from three replicates. *, P < 0.05.

유충의 사망률과 성봉 일벌의 생존률은 각각 처리 군당 20 마리의 유충과 50 마리의 성봉 일벌로 계산되었다.

서양종 유충 공급 PBS; Am / AcSBV, AcSBV로 감염된 서양종 유충; Ac / PBS, A. 동양종 유충 공급 PBS;

Ac / AcSBV, AcSBV에 감염된 동양종 유충. 데이터는 세 번의 복제에서 얻은 평균이다. *, P <0.05.

Survival of inoculated adult bees.

접종된 성봉 일벌의 생존.

Log rank tests indicated that there was no significant difference in survival between A. mellifera fed AcSBV

and PBS (χ2 = 0.912; P = 0.340) (Fig. 2B). In addition, AcSBV treatment did not significantly affect the survival

of A. cerana, compared with the control group treated with PBS (χ2 = 1.210; P = 0.271) (Fig. 2B).

로그 순위 테스트는 AcSBV를 먹인 서양종과 PBS (χ2 = 0.912; P = 0.340) 사이에 생존에 상당한 차이가 없음을

나타낸다 (그림 2B). 또한, AcSBV 처리는 PBS로 처리된 대조군과 비교하여, 동양종의 생존에 크게 영향을 주지

않았다 (χ2 = 1.210; P = 0.271) (그림 2B).

AcSBV proliferation in inoculated adult bees.

접종된 성봉에서 AcSBV 증식.

The genotypes of strains were verified to be AcSBV, and the samples of A. mellifera and A. cerana used for

qRT-PCR analysis were all positive. The proliferation of AcSBV in A. mellifera and A. cerana is presented in

Fig. 3A and B, respectively.

변종의 유전자형은 AcSBV로 확인되었고, qRT-PCR 분석에 사용된 서양종 및 동양종의 샘플은 모두 양성이었다.

서양종 및 동양종에서 AcSBV의 증식은 각각 그림 3A와 B에 제시되어 있다.

In terms of AcSBV in A. mellifera, the AcSBV titers on days 2, 6, and 10 showed 6.42 ± 0.73-fold, 259.18 ±

124.34-fold, and 359.39 ± 161.76-fold changes, respectively, compared to the day 0 titer.

In addition, there were significant differences in AcSBV titers for day 0 versus day 2 (U = 0; P < 0.001) and

day 2 versus day 6 (U = 14.000; P = 0.004), but no significant difference was observed for day 6 versus day 10

(U = 52.000; P = 0.833).

서양종의 AcSBV의 관점에서, 2일, 6일 및 10일의 AcSBV 역가는 0일 역가와 비교하여, 각각, 6.42 ± 0.73 배,

259.18 ± 124.34 배 및 359.39 ± 161.76 배 변화를 나타냈다.  또한, 0일 대 2일 (U = 0; P <0.001) 및 2일 대

6일 (U = 14.000; P = 0.004) 동안 AcSBV 역가에 상당한 차이가 있었지만, 6 일 동안에는 상당한 차이가

관찰되지 않았다. 10일차 대비 (U = 52.000; P = 0.833).

Compared with day 0, the titers of AcSBV in A. cerana on days 2, 6, and 10 showed 33.63 ± 10.54-fold,

353.25 ± 63.18-fold, and 255.96 ± 74.56-fold changes, respectively. Furthermore, significant differences

were found for day 0 versus day 2 (U = 12.000; P < 0.001) and day 2 versus day 6 (U = 2.000; P < 0.001),

but there was no significant difference between day 6 and day 10 (t = 0.952; P = 0.353).

0일과 비교하여, 2일, 6일 및 10일에 동양종에서 AcSBV의 역가는 각각 33.63 ± 10.54배, 353.25 ± 63.18배

및 255.96 ± 74.56 배 변화를 나타 냈다.  또한, 0일 대 2일 (U = 12.000; P <0.001) 및 2일 대 6일

(U = 2.000; P <0.001)에서 상당한 차이가 발견되었지만, 6일과 10일 사이에는 상당한 차이가 없었다

( t = 0.952; P = 0.353).

In addition, it should be noted that the increases in AcSBV titers in A. mellifera were less than those in

A. cerana during the first 6 days after inoculation. Surprisingly, however, the increases in AcSBV titers

within 10 days were more substantial in A. mellifera.

또한, 서양종에서 AcSBV 역가의 증가는 접종 후 첫 6일 동안 동양종에서 보다 적었다는 점에 주목해야 한다.

그러나, 놀랍게도 10일 이내 AcSBV 역가의 증가는 서양종에서 더 상당했다.

<img class="highwire-fragment fragment-image" alt="FIG 3" src="https://aem.asm.org/content/aem/82/8/2256/F3.medium.gif" width="440" height="137"/>

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FIG 3

그림 3

Relative quantification of AcSBV in A. mellifera (A) and A. cerana (B) adult workers inoculated under laboratory

conditions. Twelve bees were collected on days 0, 2, 6, and 10 and used for quantification. D, day. **, P < 0.01;

***, P < 0.001. Infection in A. mellifera colonies fed AcSBV.  At day 5 after feeding, no clinical symptoms of SBV

were observed in the colonies. However, the infection rates for larvae and adult bees in the colonies fed AcSBV

solution were found to be 90.5% (54/60 larvae) and 62.2% (37/60 adult bees), respectively (U = 2.000; P = 0.268).

실험실 조건에서 접종된 서양종 꿀벌 (A) 및 A. 동양종 꿀벌 (B) 성봉 일벌에서 AcSBV의 상대적 정량화.

0, 2, 6 및 10 일에 12 마리의 꿀벌을 수집하여 정량화에 사용했다. D, 데이. **, P <0.01; ***, P <0.001. AcSBV를

먹인 서양종 꿀벌의 감염.  급이 후 5 일째에 봉군에서 낭충병 바이러스의 임상 증상이 관찰되지 않았다.  

그러나, AcSBV 용액을 먹인 봉군에서 유충과 성봉의 감염률은 각각 90.5 % (54/60 유충)와 62.2 % (37/60 성봉)인

것으로 밝혀졌다 (U = 2.000; P = 0.268).

Presence of AcSBV negative-strand RNA. Figure 4 shows the results of detection of AcSBV negative-strand RNA

in A. mellifera adult bees and larvae inoculated under laboratory and field conditions.  AcSBV negative-strand

RNA could be detected in all A. mellifera samples randomly collected in the experiments.

AcSBV 음성 가닥 RNA의 존재. 그림 4는 실험실 및 현장 상황에서 접종된 서양종 꿀벌 성봉 및 유충에서 AcSBV

음성 가닥 RNA의 검출 결과를 보여 준다.

AcSBV 네거티브 가닥 RNA는 실험에서 무작위로 수집된 모든 서양종 꿀벌 샘플에서 검출될 수 있다.

When the Tag-SB7f primers were omitted from the cDNA synthesis, no false-positive PCR signals occurred.

Compared with the samples inoculated under laboratory conditions, the nucleic acid bands (Fig. 4C and D)

of samples inoculated under field conditions were much weaker.

Tag-SB7f 프리머가 cDNA 합성에서 생략되었을 때, 허위양성(虛僞陽性) PCR 신호는 발생하지 않았다.

실험실 조건에서 접종 한 샘플과 비교하여, 현장 조건에서 접종한 샘플의 핵산 밴드 (그림 4C 및 D)가 훨씬

약했다.

<img class="highwire-fragment fragment-image" alt="FIG 4" src="https://aem.asm.org/content/aem/82/8/2256/F4.medium.gif" width="440" height="286"/>

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FIG 4

그림 4

Detection of negative-strand RNA of AcSBV in A. mellifera larvae and adult workers. Lanes 1, 3, and 5,

samples obtained on days 2, 6, and 10, respectively; lanes 2, 4, and 6, negative controls without Tag-SB7f

primers; lane 7, negative control without the DNA template.  Lanes 1, 3, and 5 in panel A represent pooled

samples of 6 bees from each of 3 replicates on each day; in panels B, C, and D, results of one replicate are

shown. (A) Adult worker bees challenged with AcSBV in the laboratory. (B) Larvae challenged with AcSBV in

the laboratory. (C) Adult worker bees challenged with AcSBV in a colony. (D) Larvae challenged with AcSBV

in a colony.

서양종 꿀벌 유충 및 성봉 일벌에서 AcSBV의 음성 가닥 RNA 검출.  레인 1, 3 및 5, 각각 2, 6 및 10 일에

획득한 샘플; 레인 2, 4 및 6, Tag-SB7f 프리머가 없는 음성 대조군; 레인 7, DNA 모형이 없는 음성 대조군.

패널 A의 1, 3, 5 번 레인은 매일 3번의 복제 실험에서 6마리의 벌을 모은 샘플을 나타낸다.  패널 B, C 및

D에는 한 번의 복제 결과가 나타 내었다.

(A) 실험실에서 AcSBV에 면역성 감사를 받은 성봉 일벌. (B) 애벌레는 실험실에서 AcSBV로 면역성 검사를

했다. (C) 봉군에서 AcSBV로 면역성 검사를 한 성봉 일벌. (D) 봉군에서 AcSBV로 면역성 검사를 한 유충.

DISCUSSION

토론

Most previous studies (31–33) concluded that there was no cross-species infection between AcSBV and AmSBV,

based on the pathogenicity in larvae during the course of the experiments.

대부분의 이전 연구 (31-33)는 실험 과정에서 유충의 병원성에 근거하여, AcSBV와 AmSBV 사이에 종간 감염이

없다고 결론지었다.

However, an A. mellifera isolate, AmSBV-Kor19 (GenBank accession number JQ390592), was found to be distinct

from other A. mellifera isolates in the genome (26) and clustered together with A. cerana isolates in the

phylogenetic tree (29). One explanation is that this special A. mellifera isolate was the SBV that typically infects

A. cerana or the SBV was recently transferred from A. cerana.

그러나 서양종 꿀벌 분리종(아종)인, AmSBV-Kor19 (GenBank 수탁 번호 JQ390592)는 게놈에서 다른 서양종

꿀벌 분리종과 구별되며, 계통발생 관계에서 동양종 꿀벌 분리종과 함께 무리짓는 것으로 밝혀졌다. 

한 가지 설명할 것은 이 특별한 서양종 꿀벌 분리종은 동양종 꿀벌을 전형적으로 감염시키는 SBV이었거나,

최근에 SBV가 동양종에서 옮겨 왔다는 것이다.

In the present study, most A. mellifera SBV isolates were clustered with the two previously reported SBV strains

isolated from A. mellifera in China (49), forming a separate clade. This suggests a consequence of the climatic

conditions of China and the resulting changes in host biology.

현재 연구에서, 대부분의 서양종 꿀벌 SBV 분리종은 중국의 서양종 꿀벌에서 분리된 이전에 보고된 SBV 변종

2개가 모여 별도의 분기군(分岐群)을 형성했다. 이것은 중국의 기후 조건과 그에 따른 숙주 생물학에 변화의

결과라고 시사한다.

주) 분기군(分岐群): 공통의 조상에서 진화된 생물군.

However, two special AmSBV isolates were found among 38 A. mellifera isolates, which were recovered from 318

A. mellifera colonies. Similar to AmSBV-Kor19, these two AmSBV isolates were grouped together with A. cerana

isolates in the phylogenetic tree. These results supported the hypothesis that cross-species infection of AcSBV

may occur, but with low occurrence rates.

그러나, 두 개의 특별한  AmSBV 분리종이 38개 서양종 꿀벌 분리종 중에서 발견되었는데, 이는 318개 서양종 봉군

에서 재생되었다.  AmSBV-Kor19와 유사하게, 이 두 AmSBV 분리종은 계통발생 관계에서 동양종 꿀벌 분리종과

함께 그룹화되었다. 이러한 결과는 AcSBV의 종간 감염이 발생할 수 있지만 발생률이 낮다는 가설을 뒷받침한다.

Our inoculation experiments with AcSBV under laboratory and field conditions confirmed the hypothesis.

Unlike previous studies in which only death and pupation of larvae were observed (31–33), we employed another

diagnostic method by examining the presence of AcSBV negative-strand RNA. This method allowed us to detect

the replication of virus even when the pathogenicity was very low.

실험실 및 현장 상황에서 AcSBV를 사용한 접종 실험은 가설을 확인했다. 유충의 죽음과 번식만 관찰된 이전 연구

(31–33)와 달리, AcSBV 음성 가닥 RNA의 존재를 검사하여 다른 진단 방법을 사용했다.

이 방법을 통해 병원성이 매우 낮은 경우에도 바이러스 복제를 감지할 수있었다.

Although the A. mellifera larvae infected with AcSBV under either laboratory or field conditions had no obvious

signs of the disease, as demonstrated in previously reported experiments (31–33), AcSBV negative-strand RNA

could be detected in A. mellifera larvae (Fig. 4B and D), which suggests that the genome of AcSBV is able to

replicate in A. mellifera larvae.

실험실이나 현장 조건에서 AcSBV에 감염된 서양종 유충은 이전에 보고된 실험 (31–33)에서 입증된 것처럼, 질병의

명백한 징후가 없었지만, 서양종 유충에서 AcSBV 음성 가닥 RNA가 검출 될 수 있다 (그림 4B 및 D), 이는 AcSBV의

게놈이 서양종 유충에서 복제할 수 있음을 시사한다.

However, additional studies must be performed to determine whether a large dose induces clinical disease.

In agreement with previous results (8–10), SBV affects adult bees without obvious signs of the disease, although

the virus titers increased significantly. The titers of AcSBV in A. mellifera and A. cerana adult workers inoculated

under laboratory conditions had similar growth trends, increasing significantly in the first 6 days after inoculation

and reaching a plateau (Fig. 3A and B).

그러나, 다량의 투여가 임상 질환을 유발하는지 여부를 확인하기 위해 추가 연구는 수행되야 한다. 이전 결과 (8-10

)와 일치하여, SBV는 바이러스 역가가 크게 증가했지만, 질병의 명백한 징후없이 성봉에게 영향을 준다.

실험실 상황에서 접종한 서양종 및 동양종 성봉 일벌의 AcSBV 역가는 유사한 성장 경향을 보였으며, 접종 후 처음

6일 동안 크게 증가하여 정체기에 도달했다 (그림 3A 및 B).

Although the increases in AcSBV titers in A. mellifera were less than those in A. cerana during the first 6 days after inoculation, the increases in AcSBV titers in A. mellifera within 10 days were more substantial. We suspect that,

when infecting A. mellifera, AcSBV may take time to adjust to the new host during the initial infection phase and

then replicates efficiently by an unknown mechanism.

서양종의 AcSBV 역가의 증가는 접종 후 처음 6일 동안 동양종 보다 적었지만, 10일 이내에 서양종에서 AcSBV 역가의

증가는 더 상당했다.  우리는 서양종 꿀벌을 감염시킬 때, AcSBV가 초기 감염 단계에서 새로운 숙주에 적응하는데

시간이 걸릴 수 있으며 알려지지 않은 메커니즘에 의해 효율적으로 복제된다고 생각한다. 

This result indicates that AcSBV successfully replicated in A. mellifera adult workers. In addition, the AcSBV

negative-strand RNA could be detected in A. mellifera adult workers inoculated in the laboratory (Fig. 4A) and

under field conditions (Fig. 4C). As with the larvae, compared with the samples prepared under laboratory

conditions, the nucleic acid bands (Fig. 4C and D) of samples inoculated under field conditions were much

weaker.

이 결과는 서양종 성봉 일벌에서 AcSBV가 성공적으로 복제되었음을 나타냅니다.  또한 AcSBV 음성 가닥 RNA는

실험실 (그림 4A)과 현장 상황 (그림 4C)에서 접종된 서양종 성봉 일벌에서 검출될 수 있다.

유충과 마찬가지로, 실험실 조건에서 준비된 샘플에 비교하여, 현장 조건에서 접종된 샘플의 핵산 띠(그림 4C 및 D)

가 훨씬 약했다.

This may be due to the different amounts of virus inoculated into the bees and/or different levels of resistance

of the bees to the virus under different conditions.  Nevertheless, these results suggest that AcSBV is able to

replicate in A. mellifera adult worker bees.

이는 다른 조건 아래서 꿀벌에 접종된 바이러스의 양이 다르거나, 바이러스에 대한 꿀벌의 저항 수준이 다르기

때문일 수 있다.  그럼에도 불구하고, 이러한 결과는 AcSBV가 서양종 성봉 일벌에서 복제할 수 있음을 시사한다.

Therefore, by quantifying the titers of AcSBV in A. mellifera adult worker bees and detecting AcSBV

negative-strand RNA in adult worker bees and larvae in artificial inoculation experiments, we concluded that

AcSBV is able to infect A. mellifera, which is different from previous reports.

따라서, 서양종 성봉 일벌에서 AcSBV의 역가를 정량화하고, 인공 접종 실험에서 성봉 일벌과 유충에서 AcSBV

음성 가닥 RNA를 검출하여, AcSBV가 이전의 보고와 다른, 서양종 꿀벌을 감염시킬 수 있다는 결론을 내렸습니다. .

This is of significance not only for the study of the pathogenicity of SBV but also for the protection of A. mellifera

and A. cerana.  In agreement with a previous investigation performed in China by Ai et al. (35), the infection rate

of A. cerana colonies was much higher than that of A. mellifera colonies.

이것은 SBV의 병원성 연구뿐만 아니라, 서양종 및 동양종 꿀벌의 보호에도 중요하다.  Ai 외 의해서 중국에서 수행한

이전 조사와도 일치한다. (35), 동양종 봉군의 감염률은 서양종 봉군 보다 훨씬 더 높았다.

With the finding that AcSBV can infect A. mellifera colonies, as shown in this study, A. cerana colonies serve as

a large reservoir of SBV infection for A. mellifera colonies.  Although the AcSBV infection rate in A. mellifera

colonies was very low and symptoms were not seen, this effect should not be neglected and efforts should

still be made to monitor the dynamic changes of AcSBV in A. mellifera colonies.

AcSBV가 서양종 봉군을 감염시킬 수 있다는 발견으로, 이 연구에서 보여준 바와 같이, 동양종 봉군은 서양종

봉군에 대한 낭충병 바이러스 감염의 큰 저장소 역할을 한다.  서양종 봉군에서 AcSBV 감염률이 매우 낮고 증상이

보이지 않았지만, 이 효과를 무시해서는 안되며 서양종 봉군에서 AcSBV의 동적 변화를 관찰하기 위한 노력이

여전히 이루어져야 한다

Due to beekeeping practices, the numbers of A. mellifera colonies are much larger than those of A. cerana

colonies in most beekeeping areas in Asia. Therefore, although the AcSBV infection rate in A. mellifera colonies

is very low (0.63% in this study), the fact that A. mellifera colonies serve as a reservoir for SBV infection for

A. cerana colonies should not be neglected, especially when the two honeybee species are located in close

proximity.

양봉 관행으로 인해, 서양종 봉군의 수는 아시아 대부분의 양봉 지역에서 동양종의 수 보다 훨씬 많다.

따라서, 서양종 봉군의 AcSBV 감염률은 매우 낮지만 (본 연구에서는 0.63 %), 서양종 봉군이 동양종 봉군에 대한

낭충병 바이러스 감염의 저장소 역할을 한다는 사실을 간과해서는 안된다.  특히, 두 종의 꿀벌이 바로 가까이에

위치하고 있을 때.

Although quantification at the nucleic acid level with the qRT-PCR approach is one of the most common

methods used for the quantification of virus, it should be noted that the stringency of this technique may

be doubted, since nucleic acids are not necessarily part of an infectious particle (50).

Our data on SBV detection in field colonies, virus RNA genome quantification, and negative-strand RNA

detection have strongly supported our conclusion, while it remains unclear whether new proteins were

produced and new virus particles were assembled.

qRT-PCR 접근법을 사용하여 핵산 수준에서 정량화하는 것이 바이러스 정량화에 사용되는 가장 일반적인 방법 중

하나이지만, 핵산이 반드시 감염시키는 미립자의 일부가 아니기 때문에, 이 기술의 엄격함이 의심 받을 수 있다는

것을 유의해야 한다.  현장 봉군에서 SBV 검출, 바이러스 RNA 게놈 정량화 및 음성 가닥 RNA 검출에 대한 우리의

데이터는 우리의 결론을 강력하게 뒷받침하는 반면에, 새로운 단백질이 생성되고 새로운 바이러스 입자가

조립되었는지 여부는 분명하지 않다.

It would be worthwhile to quantify virus proteins or particles to determine whether new proteins are produced

or new particles are assembled.  In addition, because A. mellifera colonies very commonly are infected by

a variety of bee viruses and rarely are infected by only SBV, purified AmSBV was not obtained for cross-species

inoculation in our study. The ability of AmSBV to infect A. cerana should be studied in the future whenever

possible.

바이러스 단백질이나 입자를 정량화하여 새로운 단백질이 생성되는지, 새로운 입자가 조립되는지를 결정하는 것은

가치 있는 일일 것이다.  또한, 서양종 봉군은 매우 흔하게 다양한 꿀벌 바이러스에 감염이 되고 SBV에만 감염

되는 경우는 드물기 때문에, 우리의 연구에서는 종 간 접종을 위한 정제된 AmSBV를 획득하지 못했다.  동양종을

감염시키는 AmSBV(서양종 낭충병 바이러스의 아종)능력은 가능한 미래에 연구되어야 한다.

acknowledgment

감사의 인사

Thanks to the three anonymous reviewers who provided constructive comments in improving the manuscript.

원고를 향상시키는데 건설적인 의견을 보내 주신 익명의 검토자 3분에게 감사 드린다.

FOOTNOTES

주석

• Copyright © 2016, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
• 저작권 © 2016, 미국 미생물 학회. 판권 소유

REFERENCES

참조

너무 많아 생략

[오병현_전주]

미 미생물학회의 전문적인 내용을 올려주셨네요
내용이 좀 어렵긴한데 잘 보았습니다 ^^

[중단없는]

[삼방(평창)]

좋은 글 고맙습니다 ^~^

[비봉]

낭충봉아부패병은 농림축산검역본부와 가축전염병예방법에서 사용하는 공식 명칭입니다.
낭충병이라는 명칭은 sacbrood가 아닌 다른 질병에 붙여진 이름이며 낭충봉아부패병을 낭충병이라고 부르는 이들이 있는데 이를 들은 양봉인은 낭충봉아부패병으로 이해합니다.
낭충병에 감염된 성봉은 거의 제수명대로 삽니다. 그렇지 않다고 반박하면서 증거라며 올리신 자료에도 그렇게 나와 있습니다.
한봉 봉군이 낭충봉아부패병으로 망하는 과정은 거의 대부분의 유충이 죽어버리므로 대가 끊겨서 망하는 것이지 성봉이 단명해서가 아닙니다.
한봉에서 화분떡 미급여가 원인이 아닌 것은 화분떡을 주어봤으나 소용 없었으며, 올리신 자료들에 나와 있듯이 꿀벌의 종에 따라 감수성과 치명률이 다르며, 한봉이 한국형 낭충봉아부패병에 취약하다는 것입니다.

[꿀벌나라]

원문에 sbv에 감염된 39군의 서양종 약군 봉군과 26군의 동양종 봉군을 대상으로 실험한 내용을 보면, 벌통이나 벌통 근방에 죽은 성봉이 상당수가 많이 발견되었다고 나와 있습니다. 찬찬히 읽어 보세요,

[비봉]

벌통 주변에 죽은 성봉이 많이 발견된 봉군에서 샘플을 채취했다는 본문의 내용은, 수집 당시 어떤 질병인지 확실치는 않지만 질병으로 의심되는 증상을 보이는 봉군들에서 샘플을 채취했다는 뜻일 뿐 성봉이 죽은 원인이 낭충봉아부패병이라는 의미가 아닙니다. 성봉에게 낭충봉아부패병 바이러스를 주입해본 결과 생존에 영향을 미치지 않음이 밝혀졌다는 내용이 본문의 아래쪽에 나와 있습니다.

[꿀벌나라]

이자료는 내가 참고하는 자료인데 소개할려고 한 것이 아니고, 비봉님 덧글에 답변을 하고자 참고로 첨부한 내용입니다. 소개안 한 이유는양봉에서 SBV(낭충병)는 큰 질병이 아니기 때문입니다. 보고 요약해 드릴게요.

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