유기산이 꿀벌응애 부착능력에 미치는 영향

[우성(旴成) 평택]

그립력 상실: 타르타르산, 젖산, 포름산 및 구연산을 사용한 Varroa 파괴자 숙주 부착에 도전
~에 의해 캐롤라인 빌라렘1,2ORCID,빈센트 피우1,솔렌 블랜차드1,파니 포겔웨이스2그리고안젤리크 베티야르1,3,*
1
Laboratoire Evolution et Diversité Biologique, UMR5174, CNRS-Université de Toulouse III-IRD, Université Paul Sabatier, 31077 툴루즈, 프랑스
2
M2i Biocontrol, Entreprise SAS, 46140 Parnac, 프랑스
삼
Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM), Unité Métabiot, 22440 Ploufragan, 프랑스
*
서신을 보내야 할 저자.
신청 과학. 2023 , 13 (16), 9085; https://doi.org/10.3390/app13169085
접수일: 2023년 7월 6일 / 개정일: 2023년 7월 28일 / 승인: 2023년 8월 7일 / 게시일: 2023년 8월 9일
(이 기사는 특별호 양봉: 도전과 기회 에 속합니다 )

초록

양봉가들은 Apis mellifera 의 기생 진드기인 Varroa destructor 에 대해 다양한 치료법을 사용할 수 있습니다 . 그러나 기생충에만 접근하는 복잡성을 고려할 때 지속 가능하고 사용하기 쉬운 솔루션은 여전히 ​​부족합니다. 현재 치료법에는 연성 살비제가 포함되어 있지만 그 작용 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리는 실험실 조건에서 타르타르산, 젖산, 포름산, 구연산과 같은 유기산이 V. destructor 의 부착 능력에 미치는 영향을 조사했습니다. 기생충이 숙주를 붙잡거나 붙잡는 것을 방지하는 것은 진드기 방제 전략의 중요한 목표입니다. 진드기 유향에 산을 직접 적용한 후 Rotavar 설정을 통해 그립 기술에 도전했습니다. 우리는 또한 꿀벌 치료 후 꿀벌에서 진드기가 떨어질 가능성을 테스트했습니다. 우리는 타르타르산, 구연산 및 젖산이 치료 후 24시간 동안 V. destructor 의 부착을 손상시키는 좋은 후보라는 것을 발견했습니다. 그러나 젖산은 꿀벌 치료 후 진드기의 수명을 줄이지 않고 진드기를 불안정하게 만드는 합리적인 농도의 유일한 후보로 남아 있습니다. 인공적인 조건에서 이러한 실험을 수행하는 동안 우리의 결과는 V. 소멸자 에 대한 유기산의 잠재적 영향에 대한 이해를 향상시켰습니다 . 또한 전 세계 양봉가를 위한 벌통 적용을 위한 새로운 방법 개발에 도움을 줄 수 있습니다.
키워드:유기산 ; 바로 아 진드기 ; 아피스 멜리페라(Apis mellifera) ; 그립 스킬 ; 해충 관리

1. 소개

Varroa 소멸자는 유럽에서 Apis mellifera 에 대한 주요 위협 중 하나입니다 [ 1 ]. 이 체외기생충은 DWV(Deformed Wing Virus)와 같은 바이러스를 전파하고 복제합니다[ 2 , 3 , 4 ]. 척추증 중 이 만성 바이러스는 날개 기형을 유발하는데, 이는 군체 약화의 주요 요인 중 하나입니다 [ 1 , 5 , 6 ]. Varroa 소멸자 암컷은 꿀벌의 혈림프와 지방체를 먹습니다 [ 7 , 8 ]. 그들은 분산 단계라고 불리는 동안 성체 꿀벌을 먹이와 운반자로 사용합니다 [ 9 ]. V. destructor를 방제하기 위해 피레트로이드, 포름아미딘, 유기인산염, 네오니코티노이드 또는 술폭시민과 같은 단단한 살비제(합성 분자[ 9 , 10 ])부터 옥살산 또는 포름산과 같은 유기산(천연 분자)에 이르기 까지 여러 가지 방법이 적용되었습니다 . 이전 치료법은 꿀벌의 건강에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 진드기에 대한 저항성을 생성할 수 있습니다[ 11 , 12 ]. 자연 기원의 후자는 주요 대안으로 간주되며 단점이 적은 V. destructor 에 대한 효율적인 치료법이 될 수 있습니다 [ 13 , 14 , 15 ]. 포름산, 구연산, 젖산, 타르타르산과 같은 유기산은 꿀벌에 외계 분자가 추가되는 것을 방지하면서 꿀에 자연적으로 존재하기 때문에 특히 관심을 끌고 있습니다[ 16 , 17 ] . 포름산과 옥살산은 V. destructor 에 대한 대체 치료법으로 자주 사용됩니다 [ 17 ]. 그러나 젖산, 구연산 또는 타르타르산에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 개미산은 벌통 내부의 분산성 및 생식 진드기에 도달하는 휘발성 분자인 반면, 옥살산은 분산성 진드기만을 물리칩니다[ 18 , 19 , 20 ]. 옥살산의 구체적인 작용 방식은 아직 불분명합니다. 진드기 유륜에 결정을 생성하여 기계적으로 사망에 이르게 하는 것으로 의심되지만 [ 21 , 22 ]. 비슷한 맥락에서, 현재의 유기 치료법을 연구하고 더 잘 적용하기 위한 새로운 관점은 진드기의 무립종을 노출시켜 진드기의 숙주 부착 능력에 도전하는 것입니다[ 23 ] . 실제로, 애착은 기생충과 숙주 사이의 상호작용에서 필수적인 부분입니다. Ixodes ricinus 와 같은 진드기의 부착 능력에 대한 연구는 진드기 제어 전략의 새로운 생물학적 목표, 즉 쥐는 것을 방지하는 것을 보여주었습니다. [ 23 ,24 , 25 ]. V. destructor 의 경우 , 기피제 또는 매력적인 분자를 사용한 화학적 배향이 잠재적인 제어 전략으로 고도로 탐구되었습니다. 그러나 애착 능력에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다[ 26 , 27 , 28 ]. Arolia는 대부분의 기생충의 앞다리 끝 부분에서 발견되는 부드러운 패드이며 일부의 경우 특히 진드기와 진드기의 경우 숙주를 걷고 붙잡는 데 필요한 접착성 디스크형 구조로 특징지어집니다[ 29 ] . 진드기에서는 친수성 및 소수성 상을 갖는 이상성 유체가 유륜 아래의 끈적거림을 매개합니다[ 5 ]. 그러나 Varroa 진드기의 생물학이 아직 완전히 이해되지 않았기 때문에 Varroa 진드기 에 그러한 액체의 존재는 알려지지 않았습니다 [ 10 , 30 ].
본 연구에서는 포름산, 구연산, 타르타르산 및 젖산과 같은 유기산이 V. destructor 의 숙주 부착 능력을 방해할 수 있는지 처음으로 조사합니다 . 우리는 포름산이나 젖산과 같은 현장 유기산의 현재 농도를 선택했지만[ 31 , 32 ] 비교하기 위해 구연산 및 타르타르산과 같이 사용률이 낮은 후보도 선택했습니다[ 33 ]. 그립 능력을 테스트하기 위해 우리는 V. destructor 암컷의 유륜을 직접 치료하고 Rotavar라는 목재 회전 기판이 있는 집에서 만든 기계를 사용했습니다. 또한, 꿀벌에 유기산을 처리하고 떨어진 응애의 수를 확인하여 숙주 부착을 조사하였다( 도 1 ).

그림 1. 실험 설계 및 측정된 매개변수의 개략도. 나무 그립(Rotavar): 이 방법은 바로 아 아롤리 아와 유기산 사이의 직접적인 접촉에 의존합니다. Rotavar 설정은 V. destructor 의 그립을 평가하는 데 사용되는 모터 구동 회전 이쑤시개입니다. 꿀벌 잡기: 숙주 부착 실험에서는 진드기를 제거하기 위해 꿀벌의 등에 산을 적용합니다. T0는 치료 투여 시간을 나타내고; T + 1시간 30시간, 24시간, 48시간 또는 72시간은 투여 후 측정에 사용되는 시간을 나타냅니다.

2. 재료 및 방법

실험은 2022년과 2023년 초 봄, 여름, 가을에 프랑스 ADA Occitanie에서 제공한 Buckfast 식민지 3곳의 꿀벌과 진드기를 사용하여 수행되었습니다. 식민지는 대학 캠퍼스(프랑스 알비 소재 INU Champollion)에서 유지되었습니다. 계란 생산을 늘리기 위해 2월에 설탕 시럽과 꽃가루를 먹였습니다. 전년도에 옥살산으로 한 달 동안만 처리했기 때문에 V. 파괴자 감염은 그 기간 내내 높게 유지되었습니다. 실험 동안이나 이전 6개월 동안 어떠한 처리도 적용되지 않았습니다.
2.1. 진드기와 꿀벌 샘플링
Varroa 소멸자 암컷은 부드러운 붓을 사용하여 성체 꿀벌[ 34 ](분산 단계), L5 유충 또는 신흥 꿀벌(균질화된 체형을 가진 바로아)로부터 수집되어 아침에 실험실로 가져갔습니다. 국가 편견을 피하기 위해 무작위로 선정되었습니다. 실험 시작 전에 인큐베이터에서 무제한(34.5°C, 70% 상대 습도(RH))을 공급하기 위해 번데기에 최대 2시간 동안 보관했습니다.
일벌은 아침에 먹이틀에서 수집하여 실험을 위해 보관했습니다. 실험 시작 전 인큐베이터(28°C, 60% RH)의 실험 케이지(통증 유형: 10.5cm × 7.5cm × 11.5cm)에 최대 2시간 동안 보관했습니다. 이들에게 50%( w/v ) 의 자당을 공급하는 중력 공급 장치를 사용하여 자유롭게 공급했습니다 .
2.2. 산 준비 및 제어
산은 프랑스 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 모든 솔루션은 M2I Development(프랑스 Lacq)에서 준비했습니다. 젖산 희석액(99%)(CAS 번호 50-21-5), 구연산 무수물(Omnipur - 99% 순도)(CAS 번호 77-92-9), 포름산(액체 50-80%)( CAS 번호 64-18-6) 및 타르타르산(D-타르타르산, 99%)(CAS 번호 147-71-7)을 탈염수(Ciron, France)로 제조하고 아래 표시된 대로 샘플링했습니다(표 1 참조 ) . . 대조군을 처리하기 위해 용매인 탈염수를 사용했습니다. 모든 스톡 솔루션은 4 °C에서 보관되었습니다.

표 1. 실험 유형에 따른 산 농도 및 샘플 크기.

2.3. 목재 그립(Rotavar)
산 투여 - 산 농도와 실험 샘플 크기는 표 1 에 설명되어 있습니다 . 우리는 Varromed ® (개미산 5mg/mL) 와 같이 현재 시중에 판매되는 치료법에 따라 다양한 범위의 개미산 농도를 선택했습니다 . 구연산의 최고 농도는 가용화 한계로 인해 600이 아닌 580mg/mL입니다.
처리 절차를 위해 200μL의 희석된 산 또는 탈염수(대조군)를 직경 5cm의 종이 조각( Scott® Slimroll, Roswell, GA, USA) 으로 덮인 페트리 접시(직경 5cm)에 첨가했습니다. 진드기는 젖은 함침지 위에서 3분 동안 자유롭게 걸을 수 있었습니다. 그 후, 각각 늦은 꿀벌 번데기를 젤라틴 캡슐(LGA, La Seyne sur Mer, France)에 옮겨서 먹이로 삼고 Piou가 개발한 방법에 따라 인큐베이터에서 34.5℃(70% RH)로 유지하였다. 외. (2016) [ 35 ].
설정 - 적응된 설정인 Rotavar[ 36 ]를 사용하여 나무에 대한 V. destructor 의 그립 기술을 평가했습니다 ( 그림 1 ). 간단히 말해서, Rotavar는 설치류를 위한 Rotarod에서 영감을 받았습니다[ 37 ]. Rotavar 기계는 모터 구동식 회전 이쑤시개(길이 6cm, 직경 2mm)로 구성되었습니다. 이를 통해 진드기의 헤드업 및 헤드다운 시간과 전환(우리의 경우 3RPM(분당 회전수))을 표준화할 수 있었습니다. 실제로 진드기는 자연스럽게 360° 걸을 수 있는 능력을 갖추고 있었습니다. 이쑤시개가 회전함에 따라 V. destructor는 떨어지지 않도록 붙어 있어야했습니다. 따라서 그립력에 영향을 미치는 결함이 있는 진드기는 실험 중에 떨어질 것으로 예상되었습니다. 처리 후 1시간 30분 동안 진드기가 떨어질 때까지 또는 테스트가 끝날 때까지(3분) 각 진드기를 회전하는 이쑤시개(양쪽에서 3cm) 위에 올려 놓았습니다. 넘어지기 전의 시간이 기록되었습니다. 이 첫 번째 테스트 후, V. 파괴자 암컷을 각각의 젤라틴 캡슐에 다시 넣고 인큐베이터(34.5°C 70% RH)에 보관했습니다. 실험에서 죽은 진드기가 회수되었습니다. Rotavar 실험은 "장기적인" 악력 부족을 평가하기 위해 치료 후 24시간 동안 반복되었습니다. 사망률을 확인하기 위해 치료 후 48시간까지 진드기를 인큐베이터에 보관했습니다. 살아있는 것들은 얼었다.
2.4. 숙주 실험(꿀벌) 잡기
산 투여 - 실험 2일 전에 진드기를 새끼 세포에 수집하고 성체 꿀벌에 넣어 실험실 조건에서 분산 단계를 시뮬레이션하고 표준화했습니다[ 35 ]. 숙주와 진드기는 28°C 및 60-65% RH에서 실험 케이지(통증 유형: 10.5 cm × 7.5 cm × 11.5 cm)에 보관되었습니다. 한두 마리의 진드기를 운반하는 각 벌은 Gashout et al.이 개발한 절차에 따라 등에서 흉부에서 복부까지(5 마이크로 방울) 희석된 산 또는 탈염수(대조군)를 5 µL씩 받았습니다. (2009) [ 38 ]. 꿀벌을 5분 동안 유지하여 용액이 건조되고 등에 달라붙도록 했습니다. 산의 농도와 실험 샘플 크기는 표 1 에 설명된 대로 사용되었습니다 .
설정 - 일단 산이 꿀벌에 투여되면, 처리된 5명의 개체의 마이크로 콜로니를 Whatman 종이로 덮은 페트리 접시(직경 90mm) 위의 천공된 플라스틱 유리(직경 7cm, 높이 9.5cm)에 넣었습니다[ 39 , 40 ] . 꿀벌에게 자당을 50%( w / v ) 자유롭게 공급했습니다. 떨어진 응애(죽거나 살아있을 수 있지만 더 이상 꿀벌을 잡을 수 없는)의 수와 벌의 사망률을 확인하고 72시간 동안 24시간마다 제거했습니다(그림 1 ) . 각 실험이 끝날 때 진드기 탈출로 인한 실수를 방지하기 위해 아직 꿀벌에 남아 있는 바로아 암컷의 수 를 세었습니다.
2.5. 통계 분석
데이터의 통계 분석은 RVAideMemoire, Car, GGplot2, Survival 및 Survminer 패키지가 로드된 RStudio(버전 1.3.1093)를 사용하여 R(버전 4.0.5)에서 표준 방법을 사용하여 수행되었습니다[41 , 42 , 43 ] . 그립 분석 결과는 95% 신뢰 구간에서 백분율로 표시되었습니다[CI95]. 떨어진 진드기의 비율은 비율이 1과 다를 때 처리된 이항 GLM(일반화 선형 모델)을 사용하여 비교되었습니다. 이어서 대조군과의 쌍별 비교를 추가로 분석하기 위해 Bonferroni 보정을 사용한 이진 변수에 대한 Fisher 정확 검정이 이어졌습니다. 그룹. 이항 GLM이 불가능한 경우에는 Fisher 정확 검정을 직접 수행했습니다. 넘어지기 전 그립 기술의 평균 시간에 대해 Shapiro 테스트를 사용하여 데이터 정규성을 확인했습니다. 따라서 Kruskal-Wallis 테스트와 Bonferroni 보정이 포함된 Dunn 테스트가 필요할 때 사용되었습니다. 생존확률은 진드기의 경우 Kaplan-Meier 방법을 통해 2일, 꿀벌의 경우 3일에 걸쳐 분석하였다.
3. 결과

3.1. 나무에 대한 V. destructor 그립 스킬에 대한 유기산의 영향
대조군 - 대조군의 진드기를 탈염수로 처리했습니다. V. destructor는 자연스럽게 잡고 360° 회전할 수 있으므로 Rotavar에서 떨어진 진드기는 없을 것으로 예상됩니다. 그러나 처리 후 1시간 30분 후에 대조 진드기의 1.11%[CI95: 4.84-12.73]가 떨어졌습니다(검은색 점선으로 표시, CI95는 점선 주변의 회색 영역으로 표시)(그림 2 ) . ). 처리 후 24시간 동안 대조 진드기의 1.19%[CI95: 6.72-21.91]가 떨어졌습니다. 그립 기간의 경우 제어 그룹은 상자 그림에서 "0"으로 표시됩니다. 각 대조군의 평균 시간은 180초(실험의 최대값)입니다. 이는 대부분의 대조군 진드기가 떨어지지 않았기 때문입니다( 그림 3 ).

그림 2. 처리 후 1시간 30분 및 24시간 후 Rotavar 테스트를 통해 구연산, 개미산, 젖산 및 타르타르산 농도가 V. 소멸자 암컷의 그립 기술에 미치는 영향. 점선은 대조군을 나타냅니다. 점선 주변의 회색 영역은 95%의 신뢰 구간을 나타냅니다. 색상 막대는 95%의 신뢰 구간을 나타냅니다. ***는 대조군과 비교하여 p <0.001, **는 p <0.01, *는 p <0.05를 나타냅니다(자세한 통계는 표 2 참조 ).

그림 3. 구연산, 포름산, 젖산 또는 타르타르산 농도에 노출된 후 Rotavar에서 진드기의 그립 시간(초), 1시간 30시간 및 24시간. "0"은 각 산 실험의 대조군을 나타냅니다. ***는 대조군과 비교하여 p <0.001, **는 p <0.01, *는 p <0.05를 나타냅니다(자세한 통계는 표 2 참조 ). 표 2. Rotavar 그립 기술 실험에 대한 떨어진 진드기 백분율 및 중간 그립 지속 시간에 대한 통계 분석 결과 - (A) Bonferroni 보정과 함께 Fisher의 정확 테스트를 사용하여 조정된 p 값을 사용한 통계 분석. (B) Bonferroni 보정을 사용한 Dunn 테스트를 사용하여 조정된 p 값을 사용한 통계 분석(대 = 대, Ctrl = 대조).

구연산 - 580mg/mL의 구연산에 노출된 Varroa 소멸자 암컷은 처리 후 1시간 30분 후에 대조군의 진드기보다 훨씬 더 많이 떨어졌습니다(그림 2, 이항 GLM p 값 = 0.0023, 표 A1 및 표 2 참조). Fisher 테스트용). 처리 후 24시간이 지나면 농도에 관계없이 Rotavar에서 더 많이 감소했습니다( 그림 2 , 모두 <0.05에 대한 이항 GLM p 값, 표 A1 및 표 2 참조 ). 그러나 대조군과 구연산 투여군 사이에는 95% 신뢰구간이 겹치는 부분이 있다. 악력 지속 시간(치료 후 1시간 30분)의 경우 평균 지속 시간은 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 처리 후 24시간이 지난 후에도 구연산으로 처리한 진드기의 악착 지속 시간과 대조 진드기의 그립 지속 시간 사이에는 차이가 발견되지 않았습니다( 그림 3 )

개미산 - 25mg/mL의 개미산 노출 후 1시간 30분 후에 진드기는 대조군보다 훨씬 더 많이 감소했습니다( 그림 2 , Fisher 정확한 테스트, p 값 = 0.0047, 표 2 참조 ). 개미산 처리 후 24시간 후에는 테스트 농도에 관계없이 대조군보다 유의하게 더 많이 떨어졌습니다( 그림 2 , 모두에 대한 이항 GLM p 값 < 0.01, 표 A1 및 표 2 참조 ). 악력 지속 시간(치료 후 1시간 30분)의 경우 평균 지속 시간은 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 그러나 V. 파괴자 암컷이 5 또는 25 mg/mL의 포름산에 노출되었지만 1 mg/mL에는 노출되지 않은 경우 중앙 지속 시간은 24시간에서 상당히 짧습니다 ( 그림 3 , Kruskal-Wallis χ 2 = 38.353, df). = 3, p 값 < 0.001, 표 2 참조 ).
젖산 - 젖산의 경우, 사용된 농도에 관계없이 진드기는 처리 후 1시간 30분 후에 대조군보다 훨씬 더 많이 감소했습니다(그림 2, 모두 에 대한 Bonferroni 보정 p 값 < 0.001, 표 2 참조 ). 젖산(150mg/mL) 처리 후 24시간 동안 V. destructor 의 90%[CI95: 73.4–97.8] 가 Rotavar에서 떨어졌고 600mg/mL에서는 93.3%[CI95: 77.9–99.1]가 떨어졌습니다( 그림 2 , 이항 GLM, 150mg/mL < 0.0001에 대한 p 값, 표 A1 및 표 2 참조 ). 처리 후 1시간 30분 동안 진드기를 젖산(150 mg/mL)으로 처리한 경우 대조군에 비해 쥐는 시간이 현저히 낮았습니다(그림 3, Kruskal -Wallis χ 2 = 45.404, df = 3, p - 값 < 0.001, 표 2 참조 ). 노출 후 24시간 동안 젖산으로 처리한 진드기는 대조군의 180초에 비해 150mg/mL에서 46초의 더 짧은 중앙값 지속 시간을 나타냈습니다. 이는 또한 25 또는 600mg/mL의 젖산으로 처리된 진드기의 경우였습니다( 그림 3 , Kruskal-Wallis χ 2 = 64.744, df = 3, p 값 < 0.001, 표 2 참조 ).
타르타르산 - 150mg/mL의 타르타르산에 노출된 Varroa 소멸자 암컷은 처리 후 1시간 30분 후에 대조군의 진드기보다 훨씬 더 많이 떨어졌습니다( 그림 2 , Fisher 정확한 테스트 p 값 = 0.04, 표 2 참조 ). 치료 후 24시간 동안 Rotavar에서 V. destructor 의 75.8%[CI95: 56.4–89.7] 가 150mg/mL에서 떨어졌고 70.3%[CI95: 49.8–86.2]가 600mg/mL에서 떨어졌습니다( 그림 2 , 이항 150 mg/mL < 0.0001에 대한 GLM p 값, 표 A1 및 표 2 참조 ). 악력 지속 시간(치료 후 1시간 30분)의 경우 평균 지속 시간은 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 마지막으로, V. destructor 암컷이 치료 후 24시간 동안 150 또는 600mg/mL의 타르타르산에 노출되었을 때 평균 기간이 상당히 짧아졌습니다 ( 그림 3 , Kruskal-Wallis χ 2 = 37.782, df = 4, p - 값 < 0.001, 표 2 참조 ). 그러나 25mg/mL의 타르타르산을 처리한 진드기의 악력 지속 시간에는 차이가 발견되지 않았습니다.
생존 - 최고 농도의 젖산은 24시간 후 사망률을 유발했습니다( 그림 4 , Kaplan-Meier: p -값 600mg/mL < 0.0001 및 p -값 150mg/mL = 0.0006). 150 및 600 mg/mL의 타르타르산도 진드기를 죽였습니다( 그림 4 , Kaplan-Meier: p -값 150 mg/mL = 0.002 및 p -값 600 mg/mL < 0.0001). 포름산, 단 25mg/mL만이 48시간에 진드기의 사망을 유발했습니다( 그림 4 , Kaplan-Meier: p 값 < 0.0001). 구연산은 농도에 관계없이 48시간 동안 유의미한 사망이 없는 유일한 물질이었습니다( 그림 4 , Kaplan-Meier: 전체에 대한 p 값 > 0.05).

그림 4. 유기산 처리(함침된 종이 위를 걷는) 후 V. 소멸자 의 48시간 이상 생존 곡선 .

3.2. 꿀벌의 V. 소멸자 낙하에 대한 유기산의 영향
진드기를 운반하는 꿀벌은 등 부위에 국소 치료를 받았고 5마리의 꿀벌이 모여 있는 미세 군집에 모였습니다. 노출 후 72시간 동안 대조군에서 떨어진 진드기 비율은 4.74%[CI95: 0.58~18.30]였으며, 이는 진드기가 숙주에서 자연적으로 떨어지지 않기 때문에 예상된 수치였습니다. CI95의 경우 점선과 회색 영역으로 표시되었습니다( 그림 5 ).

그림 5. 구연산, 개미산, 젖산 및 타르타르산 농도가 처리 후 72시간 동안 누적된 꿀벌의 V. 파괴자 암컷 제거에 미치는 영향. 점선은 대조군을 나타냅니다. 점선 주변의 회색 영역은 95%의 신뢰 구간을 나타냅니다. 색상 막대는 95%의 신뢰 구간을 나타냅니다. ***는 p <0.001을 나타내고 , *는 대조군과 비교하여 p <0.05를 나타냅니다(자세한 통계는 표 3 참조 ).

표 3. 처리 후 72시간에 걸쳐 누적된 꿀벌의 떨어진 응애 비율에 대한 통계 분석 결과 - Bonferroni 보정과 함께 Fisher 정확 검정을 사용하여 조정된 p 값을 사용한 통계 분석(대 = 대).

벌에서 떨어진 응애의 비율은 구연산 580mg/mL의 경우 대조군 63.3%보다 상당히 높았습니다[CI95: 43.8-80]( 그림 5, 이항 GLM p - 값 = 0.0003, 표 A2 및 표 참조) 삼 ). 25mg/mL의 구연산을 사용할 때는 주의해야 합니다. 실제로 대조군에 비해 상당히 높은 수치를 보였습니다. 그러나 그들의 CI95는 겹쳤습니다. 대조군에서는 구연산이나 포름산과 타르타르산의 농도가 25~150mg/mL 사이에서 차이가 발견되지 않았습니다. 벌에서 떨어진 진드기의 비율은 72시간 동안 젖산 150mg/mL의 경우 53.3%[CI95: 34.3~71.6], 600mg/mL의 경우 90%[CI95: 73.4~97.8]로 상당히 높았습니다. 치료 후( 그림 5 , 150mg/mL에 대한 이항 GLM p - 값 = 0.0005, 표 A2 및 표 3 참조 ).
젖산을 투여한 첫 24시간 동안 진드기가 가장 많이 떨어졌습니다. 가장 높은 농도의 젖산은 꿀벌에게 독성이 있어 48시간 후에 높은 사망률을 유도했으며( 그림 6 , Kaplan-Meier: p -값 = 0.022), 타르타르산 600mg/mL(Kaplan-Meier: p - 값 = 0.022 ) 값 = 0.036) 및 구연산 25mg/mL(Kaplan-Meier: p -값 < 0.0001). 따라서 600mg/mL의 젖산 및 타르타르산과 25mg/mL의 구연산을 제외하고 테스트된 농도 중 어느 것도 꿀벌에 독성이 있는 것으로 간주되지 않았습니다.

그림 6. 유기산 처리(벌의 등에 떨어뜨림) 후 꿀벌의 72시간 이상 생존 곡선.

4. 토론

이 연구는 구연산, 포름산, 젖산 및 타르타르산이 V. 파괴자 숙주 부착 능력에 미치는 영향을 비교하려는 첫 번째 시도입니다. 개미산과 젖산의 살충제 영향은 이전 현장 연구에서 입증되었습니다[ 15 , 31 , 44 ]. 그러나 준수 능력에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 우리는 진드기의 아롤리아가 다양한 유기산에 직접 노출되었을 때 진드기의 그립 능력을 조사했습니다.
우리는 현장의 일반적인 응용 분야에 따라 산의 농도를 선택했습니다. 실제로 포름산은 살수를 위해 Varromed®와 같은 상용 제품에서 5 mg/mL로 사용됩니다 [ 32 ] . 스위스에서는 150mg/mL의 젖산을 분무하여 집락을 처리합니다[ 31 , 45 ]. 치료 후 24시간 동안 우리는 구연산, 개미산, 젖산 및 타르타르산이 진드기의 부착 능력을 손상시키는 것을 관찰했습니다. 화학적 관점에서 우리는 각 산의 특정 특성에 관계없이 테스트된 분자의 산도가 결과를 설명한다고 제안할 수 있습니다. 그러나 예비 실험에서 우리 는 그립 기술에 큰 영향을 미치지 않는 아세트산( 그림 A1 )을 테스트하여 분자의 산도(pH)가 테스트 조건에서 부착 능력을 방해하기에 충분하다는 생각을 방지했습니다. 또한 구연산, 포름산, 젖산 및 타르타르산은 몰 크기가 서로 다른 것으로 알려져 있습니다. 따라서 비교된 유기산의 양은 서로 매우 다릅니다. 그러나, 몰농도에서도 산간 진드기 낙하율에서 관찰되는 차이는 조정되지 않았다.
산으로 꿀벌을 국소적으로 치료한 후 바로아 암컷이 몰락하면서 몇 가지 가설이 생겨났습니다 . 첫째, 유기산은 진드기의 신경계를 방해하고 마비시켜 낙상을 유발할 수 있다[ 46 , 47 ]. 이전 연구 결과[ 36 ] 및 이와 관련된 생존 곡선( 그림 4 ) 에 따르면 젖산의 경우 가능성이 낮습니다 . 둘째, 독성 효과로 인해 추락할 수 있습니다[ 18 ]. V. 소멸자 수명을 감소시키기 때문에 타르타르산의 경우가 될 수 있습니다 . 그러나 젖산이나 구연산의 경우에는 그렇지 않은 것 같습니다. 셋째, 여성의 낙상은 유륜 아래의 산과 체액 사이의 상호 작용의 결과일 수 있으며 유륜 화상으로 인해 애착 능력이 손상될 수 있습니다[ 36 ] .
많은 거미류와 곤충은 유륜 아래에 발자국을 남깁니다. [ 48 , 49 , 50 , 51 ]. 그중 유체의 성질은 단백질과 폴리펩티드에서부터 다당류나 지질에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 진드기의 경우 유체의 성질은 고체 입자가 있는 이상성 오일-물 에멀젼인 것으로 보입니다[ 24 , 29 , 52 ]. 우리는 V. 소멸자 발자국 유체 의 특성을 모릅니다 . 그러나 우리는 가까운 계통발생으로 인해 익소디데스(Ixodides) 와 유사한 성질을 가지고 있다는 가설을 세울 수 있습니다 [ 29 ]. 따라서 친수성 기질(여기서는 나무)과 소수성 기질(우리의 경우에는 꿀벌의 큐티클) 사이의 그립 능력을 비교하는 것이 흥미롭습니다. 우리는 구연산의 경우 나무보다 꿀벌에서 진드기가 훨씬 더 많이 떨어지는 것을 발견했습니다(580mg/mL를 고려했을 때). 반면, 150 및 600mg/mL의 타르타르산은 목재에서는 상당한 감소를 유발했지만 꿀벌에서는 그렇지 않았습니다. 포름산을 고려하면 더욱 흥미롭습니다. 이 휘발성 산은 진드기의 세포 호흡을 조절하지 못해 사망에 이르게 하는 것으로 알려져 있습니다 [ 53 ]. 여기에서는 나무에 대한 손상된 그립 기술을 설명했지만 꿀벌에는 그렇지 않은 것으로 나타났습니다. 이는 벌집 치료에서 접착력이 문제가 되지 않음을 시사합니다. 각 산의 물리적, 화학적 특성은 진드기가 숙주에 부착하는 데 미치는 영향을 조사할 때 매우 중요합니다. 실제로 구연산과 젖산은 생물항유화제로 알려져 있으며[ 54 , 55 , 56 ], 타르타르산은 잘 알려진 유화제입니다 [ 57 , 58 ]. 따라서 산과의 상호작용으로 인해 유체가 불안정해져서 미끄럽거나 끈적거리게 되는 성질을 간과할 수 없다[ 59 , 60 ].
전체적으로, 우리는 젖산이 합리적인 농도(150mg/mL)에서 나무와 벌 모두에 대한 진드기 잡기 기술을 손상시키는 유일한 후보이며 처리 후 72시간 동안 벌을 죽이지 않고 V. 소멸자를 제거할 수 있음을 보여주었습니다( 그림 5 ). 실험 중 젖산 상태에 대해 V. 소멸자가 바닥에 분리되거나 등에 붙어 있거나 일일 검문소 사이에서 정상적으로 걸을 수 없는 것을 발견했습니다. 나중에 우리는 그들이 아마도 기아와 피로로 인해 죽은 것을 발견할 것입니다( 그림 4 ). 이것은 나무에 대한 부착 결핍을 보여주는 이전 실험과 일치했습니다. 그러나 간접적인 노출은 항상 어려운 일이다[ 61 , 62 ]. 진드기는 실제로 분자와 접촉하기 위해 벌 위에서 움직여야 했습니다. 몇 가지 가설이 그러한 접촉으로 이어질 수 있습니다. 첫째, 진드기는 벌의 손질 행동으로 인해 떨어져 나가 젖산과 접촉할 수 있습니다. 조건에 관계없이 우리는 꿀벌의 두 가지 손질 행동, 즉 자동 손질과 동종 손질을 관찰했습니다[ 63 ]. 둘째, 젖산은 진드기를 유인하거나 밀어내서 Varroa 암컷이 초기 먹이 위치에서 이동하도록 유도하여 산에 닿을 수 있습니다. 셋째, 진드기는 끌리거나 반발하지 않고 자연스럽게 이동할 수 있으며 꿀벌 등에 있는 젖산 코팅과 접촉하여 무작위로 들어갈 수 있습니다. 그러나 꿀벌에서 떨어진 V. 소멸자는 거의 없습니다. 이러한 모든 가설은 아롤리아가 접촉점인 곳에서 떨어진 진드기의 낮은 비율과 일치하는 것으로 보입니다.
5. 결론

결론적으로, 이 연구는 제어 전략으로서 V. destructor 에 대한 유기산의 작용 방식에 대한 새로운 관점을 제공합니다 . 타르타르산, 구연산, 포름산 및 젖산 중에서 우리는 실험실 조건에서 숙주 부착을 방해할 수 있는 잠재적 후보를 식별했습니다. 특히 현장에서 이미 사용 중인 젖산의 경우, 꿀벌의 등에 산을 적용하거나 V. 파괴자 암컷이 함침된 종이 위를 직접 걸을 때 동일한 손상된 그립 기술을 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 이는 적용 후 몇 주 후에 처리된 두드러기 바닥에 수집된 V. destructor가 독성이 아닌 낙상으로 사망했음을 나타낼 수 있습니다 [ 31 ]. 추가 조사는 꿀벌의 행동 수준과 젖산 투여 후 진드기의 낙상에 대한 영향을 더 깊이 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 우리는 진드기에 대한 산의 작용과 접촉이 꿀벌의 행동에 의존하는지 확인하기 위해 꿀벌 자동 및 동종 손질을 정량화할 수 있습니다. 마지막으로 기생충에 대한 부착 기술은 수명주기를 완료하는 데 중요하므로 진드기 제어 전략의 대체 목표를 나타냅니다[ 64 ]. 이 연구는 진드기를 높은 양의 산으로 죽이는 것이 아니라 적절하게 떨어뜨리는 것이 필요하기 때문에 벌통에서 유기산의 양을 줄였다는 증거를 뒷받침합니다. 우리의 결과는 전 세계 양봉가를 위한 벌집 내 적용을 위한 새로운 방법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 특허

이 기사의 결과는 특허의 일부일 수 있습니다.

https://www.mdpi.com/2076-3417/13/16/9085

[우성(旴成) 평택]

제가 목디스크가 와서 자료 올리기가 좀 불편합니다.
구글번역을 통해 수정하지 않고 직접 올립니다. 부족하더라도 문맥에 맞게 의역해서 읽어주시면 감사하겠습니다.

[최병삼(울산)]

감사합니다 ~